WO2003074630A1

WO2003074630A1 - Particule fine contenant un element des terres rares et sonde fluorescente contenant ladite particule

Info

Publication number: WO2003074630A1
Application number: PCT/JP2003/002480
Authority: WO
Inventors: Daisuke Matsuura; Hideshi Hattori
Original assignee: Dai Nippon Printing Co., Ltd.
Priority date: 2002-03-05
Filing date: 2003-03-04
Publication date: 2003-09-12
Also published as: GB2396359B; US7560284B2; GB2396359A; US20080292520A1; US20050014283A1; CN100357391C; GB0409480D0; JP4526004B2; CN1612922A; JP2004107612A

Description

明細書希土類元素含有微粒子およびそれを用いた蛍光プローブ [技術分野]

本発明は、赤色光や赤外光により励起されてアップコンバージョン発光する希土類元素含有微粒子およびその製造方法、ならびに、前記の希土類元素含有微粒子により標識された蛍光プローブに関するものである。本発明の希土類元素含有微粒子および蛍光プローブは、遺伝子診断分野、免疫診断分野、医薬開発分野、環境試験分野、バイオテクノロジー分野、蛍光検査などにおいて好適に用いることができるものである。

[背景技術]

従来より医学 ·生物学分野では、ウィルスや酵素の反応の研究あるいは臨床検査に、有機物分子からなる蛍光物質を標識として用い、紫外線照射したときに発する蛍光を光学顕微鏡あるいは光検出器で測定する方法がとられている。このような方法としては、例えば、抗原一抗体蛍光法などがよく知られている。この方法では、蛍光を発する有機蛍光体が結合した抗体が用いられる。抗原一抗体反応は、鍵穴一鍵の関係に例えられるように非常に選択性が高い。このため、蛍光強度分布から抗原の位置を知ることができる。

もう 1つの例としていわゆる D NAチップを用いた蛍光検査法がある。未知の D NAの塩基配列を決めることを目的として本検査法を用いる場合、その概略は次のようなものである。すなわち、既知の塩基配列を有する D N A (D N A断片）を多数基板上にスポット状に配列した、いわゆる D NAチップと、有機蛍光体でラベルされた被検查物である未知の塩基配列を有する D N Aを反応させることにより、被検査物の塩基配列を、 D N Aチップ上の蛍光スポットの位置や強度などを解析することにより決定する。

ところで、このように蛍光標識として有用な有機蛍光体には従来から問題点があった。すなわち、保存時や蛍光測定時の安定性に欠け、劣化を生じる恐れがある等の問題があった。

このような問題を解決したものとして、 C d S eナノ粒子を用いる方法が提案されている ("Semiconductor Nanocrystals as Fluorescent Biological Labels " Marcel Bruchez Jr, et al. , p2013- 2016， SCIENCE Vol. 281, 25 Septembe r 1998" ； "Quantum Dot Bioconjugates for Ultrasensitive Nonisotopic De tection" Warren C. W. Chan and Shuttling Nie, p2016- 2018， SCIENCE Vol. 2 81， 25 September 1998)。し力しながら、この方法は、励起光が青色光もしくは紫外光であることから、分析または検出対象が生細胞や生組織である場合等においては、分析または検出対象に対して損傷を与えてしまうといった問題があった。また、分析または検出対象が D N Aやたんぱく質などである場合においても、紫外光により分子に損傷が加えられる可能性があり、塩基配列の決定や活性サイトの決定などを精度良く行うに際しての妨げとなる場合があった。

また、励起光が長波長側で発光するものとしては、二光子励起を起こす S iナノ fe子力、案されてレヽる (ガ Second harmonic generation in microcrystallite films of ultra small Si nanoparticles" APPLIED PHYSICS LETTERS VOLUME 77， NUMBER 25 18 DECEMBER 2000") し力しながら、この方法は二光子吸収により発光するメカニズムであることから、発光効率が悪く、検出精度が低下するといった問題の他に、 1 n m以下の超微粒子とする必要があることから、加工が煩雑である等の問題があつた。

[発明の開示]

本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、励起光が紫外光等の被分析物に悪影響を及ぼすものでなく、かつ安定して発光し発光効率が良好である微粒子およびその製造方法、ならびに、前記の微粒子で標識された蛍光プローブを提供することを主目的とするものである。

上記目的を達成するために、本発明は、 5 0 0 n m〜2 0 0 0 n mの範囲内の波長の光により励起されてアップコンパージョン発光することを特徴とする希土類元素含有微粒子を提供する。本発明の希土類元素含有微粒子は、このようにァップコンパージョン発光する希土類元素を含有する微粒子であるので、これを例えば蛍光プローブとして用いた場合に、紫外光や青色光を励起光として用いる必要がないことから、被分析物である生体高分子に対して損傷を与えることがなく、また有機蛍光体のように保存時の安定性に欠けるといった問題もなく、さらには発光効率が高いといった利点を有するものである。

上記発明においては、上記希土類元素含有微粒子が、希土類元素を含有する核部と、その核部表面を修飾する機能性殻部からなり、上記機能性殻部は、特異的結合物質と結合することができる特異的結合物質結合部位を少なくとも有するものであることが好ましい。このような機能性殻部を有することにより、特異的結合物質との結合を容易に行うことが可能となるからである。

また、上記発明においては、上記特異的結合物質結合部位が、縮合反応性を有する部位、付加反応性を有する部位、置換反応性を有する部位、および特異的相互作用を有する部位のうちの少なくとも一つの部位であることが好ましい。このような部位であれば、特異的結合物質との結合をより確実に行うことができるからである。

本発明においては、上記希土類元素含有微粒子が、上記希土類元素含有微粒子の凝集を防止する凝集防止部位を有することが好ましい。例えば、体液等の高い塩濃度の液中等の場合であっても、凝集することなく用いることができるからである。

上記発明においては、上記凝集防止部位が、水素結合を有する部位及び水和能を有する部位の内の少なくとも一つの部位であることが好ましい。このような部位を有することにより希土類元素含有微粒子の凝集をより確実に防止することができるからである。

また、上記機能性殻部が、核部と結合する核部結合部位を有することが好ましい。このような核部結合部位を有することにより、核部と機能性殻部との結合が強固となり、機能性殻部が核部から剥離するといった不具合を防止することができるからである。

さらに、上記核部結合部位が、金属と結合する機能を有する部位、縮合反応性を有する部位、付加反応性を有する部位、および置換反応性を有する部位のうちの少なくとも一つの部位であることが好ましい。このような部位を有することにより、核部と機能性殻部との結合をより確実に行うことができるからである。上記発明においては、核部の平均粒子径が、 1 ηπ！〜 100 nmの範囲内であることが好ましい。特異的結合物質としてポリヌクレオチドゃ抗原もしくは抗体等を用いた場合は、上述した範囲内の平均粒子径であることが好ましいからである。

また、上記核部が、ハロゲン化物または酸化物を母材とし、上記アップコンパージョン発光可能な希土類元素が含有されてなるものであることが好ましい。ハロゲン化物を母材として用いた場合は、発光効率が良好であるという利点を有し、酸化物を母材として用いた場合は耐水性などの耐環境性が高いため安定した発光を得られるという利点を有するからである。

本発明においては、上記希土類元素が、エルビウム（E r) 、ホロミゥム（H o) 、プラセォジゥム (P r ) 、ツリウム (Tm) 、ネオジゥム (Nd) 、ガドリニゥム（Gd) 、ユウ口ピウム（Eu) 、イッテルビウム（Yb) 、サマリゥム（Sm) およびセリウム（C e) からなる群から選択される少なくとも 1っ以上の希土類元素であることが好ましい。アップコンバージョン発光が可能な希土類元素としては、これらのものが好ましいからである。

また、上記発明においては、上記希土類元素含有微粒子を、希土類元素が付活された平均粒子径 1~100 nmの酸化物によって形成することができる。前記酸化物は、酸化イットリウム、酸化ガドリニウム、酸化ルテチウム、酸化ランタン、および酸化スカンジウムからなる群より選択される少なくとも 1種の酸化物であることが好ましい。希土類元素を不活する酸化物としては、これらのものが好ましいからである。

蛍光体は、ほとんどの場合、粉末の形で用いられ、その平均粒子径は 3〜 1 2 μι 程度である。粒径を小さくしていくと、ある粒径（物質によって異なるが、 l〜2/ m程度）以下で発光効率が低下し始める。これは、結晶の表面層の発光効率が低いためと考えられている。

1 994年、粒径数^ ^〜数 nmの蛍光体粒子で高い発光効率が得られることが報しられ、注目された ("Optical Properties of Manganese-Doped Nanocrysta Is of ZnS" APPLIED PHYSICS LETTERS, VOLUME 72， NUMBER 317, JANUARY, 19 94 ) 。この現象は、励起子の閉じ込め効果によって説明された。

したがって、希土類元素含有微粒子の粒径を概ね 1 0 0 n m以下にすることにより、当該希土類元素含有微粒子によるアップコンパージョン発光の発光効率を更に高めることが期待できる。

粒径が概ね 1 0 0 n m以下の希土類元素含有微粒子は、当該希土類元素含有微粒子が発光していなければ目視によってその存在を確認することができないので、例えばホログラフィック素子の真贋を判定するためのマーカー等、蛍光検査のためのマーカーとして好適である。

本発明においては、上記の希土類元素としてエルビウムとィッテルビウムとを用いることができる。これら 2つの希土類元素それぞれの添加量を制御することによって、アップコンパージョンにより希土類元素含有微粒子から発せられる光の視認色を、緑色から赤色に亘る波長域内で制御することができる。

また、上記の希土類元素としてエルビウムを用いることができる。エルビウムによって酸化ィットリゥムを付活することにより、アップコンバージョンによつて緑色の蛍光を発する希土類元素含有微粒子を得ることができる。

さらに、上記の希土類元素としてッリゥムとイッテルビウムとを用いることができる。ッリゥムとィッテルビウムとを添加することにより、近赤外域の光に対する增感作用が得られることから、近赤外域の励起光により青色光を誘起することが可能になる。

上記発明においては、塩基性炭酸ィットリウム、塩基性炭酸ガドリユウム、塩基性炭酸ルテチウム、塩基性炭酸ランタン、および塩基性炭酸スカンジウムからなる群より選択される少なくとも 1種の塩基性炭酸塩に希土類元素を付活する第 1工程と、前記希土類元素が付活された塩基性炭酸塩を焼成する第 2工程と、を含むことを特徴とする希土類元素含有微粒子の製造方法によって製造することができる。

また、前記第 1工程で、前記希土類元素が付活された塩基性炭酸塩を液相反応により得ることが好ましい。液相反応によって前記の塩基性炭酸塩を得ることにより、粒径の小さな希土類元素含有微粒子を得やすくなる。

上記発明においては、前記第 1工程で、硝酸イットリウム、硝酸ガドリニウム、硝酸ルテチウム、硝酸ランタン、および硝酸スカンジウムからなる群より選択される少なくとも 1種の硝酸塩と、付活しょうとする希土類元素の硝酸塩と、炭酸ナトリゥムとを反応させることが好ましい。これらを液相中で反応させることよって、前記の塩基性炭酸塩を得ることが容易になる。

また、前記第 2工程で、前記希土類元素が付活された塩基性炭酸塩を急速加熱して焼成した後に急速冷却することが好ましい。急速加熱して焼成し、その後に急速冷却することにより、粒径の小さい希土類元素含有微粒子を得ることが容易になる。

上記発明においては、前記希土類元素を、得ようとする蛍光の波長に応じて選択することが好ましい。前述のように、希土類元素含有微粒子からのアップコンバージョン発光の波長は、酸化物に付活させる希土類元素の種類に応じて変化するので、当該希土類元素含有微粒子の用途に適した波長のアップコンバージョン発光を適宜得るようにした方が、実用上有利である。

本発明はまた、上記記載の希土類元素含有微粒子と、上記希土類元素含有微粒子と結合する特異的結合物質とを有することを特徴とする蛍光プロープを提供する。このような蛍光プローブは、上記希土類元素含有微粒子の利点、すなわち、紫外光や青色光を励起光として用いる必要がないことから、被分析物である生体高分子に対して損傷を与えることがなく、また有機蛍光体のように保存時の安定性に欠けるといった問題もなく、さらには発光効率が高いといった利点を有するものである。

本発明においては、上記特異的結合物質が、ポリヌクレオチド-、ホルモン、たんぱく質、抗原、抗体、ペプチド、細胞、および組織のいずれかであることが好ましい。本発明は励起光として生体高分子に損傷を与える可能性の少ない赤色もしくは赤外光を用いる点に特徴を有するものであり、上述した物質が特に励起光による損傷が問題となる可能性の高いものだからである。

[図面の簡単な説明]

図 1は、アップコンパージョン発光を説明するための説明図である。

図 2は、 2光子発光を説明するための説明図である。図 3は、抗原抗体反応における本発明の利用形態を説明するための概略図である。

図 4は、 Y₂0₃ : Yb, E r微粒子の半導体レーザー（980 nm) の光励起による発光スぺクトルを示すグラフである。

図 5は、 Y ₂ O ₃ ： E r微粒子の半導体レーザー（ 980 n m) の光励起による発光スぺクトルを示すグラフである。

図 6は、 Y₂0₃ : Yb, Tm微粒子の半導体レーザー（980 nm) の光励起による発光スぺクトルを示すグラフである。

図 7は、酸化ィットリゥムへのエルビウムの添加量を 1原子百分率（atom%) で固定し、イッテルビウムの添加量を Oatom%、 latom%_N 3atom%_s 5 atom% 、 20 atom%と変化させて得た希土類元素含有微粒子の半導体レーザー（980 nm) の光励起による発光のスぺクトルを示すグラフである。

る。 [発明を実施するための最良の形態]

以下、本発明の希土類元素含有微粒子およびこれを用いた蛍光プローブについて詳細に説明する。

A. 希土類元素含有微粒子

本発明の希土類元素含有微粒子は、 500 η π！〜 2000 nmの範囲内の波長の光により励起されてアップコンパージョン発光することを特徴とするものである。

まず、本発明に用いられるアップコンバージョン発光について、図 1を用いて説明する。図 1においては、希土類元素として、イッテルビウム（Yb) とェルビゥム（E r) の 2種類を用いた系であり、励起光として 1000 nmの赤外光を照射した例が示されている。まず、図 1 (a) に示すように、 l O O O nmの励起光によりィッテノレビゥム (Yb ³⁺) が励起されて² F_7/2準位からよりェネルギー準位の高い² F_5/2準位に移動する。そして、このエネルギーが、エネルギー移動 1により、エルビウム（E r 3+) のエネルギー準位を、 ⁴1_15/2準位から⁴ I _11/2準位に押し上げる。そして、図 1 (b) に示すように、同様に 100 O n mの励起光によりイッテルビウム (Y b ^{3 +}) が励起され、このエネルギーがエネルギー移動 2により、さらにエルビウム（E r 3 +) のエネルギー準位を ⁴ I _{1 ι κ} ₂準位から⁴ F _{1 1 / 2}準位に押し上げる。そして、図 1 ( c ) に示すように、上記励起されたエルビウム（E r 3 ⁺) が基底状態に戻る際に、 5 5 0 n mの光を発光する。

このように、 1 0 0 0 n mの光で励起されたものが、よりエネルギーの高い 5 5 0 n mの光を発するような場合、すなわち、波長からみて励起光より高いエネルギ一の光を発するような場合をアップコンバージョン発光というのである。なお、上記従来技術において説明した二光子励起を起こす S iナノ粒子は、図 2に示すように、二つの光子が同時に吸収された際にはじめて励起するものであり、上記アップコンバージョン発光とは原理的に異なるものである。また、この二光子励起は二つの光子が同時に存在する必要があることから発光効率が悪いのに対し、上記アップコンバージョン発光はそのような必要性がなく、二光子励起を起こす S iナノ粒子と比較すると極めて高い発光効率を有するものである。本発明は、このようなアップコンバージョン発光を生じる希土類元素を用いるものであるので、エネルギーの高い光、例えば紫外光等で励起する必要がない。すなわち、発光の際の光の波長は、分析または検出の容易さから通常は可視光であることが好ましい。したがって、アップコンバージョン発光の場合はこれより波長の長い光が励起光として用いられる。このため、生体高分子に対して損傷を与える可能性の高い紫外光や青色光は励起光としては用いられないのである。さらに励起光波長と発光波長が重なることがほとんど無いため、分析または検出を著しく容易にさせるのである。

このように、本発明の希土類元素含有微粒子は、アップコンバージョン発光が可能な希土類元素を用いたものであるので、励起光により被分析物が損傷されることがなく、正確な分析が可能となる。また、二光子励起と比較すると極めて発光効率が良好であり、かつ有機蛍光体を用いた場合と比較すると保存安定性等が良好なものであるため、安定でかつ精度の高い分析を可能とするものである。このようなアップコンパージョン発光が可能な希土類元素を含有する本発明の希土類元素含有微粒子は、例えば、上記アップコンバージョン可能な希土類元素を含有する核部と、特異的結合物質と結合し、また凝集を防止する機能等を有する機能性殻部とから構成することができる（以下、この希土類元素含有微粒子を「第 1希土類元素含有微粒子」という。）。また、希土類元素が付活された平均粒子径 1〜1 0 0 n mの酸化物によって構成することもできる（以下、この希土類元素含有微粒子を「第 2希土類元素含有微粒子」という。）。

以下、第 1希土類元素含有微粒子と第 2希土類元素含有微粒子とに分けて、本発明の希土類元素含有微粒子について説明する。

( I ) 第 1希土類元素含有微粒子

上記の第 1希土類元素含有微粒子全体の径としては、 1 n mから 5 0 0 n mの範囲内、特に 1 n n！〜 1 0 0 n mの範囲内であることが好ましい。また、このような第 1希土類元素含有微粒子の表面、すなわち機能性殻部には、官能基を有するものであることが好ましい。これにより、特異的結合物質との結合が容易に行うことができるからである。

このような本発明の第 1希土類元素含有微粒子について、核部と機能性殻部とに分けて説明する。

1 . 核部

本発明の第 1希土類元素含有微粒子の核部には、希土類元素が含有されている

。まず、このような希土類元素について説明し、次いで希土類元素を含有する核部について説明する。

( 1 ) 希土類元素

本発明に用いられる希土類元素は、上述したように所定の範囲内の波長の光により励起されてアップコンパージョン発光することが可能な希土類元素であれば特に限定されるものではない。

このような励起光の波長の範囲としては、励起光が生体高分子に損傷を与えないことが好ましいことから、少なくとも 5 0 0 n m〜2 0 0 0 n mの範囲内の波長である必要があり、中でも 7 0 0 n m〜2 0 0 0 n mの範囲内、特に 8 0 0 n m〜 1 6 0 0 n mの範囲内の波長であることが好ましい。

このような希土類元素としては、一般的には 3価のイオンとなる希土類元素を挙げることができ、中でもエルビウム ( E r ) 、ホロミゥム (H o ) 、プラセォジゥム（P r) 、ツリウム（Tm) 、ネオジゥム（Nd) 、ガドリニウム（G d ) 、ユウ口ピウム (E u) 、イッテルビウム（Yb) 、サマリウム（Sm) およびセリウム（C e) 等の希土類元素が好適に用いられる。

本発明においては、上述したようなアップコンバージョン発光が可能な希土類元素を、 1種類で用いても、 2種類以上同時に用いてもよい。なお、希土類元素を 1種類で用いる場合のアップコンバージョン発光のメカニズムとして、 E r ^{3 +} ドープの材料を例として挙げて説明すると、励起光として 970 または 1 5 00 nmの光を照射した場合、アップコンバージョン過程を経て、 E r ³⁺イオンのエネルギー準位に応じて、 410 nm (²H_9/2-⁴ I _15/2) 、 550 n m (⁴ S _3/2-⁴ I _15/2) 、 660 nm (⁴F_9/2-⁴ I _15/2) などの可視光発光を示すといった例を挙げることができる。

(2) 核部

上記希土類元素を含有する核部は、上記希土類元素をアップコンパージョン発光可能な状態で含有するものであれば、有機物、例えば錯体ゃデンドリマー等に希土類元素を含んだ状態で形成されたもの等であってもよく、特に限定されるものではない。しかしながら、通常、無機物の母材中に上記希土類元素が混入されて形成されたものであることが好ましい。上記希土類元素を発光可能な状態で含有させることが容易だからである。

このような無機物の母材としては、励起光に対して透明性を有する材料が、発光効率の観点から好ましく、具体的には中でもフッ化物、塩ィヒ物等のハロゲン化物、酸化物、硫化物等が好適に用いられる。

本発明においては、発光効率の観点からは、ハロゲン化物が好適に用いられる。このようなハロゲン化物としては、具体的には、塩化バリウム（B a C l ₂) 、塩化鉛（P b C 1₂) 、フッ化鉛（Pb F₂) 、フッ化力ドミニゥム（C d F₂ ) 、フッ化ランタン（L a F₃) 、フッ化イットリウム（YF₃) 等を挙げることができ、中でも塩ィ匕バリゥム（B a C 1₂) 、塩化鉛（P b C 1₂) およぴフッ化イットリウム（YF₃) が好ましい。

一方、水分等に安定な耐環境 1"生の高い母材としては、酸化物を挙げることができる。このような酸ィヒ物としては、具体的には、酸化イットリウム（Y₂0₃) 、酸化アルミニウム（Α 1 ₂ Ο ₃) 、酸化シリコン（S i〇₂) 、酸化タンタル（T a ₂ 0 ₅) 等を挙げることができ、中でも酸化イットリウム（Y ₂ 0 ₃) が好ましいなお、ハロゲン化物を微粒子の母材として用いた場合は、周囲に保護層を形成することが好ましい。すなわち、ハロゲン化物は一般的には水等に対して不安定であり、そのまま微粒子として用いると正確に分析ができない場合があり、このような場合は、ハロゲン化物を母材とする微粒子の周囲に耐水性等を有する被覆材が形成された複合核部にするとよい。この場合の被覆材としては、上述したような酸化物を好適に用いることができる。

母材への希土類元素の導入方法としては、ハロゲン化物の場合、例えば塩化バリウム（B a C l ₂ ) については、特開平 9 _ 2 0 8 9 4 7号公報もしくは文献 ( Efficient 1. 5mm to Visiり丄 e Upconversion in Er^u+ Doped Halide Phoshor s" Junichi Ohwaki, et al. , p. 1334-1337， JAPANESE JOURNAL OF APPLIED PH YSICS, Vol. 31 part 2 No. 3 A, IMarch 1994) に記載の方法を挙げることができる。また、酸化物については、特開平 7— 3 2 6 1号公報もしくは文献（"Green Upconversion Fluorescence in Er³⁺ Doped Ta₂0₅ Heated Gel Kazuo Koj ima e t al. , Vol. 67 (23) , 4 December 1995 ； "Relationship Between Optical Pro perties and Crystal linity of Nanometer Y₂0₃ : Eu Phoshor" APPLIED PHYSICS LETTERS, Vol. 76, No. 12, p. 1549-1551, 20 March 2000) に記載の方法を挙げることができる。

本発明においては、上記母材中における希土類元素の導入量としては、希土類元素の種類や母材の種類、および必要とされる発光の程度によって大幅に異なるものであり、種々の条件に応じて適宜決定されるものである。

また、核部の平均粒子径は 1 n m〜 1 0 0 n mが好ましく、より好ましくは 1 η π！〜 5 0 n mである。核部の平均粒子径が 1 n m未満の微粒子は合成が極めて困難であり好ましくない。また、核部の平均粒子径が 1 0 0 n mを超える微粒子は被標識物、すなわち特異的結合物質の反応を妨げたりしてデータの精度を低下させるので好ましくない。

さらに、アップコンパージョン発光する希土類元素はその組成により発光色が異なるので、これを利用して、特異性の異なる複数の特異的結合物質をそれぞれ発光色の異なる希土類元素含有微粒子で標識して同様の測定を行うことにより、異なる被測定物質の検出を同時に行うことができる。

2 . 機能性殻部

本発明の第 1希土類元素含有微粒子は、上記核部の周囲に形成された機能性殻部を有するものである。この機能性殻部には、体液などの高い塩濃度の液中で凝集しないことや試料液中で非特異的反応をしないことなどが要求される。

このような機能性殻部に要求される具体的な特性としては、まず、特異性物質との結合性を有する点を挙げることができる。すなわち、機能性殻部は、特異的結合物質と結合する部位である特異的結合物質結合部位を有するものであることが好ましく、そのような部位を有する材料で形成されていることが好ましい。このような特異的結合物質結合部位としては、殻部表面に物理的結合性または化学的結合性を付与させるものであれば特に限定されるものではない。具体的には、イオン解離能を有する部位、イオン配位能を有する部位、金属と結合する機能を有する部位、縮合反応性を有する部位、付加反応性を有する部位、置換反応性を有する部位、水素結合能を有する部位、特異的相互作用能を有する部位などを挙げることができ、中でも、縮合反応性を有する部位、付加反応性を有する部位、置換反応性を有する部位および特異的相互作用を有する部位のうちの少なくとも一つの部位であることが好ましい。

このような部位としては、具体的には、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基（一 C H O) 、ビエル基（C H ₂ = C H—）、アタリロイル基、メタクリロイル基、エポキシ基、ァセタール基（（C H ₃ C H ₂ 0 ) ₂ C H _) 、ィミド部位、ビォチン部位などを挙げることができる。

次に、機能性殻部に要求される特性としては、第 1希土類元素含有微粒子の凝集を防止する点を挙げることができる。したがって、機能性殻部には、上記第 1 希土類元素含有微粒子の凝集を防止する凝集防止部位を有することが好ましく、そのような部位を有する材料で形成されていることが好ましい。

上記凝集防止部位としては、水素結合を有する部位及び水和能を有する部位の内の少なくとも一つの部位であることが好ましい。このような部位として、具体的には、エチレンオキサイド部位（一 (CH₂CH₂O) _n—） (添字 nは 2以上 10， 000以下の整数）、水酸基（一 OH) 、アミド部位（一 CONH—）、リン酸エステル部位（一 PO (OR) _n (OH) ₃__n、（添字 nは 1、 2、または 3、 Rは炭素数 2以上の炭化水素含有基））、ベタイン部位などを挙げることができる。特に、ポリエチレングリコールに代表されるエチレンオキサイド部位 ( 一 (CH₂CH₂0) _n -) (添字 nは 2以上 10, 000以下の整数）やべタイン部位であることが好ましい。微粒子表面に安定な水和層を形成する機能に優れ、凝集や非特異吸着を防ぐ機能に優れているからである。

また、他の凝集を防ぐ機能を有する部位としては、静電的反発力を担うイオン解離部位、具体的には、カルボキシル基、スルホン酸基、アミノ基、イミノ基、ベタイン部位などが好ましく、特にこれらの基を有する重合物が好ましい。微粒子表面に安定な静電的反発層を形成する機能に優れているからである。

さらに、本発明においては、機能性殻部が、核部と結合する核部結合部位を有することが好ましく、よってそのような部位を有する材料で形成されていることが好ましい。このような部位としては、金属と結合する機能を有する部位、縮合反応性を有する部位、付加反応性を有する部位、および置換反応性を有する部位のうちの少なくとも一つの部位を挙げることができる。

具体的には、メトキシシリル基（_S i (OCH₃) _nY_n__x (添字 ηは 1、 2 、または 3、 Υはメチルまたはェチルを示す。 ) ) 、ェトキシシリル基 (-S i (OCH₂CH₃) _nY_n_! (添字 ηは 1、 2、または 3、 Υはメチルまたはェチルを示す。 ) ) 、プロポキシシリル基 (一 S i (OC₃H₇) _ηΥ_η__χ (添字 ηは 1、 2、または 3、 Υはメチルまたはェチルを示す。 ) ) 、クロロシリル基（一 S i C 1 _nY_n_! (添字 ηは 1、 2、または 3、 Υはメチルまたはェチルを示す。 ) ) 、ビエル基、アタリロイル基、メタクリロイル基などを挙げることができるまた、上記機能性殻部は、第 1希土類元素含有微粒子の非輻射や化学反応などによる発光効率の低下を防ぐ機能を有する材料で形成されていることが好ましく、第 1希土類元素含有微粒子の核部表面に強く配位ないし結合する材料が好ましい。中でも重合性を有することが好ましい。すなわち、イオン配位能を有する部位、金属と結合する機能を有する部位、縮合反応性を有する部位、付加重合性を有する部位、および置換反応性を有する部位などを持つ材料、具体的には、カルポキシル基、アミノ基、イミノ基、チオール基、シッフ塩基部位（—CH-N— ) 、メトキシシリル基（一 S i (OCH₃) _nY_n -！ (添字 ηは 1、 2、または 3 、 Υはメチルまたはェチルを示す。 ) ) 、エトキシシリル基 (—S i (OCH₂ CH₃) _nY_n_! (添字 ηは 1、 2、または 3、 Υはメチルまたはェチルを示す。 ) ) 、プロボキシシリル基（一 S i (OC₃H₇) _nY_n__x (添字 ηは 1、 2、または 3、 Υはメチルまたはェチルを示す））、クロロシリル基（一 S i C 1 _nY_n _! (添字 ηは 1、 2、または 3、 Υはメチルまたはェチルを示す。 ) ) 、ビュル基、アタリロイル基、メタタリロイル基などを有する材料が好ましい。

上述したように、機能性殻部には種々の機能が求められることから、このような機能性殻部を形成する材料としては、上述したような求められる機能を複合化して有する材料が好ましいといえる。具体的には、下記の化学式で示される材料を挙げることができる。

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3 . 第 1希土類元素含有微粒子の製造方法

上記第 1希土類元素含有微粒子の核部の製造方法としては、高周波プラズマ法を含むガス中蒸発法、スパッタリング法、ガラス結晶化法、化学析出法、逆ミセル法、ゾルーゲル法およびそれに類する方法、水熱合成法や共沈法を含む沈殿法またはスプレー法等を挙げることができる。

第 1希土類元素含有微粒子の核部表面に機能性殻部を形成する方法としては、機能性殻部を形成する材料の官能基と核部表面の官能基を縮合反応や付加反応などにより共有結合させる方法、核部の存在下で機能性殻部をゾル—ゲル法およびそれに類する方法により合成する方法、機能性殻部前駆体を核部に吸着させた後に重合させる方法などを好適に用いることができる。また、化学析出法、逆ミセル法、ゾルーゲル法およびそれに類する方法などで核部を合成する場合は、その際に用いる界面活性剤や保護剤を、そのまま殻部前駆体もしくは殻部として利用することが可能である。

(II) 第 2希土類元素含有微粒子

1 . 第 2希土類元素含有微粒子

第 2希土類元素含有微粒子は、酸化物を母材とし、当該酸化物に希土類元素を付活した平均粒子径 1〜1 0 0 n mの微粒子である。この第 2希土類元素含有微粒子は、上述した第 1希土類元素含有微粒子の核部の好ましい態様の 1つに相当するが、当該第 2希土類元素含有微粒子は、機能性殻部を必須の構成要件としていない点で、第 1希土類元素含有微粒子と異なる。

母材として用いる酸化物は、例えば、酸化イットリウム、酸化ガドリニウム、酸化ルテチウム、酸化ランタン、および酸化スカンジウムからなる群より選択することができ、その数は 1種であっても 2種以上の複数種であってもよい。

この母材に付活する希土類元素は、得ようとするアップコンバージョン発光の波長に応じて、 1種のみとすることもできるし、 2種以上の複数種とすることもできる。

例えば、エルビウムによって酸化ィットリゥムを付活すれば、波長 9 8 0 n m の光で励起したときに、アップコンバージョンによって緑色光を発する第 2希土類元素含有微粒子を得ることができる。

また、エルビウムとイッテルビウムとによって酸化イツトリゥムを付活すれば、波長 9 8 0 n mの光で励起したときに、アップコンバージョンによって緑色〜赤色の波長域内の所定色の光が視認される第 2希土類元素含有微粒子を得ることができる。例えば、エルビウムの添加量を l mol%とし、イッテルビウムの添カロ量を 2 O mol%とすれば、波長 9 8 0 n mの光で励起したときに赤色光が視^ ·される第 2希土類元素含有微粒子を得ることができる。

図 Ίは、酸化ィットリゥムへのエルビウムの添加量を 1原子百分率（atom%) で固定し、イッテルビウムの添加量を O atom%、 l atom%、 3 atom%、 5 atom% 、 2 0 atom%と変化させて得た第 2希土類元素含有微粒子からのアップコンバージョンによる蛍光のスぺクトルを示す。同図では、ィッテルビウムの添加量が O a tom%、 1 atom%、 3 atom%、 5 atom%、または 2 0 atom%ときの各スぺクトノレ力 S 、この順番で上から順にスペクトル（ i ) 〜（iv) として示されている。

同図から明らかなように、第 2希土類元素含有微粒子を励起したときに視認される光の色は、エルビゥムの添加量とイツテルビゥムの添加量との比に応じて、緑色から赤色の波長域内で変化する。

ツリウムとイッテルビウムとによつて酸化ィットリウムを付活すれば、波長 9 8 0 n mの光で励起したときに、イッテルビウムによる近赤外域の光に対する増感作用により、ッリゥムの青色の発光がより高い輝度で得られることができる。このときの酸化ィットリビゥムに対する希土類元素の添加量は、濃度消光が起こらない範囲内で適宜選択可能である。例えば、酸化ィットリウム、イッテルビウム、またはツリウムを添加する場合、当該エルビウム、イツテノレビゥム、およびッリゥムそれぞれの添加量は、 0〜5 O mol%の範囲内で選択可能である。

2 . 第 2希土類元素含有微粒子の製造方法

上述した第 2希土類元素含有微粒子は、例えば、所望の希土類元素が付活された塩基性炭酸塩を得、この塩基性炭酸塩を焼成し、その後、必要に応じて所定の粒径に調整することによって得ることができる。

上記の塩基性炭酸塩は、例えば、塩基性炭酸イットリウム、塩基性炭酸ガドリ二ゥム、塩基性炭酸ルテチウム、塩基性炭酸ランタン、および塩基性炭酸スカンジゥムからなる群より選択することができ、その数は 1種であっても 2種以上の複数種であってもよい。

この塩基性炭酸塩に付活させる希土類元素の種類は、上述のように、目的とする第 2希土類元素含有微粒子からアップコンバージョンによって発せさせようとする蛍光の波長に応じて適宜選択可能である。

平均粒子径が l〜1 0 0 n mである第 2希土類元素含有微粒子を得るうえからは、上記所望の希土類元素が付活された塩基性炭酸塩を、液相反応によって得ることが好ましい。当該塩基性炭酸塩は、例えば、希土類元素で付活しょうとする塩基性炭酸塩の構成元素である金属の硝酸塩と、付活しょうとする希土類元素の硝酸塩と、炭酸ナトリウムとを反応させることによって得ることができる。

所望の希土類元素が付活された塩基性炭酸塩を焼成するにあたっては急速加熱することが好ましく、その後、急速冷却することが好ましい。この急速加熱および急速冷却によって粒子の成長を防ぎ、平均粒子径を容易に 1 0 0 n m以下にすることができる。

ここで、本発明における急速加熱とは、 3 0 0 °C〜 1 7 0 0 °C、好ましくは 5 0 0 °C〜1 1 0 0 °Cに設定されたオーブンに少なくとも 1 0分以上、好ましくは 3 0分〜 1 8 0分の範囲内で投入することをいう。また急速冷却とは、上記ォーブンから取り出し、オーブン内の温度より 2 0 0 °C以上低い、好ましくは 5 0 0 °C〜 1 1 0 0 °C低い温度条件下におくことをいう。上述した各工程を経ることにより、前述した第 2希土類元素含有微粒子を得ることができる。

なお、上述した第 2希土類元素含有微粒子は、上記第 1希土類元素含有微粒子の核部として用いることも可能である。

B . 蛍光プローブ

本発明の蛍光プローブは、上述したような第 1または第 2希土類元素含有微粒子と、上記第 1または第 2希土類元素含有微粒子と結合する特異的結合物質とを有することを特徴とするものである。

1 . 特異的結合物質

本発明においては、上述したような第 1または第 2希土類元素含有微粒子で既知または未知の特異的結合物質を標識することにより様々な機能を有する蛍光プロープを作ることができる。例えば既知の抗体を標識して、被検査物中の抗原の位置を調べるための蛍光プローブを作ったり、未知の D N A (被検査物）を標識して、 D N Aチップを用いて該被検査物の塩基配列を決定するための蛍光プロ一プを作ることができる。

このような特異的結合物質としては、例えば、デォキシリポ核酸（D N A) 、リボ核酸（R NA) 、ペプチド核酸（P NA) などの合成核酸、ホルモン、たんばく質、ペプチド、細胞、組織、抗原、抗体、レセプター、ハプテン、酵素、核酸、薬剤、化学物質、ポリマー、病原体、毒素、アデニン誘導体、グァニン誘導体、シトシン誘導体、チミン誘導体、ゥラシル誘導体等を挙げることができる。本発明においては、中でもデォキシリボ核酸（D NA) 、リボ核酸（R NA) 、ペプチド核酸（P N A) などの合成核酸、ホルモン、たんぱく質、抗原、抗体、ペプチド、細胞を特異的結合物質として用いることが好ましい。本発明においては、上述したように励起光が生体高分子に対して損傷を与えないところに特 ί敷を有するものであり、上記 D N A、 R NA、合成核酸、ホルモン、たんぱく質、抗原、抗体、ペプチド、細胞は、励起光によるわずかな損傷が生じた場合でも、分析結果に大きな影響を及ぼす可能性があることから、本発明の利点を有効に活かすことができるからである。

2 . 希土類元素含有微粒子による特異的結合物質の標識本発明においては、上記特異的結合物質が上記第 1または第 2希土類元素含有微粒子と結合して標識されることにより、蛍光プローブとされる。

この希土類元素含有微粒子と特異的結合物質との結合は、特に限定されるものではなく、イオン結合、配位結合、水素結合などの物理的結合、化学的結合すなわち共有結合および特異的相互作用による結合が挙げられるが、分析精度を向上させる観点から上記希土類元素含有微粒子と特異的結合物質とが強く結合していることが好ましく、したがって共有結合または特異的相互作用により結合されていることが好ましい。

3 . 分析または検出方法

本発明の蛍光プローブを用いた分析または検出方法としては、例えば下記に示すような抗原抗体反応を利用した方法を挙げることができる。

すなわち、細胞や細胞内にある物質（抗原）に作用させた抗体は抗原抗体反応によつて抗原と固く結合するので、その結合部位を頼りに抗原の所在を探すことができる。しかしながら、一般に抗体分子そのものを顕微鏡下に観察することはできないので、抗原の検出に用いる抗体はあらかじめ観察可能なマーカーで標識しておく必要がある。例えば、図 3に示すように、抗原抗体反応は可逆的な結合反応である。その反応は極めて特異的であって、抗体は対応する抗原物質以外とは反応しない。図の上段は組織標本に抗体を作用させた時、抗原 Aのみと反応し、結合することを示す。しカゝし、この状態では抗体自体を染め出すことはできないので、抗原の所在は判らない。そこで下段のように抗体にあらかじめ可視的マ一力一を結合させておき、これを組織内の抗原と反応させると上段と同様の結合が起こるので、今度はマーカーによって抗原抗体反応の起こった場所が判り、したがって抗原の存在部位を知ることができる。標識抗体の性質で大切なことは、標識によつて抗原との結合性が失われないこと、他の物質との非特異的な親和性を生じないこと、マーカーの活性が十分保存されていることなどである。

このような蛍光抗体法（fluorescent antibody method (蛍光色素標識抗体法 f luorescent- labeled antibody method) ) は免疫組織化学的方法の一つであって、抗体のマーカーに蛍光色素を用い、蛍光顕微鏡下に励起された蛍光を観察することによつて抗原の所在を探る方法である。この方法は免疫組織化学的方法の中でもつとも早く確立されたもので、 1 9 4 0年代の初め C o o n sらが開発に着手し、 1 9 5 0年代にほぼ確立した方法である。その後、 R i g g sらによる標識法の改良や M c D v i t tらによる標識抗体の精製法が導入されて応用領域は拡がり、今日では免疫糸且織化学の代表的方法の一つとなっている。

本発明においては、上記マーカーとして希土類元素を含有する第 1または第 2 希土類元素含有微粒子を用い、抗体を特異的結合物質とすることにより、このような方法に応用することが可能となるのである。

このように、他の生体高分子と特異的に結合する特異的結合物質と上記希土類元素含有微粒子とを結合させて標識することにより、種々の分析 ·検出が可能となるのである。

このような特異的に結合する場合としては、例えば、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド) とそれに相補的な核酸との組み合わせ、上述したような抗原と抗体（又は抗体フラグメント）との組み合わせ、受容体とそのリガンド（例えば、ホルモン、サイトカイン、神経伝達物質、又はレクチン）との組み合わせ、酵素とそのリガンド（例えば、酵素の基質アナログ、補酵素、調節因子、又は阻害剤）との組み合わせ、酵素アナログとその酵素アナログの元となる酵素の基質との組み合わせ、又はレクチンと糖との組み合わせ等を挙げることができる。なお、「酵素アナログ」とは、元の酵素に対する基質との特異的な親和性は高いものの、触媒活性は示さないものを意味する。また、上記の各組み合わせにおける各化合物は、それぞれ、いずれか一方が「特異的結合物質」となり、他方が、分析または検出される物質となることができる。例えば、「抗原と抗体との組み合わせ」では、抗原が「分析または検出される物質」となる場合には、抗体が「特異的結合物質」となることができ、逆に、抗体が「分析または検出される物質」となる場合には、抗原が「特異的結合物質」となることができる例えば、本発明の蛍光プローブを、核酸ハイプリダイゼーシヨンアツセィに適用する場合には、上記特異的結合物質として、分析または検出される物質である核酸（例えば、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド）と相補的に結合することのできるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを用いることができる。ここで、「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」には、デォキシリポ核酸（DNA) 、リポ核酸（RNA) 、及びペプチド核酸（PNA) が含まれる。なお、 PNAとは、 DN Aのホスホジエステル結合をペプチド結合に変換した人工核酸である。上記不溶性粒子に結合されるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの鎖長は、分析目的に応じて適宜選択することができ、例えば、捕捉しようとする DNA、 RNA、又は PNAの相補的配列の鎖長に基づいて決定することができる。

上記特異的結合物質として用いるオリゴヌクレオチドの合成は、自動合成装置を用いて一般的に行なうことができる。また、通常の遺伝子工学的手法、例えば、 PCR (ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いて行なうことができる。

本発明の蛍光プローブを免疫学的アツセィに適用する場合には、上記特異的結合物質として、分析または検出される物質と特異的に結合する抗原（ハプテンを含む）又は抗体を用いることができる。この場合に、上記分析または検出される物質としては、被検試料中に一般的に含まれている成分で、しかも、免疫学的に検出することのできる物質あれば、特に制限されない。一例を挙げれば、各種タンパク質、多糖類、脂質、菌体、又は各種環境物質等を挙げることができる。より詳細には、免疫グロブリン（例えば、 I gG、 I gM、又は I gA) 、感染症関連マーカー（例えば、 HB s抗原、 HB s抗体、 ^11 ¥—1抗体、 H I V—2 抗体、《[丁ー1抗体、又はトレポネーマ抗体）、腫瘍関連抗原（例えば、 A FP、 CRP、又は CEA) 、凝固線溶マーカー（例えば、プラスミノーゲン、アンチトロンビン一111、 D—ダイマー、 TAT、又は PP I) 、抗てんかん薬（例えば、ホルモン）、各種薬剤（例えば、ジゴキシン）、菌体（例えば、 ο_ι

57又はサルモネラ）若しくはそれらの菌体内毒素若しくは菌体外毒素、微生物類、酵素類、残留農薬、又は環境ホルモン等を挙げることができる。上記特異的結合物質として用いる抗体としては、周知の方法で得られるポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれをも使用することができる。さらに、上記抗体は、タンパク質 [例えば、酵素（例えば、ペプシン又はパパイン） ] 処理したもの [例えば、抗体フラグメント（例えば、 F a b、 F a b，、 F (a b，） ₂、又は F v) ] を用いることもできる。このように、本発明の蛍光プローブは、種々の生体高分子の検出もしくは分析に用いることが可能であり、かつ励起光を照射した際に、上記検出もしくは分析される生体高分子に対して損傷を与えないといった利点を有するものである。なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。

[実施例]

以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明する。

1. 核部ないし第 2希土類元素含有微粒子の作製

アップコンバージョン発光することを特徴とする希土類元素を含有する核部の作製方法を示す。

1— 1. Y₂〇₃ : Yb， E r微粒子

液相反応にて Y bと E rをドープした前駆体を得、当該前駆体を焼成することにより Y₂0₃ : Yb， E r微粒子を作製した。以下に製造工程を示す。

まず硝酸イットリウム 0. 0158molと、硝酸イッテルビウム 0. 004mol と、硝酸エルビウム 0. 0002 molとを蒸留水に溶解させて 1 00 m 1とし、 Y 、 Yb、 E rイオン混合溶液を作製した。また、炭酸ナトリウム水溶液（0. 3m ol/ 1 ) 100m lを上記の Y、 Y b、 E rイオン混合溶液に添加し 2時間攪拌した。

次に遠心分離機を用い、 300 Orpmで 30分間の遠心分離を三回繰り返し行つた。その後、沈殿物を真空中 45 °Cで 5時間乾燥し、前駆体である Ybと E rを付活した塩基性炭酸ィットリゥムを得た。

この前駆体を電気炉に入れて急熱し、空気雰囲気中 900でで 30分保持した後、取り出して急冷した。このようにして、 Y₂0₃： Yb, E r微粒子を合成した。 S E Mおよび X R Dの測定結果より、平均粒子径は約 30 n mであることが確認された。

このようにして得られた Y₂0₃： Yb， E r微粒子の半導体レーザー（980 nm) の光励起による発光スぺクトルを図 4に示す。 E r ^{3 +}の緑色発光が 550 nm付近に観測され、 Yb^{3 +}の赤色発光が 650〜680 nmの波長域に観測される。

なお、図 4は、エルビウムの添加量が lmol%、イッテルビウムの添加量が 20 tnol%である Y₂0₃： Yb， E r微粒子の発光スぺクトルを示している。

1 -2. Y₂〇₃： E r微粒子

液相反応にて E rをドープした前駆体を得、当該前駆体を焼成することにより Y₂0₃： E r微粒子を作製した。以下に製造工程を示す。

まず硝酸イットリウム 0. ◦ 1 98molと、硝酸エルビウム 0. 0002molとを蒸留水に溶解させて 1 0 Om 1とし、 Y、 E rイオン混合溶液を作製した。また、炭酸ナトリウム水溶液（0. 3molZ l ) 1 0 Om 1を上記の Y、 E rイオン混合溶液に添加し 2時間攪拌した。

次に遠心分離機を用い、 300 Orpmで 30分間の遠心分離を三回繰り返し行つた。その後、沈殿物を真空中 45 °Cで 5時間乾燥し、前駆体である E rを付活した塩基性炭酸ィットリウムを得た。

この前駆体を電気炉に入れて急熱し、空気雰囲気中 900°Cで 30分保持した後、取り出して急冷した。このようにして、 Y₂0₃： E r微粒子を合成レた。 S E Mおょぴ X R Dの測定結果より、平均粒子径は約 30 n mであることが確認された。

このようにして得られた Y₂0₃： E r微粒子の半導体レーザー ( 980 n m) の光励起による発光スぺクトルを図 5に示す。 E r ³ +の緑色発光が 550 nm付近に観測される。

なお、図 5は、エルビウムの添加量が lmol%の Y₂0₃： E r微粒子の発光スぺクトルを示している。

1 -3. Y₂0₃ : Yb, Tm微粒子

液相反応にて Y bと Tmをドープした前駆体を得、当該前駆体を焼成することにより Y₂0₃ : Yb， Tm微粒子を作製した。以下に製造工程を示す。

まず硝酸イットリウム 0. 0158molと、硝酸イッテルビウム 0. 004mol と、硝酸ツリウム 0. 0002molとを蒸留水に溶解させて 1 0 Om 1とし、 Y、 Yb、 Tmイオン混合溶液を作製した。また、炭酸ナトリウム水溶液（0. 3mo 1/1 ) 100m lを上記の Y、 Y b、 Tmイオン混合溶液に添加し 2時間攪拌した。

次に遠心分離機を用い、 300 Orpmで 30分間の遠心分離を三回繰り返し行つた。その後、沈殿物を真空中 45 °Cで 5時間乾燥し、前駆体である Ybと Tmを付活した塩基性炭酸ィットリゥムを得た。

この前駆体を電気炉に入れて急熱し、空気雰囲気中 900°Cで 30分保持した後、取り出して急冷した。このようにして、 Y₂0₃ : Yb， Tm微粒子を合成した。 S EMおよび XRDの測定結果より、平均粒子径は約 30 nmであることが確認された。

このようにして得られた Y₂0₃： Yb, Tm微粒子の半導体レーザー（980 nm) の光励起による発光スペクトルを図 6に示す。 TM^{3 +}の青色発光が 480 nm付近に観測される。

なお、図 6は、ツリウムの添加量が lmol%、イッテルビウムの添加量が 2 Otn ol%である Y₂〇₃： Yb, T m微粒子の発光スぺクトルを示している。

2. 第 1希土類元素含有微粒子の作製

2- 1. Y₂0₃ : Yb， E r/APTS微粒子

上記 1— 1で合成した Y ₂ O ₃： Y b , E r微粒子 300 m gを高分子分散安定斉 IJ 30 m gを含む少量の乾燥トルエンで分散後、乾燥トルエンで希釈し全量を 1 0 gとした。この微粒子分散液に (3—ァミノプロピル）トリメトキシシラン ( APTS) 0. 5 gを、窒素雰囲気下で激しく攪拌しながら加え、室温で 1 5時間攪拌し続けた。

遠心分離により APT S処理微粒子を回収した後、トルエンに再分散、遠心分離、回収、トルエン：メタノール（1 ： 1) に再分散、遠心分離、回収、メタノ —ルに再分散、遠心分離、回収、メタノール：水（1 ： 1) に再分散、遠心分離、回収し、最後に水で再分散、遠心分離し Y₂0₃： Yb, E r/APTS複合微粒子を得た。

収量は 21 Omgであった。乾燥した複合微粒子は、水に再分散させることができた。また、この複合微粒子は、乾燥した状態や水に分散させた状態においても図 4と同様のスぺクト /レ形状のアップコンバージョン発光を示した。

2-2. Y ₂ O ₃： E r /PEG- Biotin微粒子

上記 1一 2で合成した Y₂0₃： E r微粒子 30 Omgを用い、 2—1ど同様にして Y ₂ O ₃： E r /A P T S複合微粒子を作製した。収量は 233mgであった。 Y₂0₃： E r/APTS複合微粒子 200 m gを！） H 8の水 5 gに再分散させた。

この分散液に、 ρ H 8の水 5 gに Biotin- PEG-NHS (上記化合物 16、 Shearwat er社製、カタ口グナンバー 0H2Z0F02) を 30 m g加えた溶液を混合し、 1時間攪拌した。その後、遠心分離により Biotin- PEG-NHS処理後の複合微粒子と上澄み液を分け、複合微粒子は水に再分散、遠心分離、回収作業を 3回繰り返した後に透析することによって精製し、目的の Y₂0₃： E r/PEG-Biotin複合微粒子を得たこの Y ₂ O ₃： E r ZPEG-Biotin複合微粒子分散液の全量は 33. 4 gであった。この一部を採取し乾燥前後の重量を測定することによって求めた Y₂0₃： E r ZPEG- Biotin複合微粒子の収量は 74 m gであった。また、この複合微粒子は、乾燥した状態や水に分散させた状態においても図 5と同様のスぺクトル形状のァップコンバージョン発光を示した。

2-3. Y₂0₃： E r Z (APT S含有層）微粒子

脱水酢酸イツトリゥム 20ミリモルと脱水酢酸エルビウム 0.4ミリモルの脱水ェタノール分散液を 3時間還流した後、室温に冷却した。さらに 0°Cに冷却し超音波を照射し激しく攪拌しながら、ここに水酸化テトラメチルァンモ-ゥムの脱水メタノール溶液を加え Y ₂ O ₃： E r微粒子を作製した。加えたテトラメチルァンモ-ゥムの量は、およそ 22ミリモルである。

この Y₂0₃： E r微粒子分散液にテトラエトキシシラン 0. 01ミリモルと A PTS 0. 01ミリモルを含む脱水トルエン溶液を加え、窒素雰囲気下でさらに 2時間反応させ Y₂0₃ ： E r/ (APTS含有層)複合微粒子を作製した。凝集物を除去した Y₂0₃： E r/ (APTS含有層）微粒子分散液に、遠心分離で微粒子を回収しエタノ一ルで再分散する工程を 2回施した。その結果得た微粒子分散液を攪拌子を入れた透析チユーブに流しこみ、マグネチックスターラーを用いて pH3. 8の水中にて攪拌することを、水を変えながら 3日間実施した。この Y₂0₃ ： E r/ (A PTS含有層）複合微粒子の水分散液に暗所にて半導体レーザ一（980 nm) を照射したところ、照射部分が緑色に発光することを確認した。透過型電子顕微鏡により測定した平均粒子径は、およそ 1 l nmであった。

2-4. L a F₃ : Yb, E r / (A P T S含有層）微粒子

ジ一 n—ォクタデシルジチォフォスフェート（DOSP) 1 20ミリモルと弗化ナトリウム 120ミリモルを 4リツトルのェタノール /水混合溶媒 (10 : 1 ) に加え 75 °Cに加熱した。ここに硝酸ランタン 40ミリモル、硝酸ィッテルビゥム 0. 1 2ミリモル、硝酸エルビゥム 0. 01ミリモルを含む水溶液 100ミリリットルを滴下しながら加え、 75 °Cで 2時間加熱しつづけた。室温に冷却後、遠心分離により粗 L a F₃ : Yb， E r / (DOS P含有層）微粒子を分け取り、水およびエタノールで各 5回洗浄した。その後、ジクロロメタンに再分散し、ここにェタノールを加え再沈したものを遠心分離により分け取る工程を 3度繰り返して L a F₃ : Yb， E rZ (DOS P含有層）微粒子を精製した。 24時間室温で真空乾燥した固形分は 6. 9グラムであった。 L a F₃ : Yb， E r / ( D O S P含有層）微粒子はジクロロメタンやトルエンには再分散可能であったがエタノールや水には再分散できなかった。 L a F₃ : Yb， E r/ (DOS P 含有層）微粒子を 5グラム使い、窒素雰囲^下で脱水トルエン 500ミリリットルに再分散した。ここにテトラエトキシシラン 0. 02ミリモノレと APT S 0. 02ミリモルを溶かした脱水トルエン 10ミリリツトルを加え 15時間反応させた。遠心分離後、エタノールで再分散を試み、 5時間静置後の上澄みをデカンテーションにより分け取った。この上澄み液を遠心分離し、エタノール/水 ( 1 ： 1) で再分散、遠心分離し pH 3. 5の水で再分散を試みた。ここでほとんど凝集物が見られなかったことから L a F₃： Yb, E r/ (APTS含有層）微粒子ができていることが確認できた。これを遠心分離し、 24時間室温で真空乾燥した。乾燥後の重量は 4. 1グラムであった。これに 980 nmの半導体レーザ一光を照射すると赤色に発光した。また SEM観察により平均粒子径はおよそ 3 2 nmであることがわかった。

Claims

請求の範囲

1 . 5 0 0 η π！〜 2 0 0 0 n mの範囲内の波長の光により励起されてアップコンバージョン発光することを特徴とする希土類元素含有微粒子。

2 . 前記希土類元素含有微粒子が、希土類元素を含有する核部と、その核部表面を修飾する機能性殻部からなり、前記機能性殻部は、特異的結合物質と結合することができる特異的結合物質結合部位を少なくとも有することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の希土類元素含有微粒子。

3 . 前記特異的結合物質結合部位が、縮合反応性を有する部位、付加反応性を有する部位、置換反応性を有する部位、および特異的相互作用を有する部位のうちの少なくとも一つの部位であることを特徴とする請求の範囲第 2項に記載の希土類元素含有微粒子。

4 . 前記希土類元素含有微粒子が、前記希土類元素含有微粒子の凝集を防止する凝集防止部位を有することを特徴とする請求の範囲第 2項または第 3項に記載の希土類元素含有微粒子。

5 . 前記凝集防止部位が、水素結合を有する部位及び水和能を有する部位の内の少なくとも一つの部位であることを特徴とする請求の範囲第 4項に記載の希土類元素含有微粒子。

6 . 前記機能性殻部が、核部と結合する核部結合部位を有することを特徴とする請求の範囲第 2項から第 5項までのいずれかに記載の希土類元素含有微粒子。

7 . 前記核部結合部位が、金属と結合する機能を有する部位、縮合反応性を有する部位、付加反応性を有する部位、および置換反応性を有する部位のうちの少なくとも一つの部位であることを特徴とする請求の範囲第 6項に記載の希土類元素含有微粒子。

8 . 核部の平均粒子径が、 1 n m〜l 0 0 n mの範囲内であることを特徴とする請求の範囲第 2項から第 7項までのいずれかに記載の希土類元素含有微粒子。

9 . 前記核部が、ハロゲン化物または酸化物を母材とし、前記アップコンバージョン発光可能な希土類元素が含有されてなるものであることを特徴とする請求の範囲第 2項から第 8項までのいずれかに記載の希土類元素含有微粒子。

10. 前記希土類元素が、エルビウム（E r) 、ホロミゥム（Ho) 、プラセォジゥム（P r) 、ツリウム（Tm) 、ネオジゥム（Nd) 、ガドリェゥム（G d) 、ユウ口ピウム（Eu) 、イッテルビウム（Yb) 、サマリウム（Sm) およびセリウム（C e) からなる群から選択される少なくとも 1つ以上の希土類元素であることを特徴とする請求の範囲第 1項から第 9項までのいずれかに記載の希土類元素含有微粒子。

1 1. 酸化物に希土類元素が付活された平均粒子径 1〜 100 nmの微粒子であって、前記酸化物が酸化イットリウム、酸化ガドリュウム、酸化ルテチウム、酸化ランタン、および酸化スカンジウムからなる群より選択される少なくとも 1 種であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の希土類元素含有微粒子。

12. 前記希土類元素がエルビウムとイッテルビウムである請求の範囲第 1 1 項に記載の希土類元素含有微粒子。

1 3. 前記希土類元素がエルビウムである請求の範囲第 1 1項に記載の希土類元素含有微粒子。

14. 前記希土類元素がッリゥムとイッテルビウムである請求の範囲第 1 1項に記載の希土類元素含有微粒子。

15. 塩基性炭酸イツトリウム、塩基性炭酸ガドリュウム、塩基性炭酸ルテチゥム、塩基性炭酸ランタン、および塩基性炭酸スカンジウムからなる群より選択される少なくとも 1種の塩基性炭酸塩に希土類元素を付活する第 1工程と、前記希土類元素が付活された塩基性炭酸塩を焼成する第 2工程と、

を含むことを特徴とする希土類元素含有微粒子の製造方法。

16. 前記第 1工程で、前記希土類元素が付活された塩基性炭酸塩を液相反応により得ることを特徴とする請求の範囲第 1 5項に記載の希土類元素含有微粒子の製造方法。

17. 前記第 1工程で、硝酸ィットリウム、硝酸ガドリ二ゥム、硝酸ルテチウム、硝酸ランタン、および硝酸スカンジウムからなる群より選択される少なくとも 1種の硝酸塩と、付活しょうとする希土類元素の硝酸塩と、炭酸ナトリウムとを反応させることを特徴とする請求の範囲第 1 5項または第 16項に記載の希土類元素含有微粒子の製造方法。

1 8 . 前記第 2工程で、前記希土類元素が付活された塩基性炭酸塩を急速加熱して焼成した後に急速冷却することを特徴とする請求の範囲第 1 5項から第 1 7 項までのいずれかに記載の希土類元素含有微粒子の製造方法。

1 9 . 前記希土類元素を、得ようとする蛍光の波長に応じて選択することを特徴とする請求の範囲第 1 5項から第 1 8項までのいずれかに記載の希土類元素含有微粒子の製造方法。

2 0 . 請求の範囲第 1項から請求の範囲第 1 4項までのいずれかに記載の希土類元素含有微,粒子と、前記希土類元素含有微粒子と結合する特異的結合物質とを有することを特徴とする蛍光プローブ。

2 1 . 前記特異的結合物質が、ポリヌクレオチド、ホルモン、たんぱく質、抗原、抗体、ペプチド、細胞、および組織のいずれかであることを特徴とする請求の範囲第 2 0項に記載の蛍光プローブ。