Búsqueda Imágenes Maps Play YouTube Noticias Gmail Drive Más »
Iniciar sesión
Usuarios de lectores de pantalla: deben hacer clic en este enlace para utilizar el modo de accesibilidad. Este modo tiene las mismas funciones esenciales pero funciona mejor con el lector.

Patentes

  1. Búsqueda avanzada de patentes
Número de publicaciónWO2003075648 A1
Tipo de publicaciónSolicitud
Número de solicitudPCT/ES2002/000116
Fecha de publicación18 Sep 2003
Fecha de presentación13 Mar 2002
Fecha de prioridad13 Mar 2002
Número de publicaciónPCT/2002/116, PCT/ES/2/000116, PCT/ES/2/00116, PCT/ES/2002/000116, PCT/ES/2002/00116, PCT/ES2/000116, PCT/ES2/00116, PCT/ES2000116, PCT/ES200116, PCT/ES2002/000116, PCT/ES2002/00116, PCT/ES2002000116, PCT/ES200200116, WO 03075648 A1, WO 03075648A1, WO 2003/075648 A1, WO 2003075648 A1, WO 2003075648A1, WO-A1-03075648, WO-A1-2003075648, WO03075648 A1, WO03075648A1, WO2003/075648A1, WO2003075648 A1, WO2003075648A1
InventoresPEREZ Maria José ESCRIBA, Valles Carlos Simon, Martinez Antonio Pellicer
SolicitanteFundacion Ivi Para El Estudio De La Reproduccion Humana (Fivier)
Exportar citaBiBTeX, EndNote, RefMan
Enlaces externos:  Patentscope, Espacenet
Method of producing cell lines
WO 2003075648 A1
Resumen
The invention relates to a method of producing a diploid zygote from a triploid zygote. The inventive method comprises the following steps: (i) providing a tripronucleate zygote, (ii) identifying the position of the three pronuclei in relation to the second polar body, and (iii) removing the pronuclei that are furthest from the second polar body in order to produce a diploid zygote. The diploid zygote can be grown in order to form a blastocyte. The embryonic parent cells can be grown from the blastocytes obtained from the recovered diploid heteroparental zygotes. The cells from the diploid zygote can also be induced in order to differentiate them into differentiated cells.
Reclamaciones  traducido del español  (El texto procesado por OCR puede contener errores)
Reivindicaciones claims
1. Un método de producción de un cigoto heteroparental diploide a partir de un cigoto triploide que comprende las etapas de: 1. A method of producing a diploid zygote heteroparental from a triploid zygote comprising the steps of:
(i) proporcionar un cigoto tripronucleado; (I) providing a tripronucleado zygote;
(ii) identificar la posición de los tres pronúcleos en relación con el segundo cuerpo polar; (Ii) identify the position of the three pronuclei in relation to the second polar body; y (iii) eliminar los pronúcleos extra más alejados del segundo cuerpo polar para producir un cigoto diploide. and (iii) removing extra furthest from the second polar body to produce a diploid zygote pronuclei.
2. Un método según la reivindicación 1 en el que el pronúcleo más alejado del segundo cuerpo polar se elimine mediante epronucleación usando micromanipulación. 2. A method according to claim 1 wherein the far pronucleus second polar body is removed by using micromanipulation epronucleación.
3. Un método según la reivindicación 2, en el que se usa una micropipeta para extraer el pronúcleo. 3. A method according to claim 2, in which a micropipette is used to extract the pronucleus.
4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende la etapa de tratar el cigoto triploide con citocalasina y colcemida durante hasta 10 minutos . 4. A method according to any preceding claim comprising the step of treating the zygote with cytochalasin triploid and colcemid for up to 10 minutes.
5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende adicionalmente la etapa (iv) de hacer crecer el cigoto diploide para producir un blastocito. 5. A method according to any of the preceding claims further comprising the step (iv) to grow the diploid zygote to produce a blastocyst.
6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el cigoto triploide es un cigoto humano o mamífero no humano. 6. A method according to any of the preceding claims wherein the zygote is a triploid human zygote or nonhuman mammal.
7. Un método de producción de una célula madre embrionaria que comprende la producción de un cigoto diploide a partir de un cigoto triploide mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 7. A method of producing an embryonic stem cell comprising a diploid zygote production from a triploid zygote by a method according to any of the preceding claims.
8. Un método de producción de una célula madre pluripotente según la reivindicación 7, que comprende el crecimiento del cigoto diploide para producir un blastocito. 8. A method of producing a pluripotent stem cell according to claim 7, comprising diploid zygote growth to produce a blastocyst.
9. Un método de producción de una célula madre embrionaria pluripotente según la reivindicación 8, que comprende el aislamiento de una o más células de la masa celular interna del blastocito, y el crecimiento de las células para producir las células madre pluripotentes. 9. A method of producing an embryonic stem cell pluripotent according to claim 8 comprising the isolation of one or more cells of the inner cell mass of the blastocyst, and the growth of cells to produce pluripotent stem cells.
10. Un método según la reivindicación 9, en el que las células madre embrionarias obtenidas mediante este método se hacen crecer en una capa de células de alimentación. 10. A method according to claim 9, wherein the embryonic stem cells obtained by this method are grown on a layer of feeder cells.
11. Un método según la reivindicación 10, en el que la capa de células de alimentación comprende los fibroblastos. 11. A method according to claim 10, wherein the cell layer comprises fibroblasts power.
12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que las células madre embrionarias obtenidas mediante este método se inducen para diferenciarse para producir células diferenciadas. 12. A method according to any one of claims 7 to 11, in which embryonic stem cells obtained by this method are induced to differentiate to produce differentiated cells.
13. Un método de producción de células progenitoras diferenciadas que comprende la obtención de un cigoto diploide producido mediante un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y de inducción de una o más células para que se diferencien para producir células progenitoras diferenciadas . 13. A method of producing differentiated progenitor cells comprising obtaining a diploid zygote produced by a method according to any one of claims 1 to 6, and induction of one or more cells to differentiate to produce differentiated progenitor cells.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el cigoto es una mórula o un blastocito y las células que se diferencian son células derivadas de la mórula o células de la masa celular interna. 14. A method according to claim 13, wherein the zygote is a morula or a blastocyst and differentiating cells are cells derived from the morula or cells of the inner cell mass.
15. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que las células se diferencian en células neurales, células cardiacas, células intestinales, células estomacales, células esofágicas, células retinales, células corneanas, cartílago, células óseas, células hematopoyéticas o células musculares. 15. A method according to any one of claims 12 to 14, wherein the cells differentiate into neural cells, cardiac cells, intestinal cells, stomach cells, esophageal cells, retinal cells, corneal cells, cartilage, bone cells, hematopoietic cells or muscle cells.
16. Una célula madre pluripotente, una célula progenitora diferenciada o una célula diferenciada obtenida mediante un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15. 16. A pluripotent stem cell, progenitor cell or a differentiated cell differentiated obtained by a method according to any one of claims 7 to 15.
17. Una célula según la reivindicación 16 para su uso para tratar enfermedades. 17. A cell according to claim 16 for use in treating diseases.
18. Un método de tratamiento que comprende la implantación de una o más células según la reivindicación 16 en un paciente o animal que sufre una enfermedad que ha de tratarse. 18. A method of treatment comprising implanting one or more cells according to claim 16 in a patient or animal suffering from a disease to be treated.
19. Una célula según la reivindicación 17 o un método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la enfermedad es una enfermedad degenerativa neural o una enfermedad hematopoyética. 19. A cell according to claim 17 or a method according to claim 18, wherein the disease is a degenerative neural disease or a hematopoietic disease.
20. El uso de una célula según la reivindicación 16 in vitro para estudiar la diferenciación celular. 20. Use of a cell according to claim 16 in vitro to study cell differentiation.
Descripción  traducido del español  (El texto procesado por OCR puede contener errores)

Métodos de producción de lineas celulares Methods of producing cell lines

Objeto de la invención OBJECT OF THE INVENTION

La presente solicitud se refiere a métodos de producción de cigotos diploides a partir de cigotos triploides y métodos de producción de células madres embrionarias y células diferenciadas, tejidos y órganos derivados de tales cigotos. The present application relates to methods of producing diploid zygotes from triploid zygotes and production methods embryonic stem cell and differentiated cells, tissues and organs derived from such zygotes.

Antecedentes de la invención BACKGROUND OF THE INVENTION

La mayoria de las células del interior del cuerpo de un animal se encuentran en un estado diferenciado, pudiendo replicarse durante un número limitado de ciclos. Most of the cells within the body of an animal found in a differentiated state, can replicate for a limited number of cycles. Por tanto, la renovación . Therefore, renewal. tisular y celular depende de algunas células capaces de proliferar mucho, denominadas genéricamente células madres adultas, a las que sin embargo se restringe que se desvien a otros linajes celulares. tissue and cellular depends on some cells able to proliferate much, generically known adult stem cells, which however is restricted to being diverted to other cell lineages. Además, las células madres derivadas de tejidos específicos en las etapas finales de desarrollo o en el adulto, tal como las células hematopoyéticas o las células madres neurales, tienen su pluripontecialidad restringida al linaje tisular para el que han surgido. In addition, specific tissues derived stem in the final stages of development or in the adult, such as hematopoietic cells or neural stem cells, have their lineage restricted to the tissue for which have emerged pluripontecialidad.

Hace varios años que se sabe que es posible obtener células madres pluripotentes a partir de los cigotos, al comienzo de su desarrollo. Several years ago it is known that it is possible to obtain pluripotent stem cells from zygotes at the beginning of its development. Las células se obtenían antes de que se diferenciaran en tipos tisulares definidos. Cells were obtained before defined differentiate into tissue types. Tales células madres también se conocen como células madres embrionarias . Such stem cells are also known as embryonic stem cells.

Se ha informado de la derivación con éxito de múltiples tipos celulares a partir de células ME de ratón incluyendo neuronas, glia, células madres neurales, células de los islotes, hepatocitos, osteoblastos y adipocitos (Wobus, 2001) . It is reported successful derivation of multiple cell types from mouse ES cells including neurons, glia, neural stem cells, islet cells, hepatocytes, osteoblasts, and adipocytes (Wobus, 2001). Las células madres embrionarias también pueden obtenerse a partir de blastocitos ovinos (Notarianni et al, 1991) , bovinos (Van Stekelenburg-Hamers et al., 1995), de primates no humanos y de humanos (Thomson et al., 1998). Embryonic stem cells can also be obtained from sheep blastocysts (Notarianni et al, 1991), cattle (Van Stekelenburg-Hamers et al., 1995) of non-human primates and humans (Thomson et al., 1998).

Tales células madres pueden usarse para modelos in vítro para la diferenciación y para su uso en transplantes y terapias celulares/genéticas. Such stem cells can be used for in vitro differentiation and for use in transplants and cell / gene therapy models. Más recientemente, se ha sugerido el uso de las células madres como una fuente de tejidos para tratar varias enfermedades. More recently, it has been suggested the use of stem cells as a source of tissue to treat various diseases. Las células madres pueden diferenciarse, por ejemplo dentro del tejido neural o implantarse directamente en un paciente o un animal, para tratar enfermedades degenerativas del sistema nervioso, tal como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson. Stem cells can be differentiated, for example within the neural tissue or directly implanted in a patient or an animal, to treat degenerative diseases of the nervous system such as Alzheimer's disease or Parkinson's disease.

Las células madres embrionarias se derivan tradicionalmente de los blastocitos, una etapa del desarrollo que se alcanza a partir de los cigotos. Embryonic stem cells are traditionally derived from blastocysts, a developmental stage is reached from zygotes. En la etapa de blastocito, el embrión sufre su primera diferenciación en la masa celular interna (MCI) y en el trofoectodermo. At the blastocyst stage, the embryo undergoes its first differentiation in the inner cell mass (ICM) and trophectoderm. El trofoectodermo es una monocapa de células que encierra una cavidad llena de liquido, el bastocele. The trophectoderm is a monolayer of cells that encloses a cavity filled with liquid, the bastocele. Dentro de esta cavidad hay un grupo compacto de células, la MCI. Within this cavity there is a compact group of cells, the MCI. El cultivo adecuado in vitro de estas células de la MCI en una capa de alimentación de fibroblastos de ratón inactivados da lugar a las células madres embrionarias. Proper in vitro culture of these cells in a layer MCI power inactivated mouse fibroblast cells results in embryonic stem.

Han sido solicitadas patentes de métodos para obtener células madres embrionarias a partir de embriones normales no humanos (WO 01/29206), embriones ginogenéticos (WO 01/30978) o somáticos (WO 99/55841) . They have been applied for patents for methods to obtain embryonic stem cells from normal human embryos (WO 01/29206), gynogenetics embryos (WO 01/30978) or somatic (WO 99/55841). Recientemente, la Patente de los EE. Recently, US Pat. UU. UU. No. 5.843.780, emitida a James A Thomson el 1 de diciembre de 1998, pretende describir la obtención de células madre embrionarias de primates a partir de blastocitos humanos. No. 5,843,780, to James A Thomson issued on December 1, 1998, it purports to describe the production of primate embryonic stem cells from human blastocysts.

Con respecto a los humanos, el futuro de las aplicaciones médicas de las células ME es de enorme importancia, aunque siguen siendo controvertidas debido a la fuente del material usado para generar las lineas. With respect to humans, the future of medical applications of ES cells is of great importance, but remain controversial due to the source material used to generate the lines. Uno de los problemas que se está haciendo cada vez más común es la obtención de permiso de las autoridades para producir embriones para su uso en la producción de células madres . One problem that is becoming increasingly common is obtaining permission from the authorities to produce embryos for use in stem cell production.

La fertilización in vitro (FIV) a veces da lugar a cigotos tripronucleados que no son viables. In vitro fertilization (IVF) sometimes leads to tripronucleados zygotes that are not viable. Por lo general simplemente se desechan. Usually simply they discarded. Los inventores han identificado ahora una forma de manipular los cigotos tripronucleados, que normalmente se tiran, para restablecer el estado normal heteroparental diploide en tales cigotos, a partir de cuales pueden producirse células ME o lineas celulares diferenciadas. The inventors have now identified a way of manipulating tripronucleados zygotes that are normally thrown away, to restore normal diploid state heteroparental such zygotes, from which ES cells or differentiated cell lines may occur.

Se ha demostrado que la alteración de la ploidia y de la constitución parental de los cigotos es eficaz y valiosa para los estudios embriológicos en varias especies de mamíferos (Modlinski, 1975; Hope e Illmensee, 1977; MacGrath y Solter, 1983; Surani et al., 1986; Escriba y Garcia-Ximénez, 2001); It has been shown that altered ploidy and parental constitution of zygotes is effective and valuable for embryological studies in several mammalian species (Modliński, 1975; Hope and Illmensee, 1977; McGrath and Solter, 1983; Surani et al ., 1986; Type and Garcia-Ximenez, 2001); sin embargo, la investigación en embriones humanos es muy limitada debido a las restricciones éticas y legales. however, research on human embryos is very limited because of the ethical and legal restrictions. Los esfuerzos iniciales en los humanos se centraron en la diploidización microquirúrgica del embrión (Rawlins et al., 1988; Gordon et al., 1989; Malter y Cohén, 1989; Palermo et al., 1994) y en la haploidización (Ivakhnenko et al., 2000) mediante la eliminación pronuclear a partir de cigotos tripronucleados (3-PN) . Initial efforts in humans have focused on microsurgical diploidization embryo (Rawlins et al., 1988; Gordon et al., 1989; Malter and Cohen, 1989;. Palermo et al, 1994) and haploidisation (Ivakhnenko et al ., 2000) by pronuclear zygotes tripronucleados from (3-PN) elimination.

La dispermia es la anomalía más común en la fertilización de los humanos (Kola y Trounson, 1989) y por tanto, la diploidización podría haberse consolidado como una terapia reproductora potencial. The dispermy is the most common abnormalities in human fertilization (Kola and Trounson, 1989) and therefore the consolidated diploidization could have a potential reproductive therapy. No obstante, los dos principales obstáculos son el limitado desarrollo embrionario in vitro y la incertidumbre sobre la combinación parental final en los cigotos diploidizados (Gordon et al., 1989; Rawlins et al., 1988; Malter y Cohén, 1989; Palermo et al., 1994; Ivankhnenko et al., 2000). However, the two main obstacles are the limited embryonic development in vitro and uncertainty about the parental combination in diploidizados zygotes (Gordon et al., 1989; Rawlins et al., 1988; Malter and Cohen, 1989; Palermo et al ., 1994; Ivankhnenko et al, 2000).. Estas limitaciones también surgen cuando el objetivo es la haploidización quirúrgica (Ivankhnenko et al., 2000) . These limitations also arise when the objective is surgical haploidisation (Ivankhnenko et al., 2000).

El objeto de tales procedimientos microquirúrgicos es la elección de los pronúcleos que hay que eliminar. The object of such microsurgical procedures is the choice of the pronuclei to be removed. Morfológicamente, el pronúcleo paterno podría identificarse por la presencia cercana de restos de esperma y por un aumento en el diámetro pronuclear (Rawlins et al., 1988; Tesarik y Kopecny, 1989; Wiker et al., 1990; Goud et al., 1999). Morphologically, the paternal pronucleus may be identified by the nearby presence of traces of sperm and an increase in the pronuclear diameter (Rawlins et al., 1988; Tesarik and Kopečný, 1989; Wiker et al., 1990. Goud et al, 1999 ). Sin embargo, cuando se evalúa la fertilización (20-22 horas tras la inseminación) los pronúcleos humanos se hacen visibles, aunque normalmente son de tamaño similar y se aglutinan en el centro del ooplasma. However, when fertilization is evaluated (20-22 hours after insemination) human pronuclei become visible, though typically they are of similar size and coalesce at the center of ooplasm. Además, los restos de esperma no son identificables al microscopio óptico (Gordon et al., 1989; Malter y Cohén, 1989; Wiker et al., 1990; Palermo et al., 1994) . In addition, sperm debris unidentifiable optical microscope (Gordon et al., 1989; Malter and Cohen, 1989; Wiker et al., 1990; Palermo et al., 1994).

Por otra parte, se ha propuesto que el pronúcleo materno corresponde al localizado más cerca del segundo cuerpo polar (2CP) (Malter y Cohén, 1989; Wiker et al., 1990; Palermo et al., 1994; Tang et al., 1994). Moreover, it has been proposed that maternal pronucleus corresponds to located closer to the second polar body (PB2) (Malter and Cohen, 1989; Wiker et al., 1990; Palermo et al., 1994;. Tang et al, 1994 ). Aunque no hay informes concluyentes en humanos, varios acontecimientos biológicos sugieren esta afirmación puesto que en los mamíferos, la presencia de 2CP indica morfológicamente que la meiosis vuelve a tener lugar y finaliza con éxito, con la formación de un pronúcleo materno haploide (Kaufman, 1978; Mittwoch, 1978; Niemierko y Opas, 1978; Markert, 1982) . Although no conclusive reports in humans, several biological events suggest this statement since in mammals, the presence of 2CP morphologically indicates meiosis take place again and ends successfully, with the formation of a maternal pronucleus haploid (Kaufman, 1978 ; Freitag, 1978; Opas Niemierko and 1978; Markert, 1982).

Los cigotos tripronucleados humanos obtenidos tras la fertilización in vitro (FIV) constituyen el 4% de los huevos inseminados (Kola y Trounson, 1989) . Tripronucleados human zygotes obtained after in vitro fertilization (IVF) constitute 4% of inseminated eggs (Kola and Trounson, 1989). Se ha demostrado que el juego extracromosómico es de origen paterno en el 86% de los casos (Kola y Trounson, 1989), y puede resultar de la fertilización de los oocitos normales (haploides) por los espermatozoides diploides (no reducidos) , o de la fertilización dispérmica (Plachot y Crozet, 1992) . It has been shown that the extrachromosomal game is of paternal origin in 86% of cases (Kola and Trounson, 1989), and may result fertilization normal oocytes (haploid) by diploid spermatozoa (unreduced), or the dispérmica fertilization (Plachot and Crozet, 1992). Por tanto, la identificación y la eliminación de uno de los pronúcleos paternos restaurará el estado diploide heteroparental de la fertilización normal. Therefore, the identification and elimination of one of the parental diploid pronuclei heteroparental restore the state of normal fertilization.

Los inventores han encontrado que mediante la eliminación de los pronúcleos más apartados del segundo cuerpo polar, es posible restaurar el estado diploide normal en el cigoto tripronucleado previo. The inventors have found that by removing sections of pronuclei more second polar body, it is possible to restore normal diploid zygote in the prior tripronucleado. Los cigotos restaurados progresan normalmente en su desarrollo in vitro hasta la etapa de blastocito, que puede seguir creciendo para producir células madres pluripotenciales y células diferenciadas. Restored zygotes normally progress in their development in vitro to the blastocyst stage, which can continue to grow to produce pluripotent stem cells and differentiated cells.

De acuerdo con esto, el primer aspecto de la invención proporciona un método de producción de un cigoto heteroparental diploide a partir de un cigoto triploide que comprende las etapas de: Accordingly, the first aspect of the invention provides a method of producing a diploid zygote heteroparental from a triploid zygote comprising the steps of:

(i) proporcionar un cigoto tripronucleado; (I) providing a tripronucleado zygote;

(ii) identificar la posición de los tres pronúcleos en relación con el segundo cuerpo polar; (Ii) identify the position of the three pronuclei in relation to the second polar body; y Y

(iii) eliminar los pronúcleos extra más alejados del segundo cuerpo polar para restaurar el cigoto diploide normal. (Iii) eliminate extra farthest pronuclei of the second polar body to restore normal diploid zygote.

Tal cigoto tripronucleado se habrá producido normalmente como resultado de la fertilización in vitro y normalmente no se considerarla viable. Such tripronucleado zygote will normally produced as a result of in vitro fertilization and usually not considered feasible.

El procedimiento de restauración del estado heteroparental diploide se realiza preferiblemente en cigotos tripronucleados que surgen de la fertilización in vitro, pero también puede aplicarse a los cigotos tripronucleados procedentes de la inyección intracitoplásmica de esperma. The restoration procedure heteroparental diploid state is preferably performed in zygotes tripronucleados arising from in vitro fertilization, but can also be applied to tripronucleados zygotes from the intracytoplasmic sperm injection.

Preferiblemente, el pronúcleo se elimina por medios físicos, tales como la epronucleación usando micromanipulación. Preferably, the pronucleus is removed by physical means, such as epronucleación using micromanipulation. En tales técnicas de micromanipulación es preferible usar una micropipeta para eliminar el pronúcleo. In such micromanipulation techniques using a micropipette is preferable to remove the pronucleus.

Tradicionalmente, los cigotos se tratan con compuestos químicos para inducir la despolimerización tanto de los filamentos de actina como de los de tubulina para mejorar las tasas de supervivencia. Traditionally, zygotes are treated with chemicals to induce both depolymerization of actin filaments and of tubulin to improve survival rates. Pueden usarse relajantes citoesqueléticos, tales como la citocalasina y la colcemida. cytoskeletal relaxants can be used, such as cytochalasin and colcemid. Sin embargo, se ha observado que son citotóxicos. However, it has been observed that are cytotoxic. Los inventores han encontrado que la exposición limitante a tales compuestos, especialmente a la citocalasina de tipo B ya la demecolcina, puede mejorar las tasas de supervivencia, reduciendo los efectos citotóxicos. The inventors have found that limiting exposure to such compounds, especially cytochalasin B and type demecolcine, can improve survival rates, reducing cytotoxic effects. Preferiblemente, la concentración de citocalasina usada es de 5-10 μg/ml, especialmente de 7,5 μg/ml. Preferably, the concentration of cytochalasin used is 5-10 mg / ml, especially 7.5 .mu.g / ml. La concentración de demecolcina puede estar entre 0,05 y 0,15 M, especialmente 0,1 M. Preferiblemente, el tiempo de exposición de los embriones a los compuestos es de 10 minutos o menos, especialmente menos de 8 minutos, 6 minutos, preferiblemente 5 minutos o menos. Demecolcine concentration may be between 0.05 and 0.15 M, preferably 0.1 M. Preferably, the exposure time of embryos to the compounds is 10 minutes or less, especially less than 8 minutes, 6 minutes, preferably 5 minutes or less.

El cigoto usado puede ser humano o no humano, tal como los cigotos de ratón, rata, porcinos, bovinos, ovinos o de primates no humanos. The zygote used may be human or non-human zygotes as mouse, rat, swine, cattle, sheep or non-human primates.

La invención también proporciona un método para hacer crecer embriones restaurados para producir un blastocito. The invention also provides a method for growing embryos restored to produce a blastocyst. Los embriones se cultivan in vitro, preferiblemente en una monocapa de alimentación de las células epiteliales del endometrio o medios secuenciales definidos . The embryos are cultured in vitro, preferably in a monolayer supply of epithelial cells of the endometrium or defined sequential media. Más preferiblemente, el cigoto se hace crecer durante menos de 14 dias, menos de 12 dias, menos de 10 dias, menos de 8 dias, menos de 6 dias, especialmente menos de 5 dias tras la fertilización del cigoto original tripronucleado. More preferably, the zygote is grown for less than 14 days, less than 12 days, less than 10 days, less than 8 days, less than 6 days, especially less than 5 days after fertilization zygote original tripronucleado.

Preferiblemente, el blastocito comprende una masa celular interna y una capa de células trofoectodérmicas . Preferably, the blastocyst comprises an inner cell mass and a layer of trofoectodérmicas cells.

Durante el desarrollo de un cigoto, el cigoto se divide para alcanzar la etapa de 8 células, que se divide para dar lugar a la etapa de 32 células conocida como mórula. During development of a zygote, the zygote divides to reach the 8-cell stage, which is divided to give rise to the stage of 32 cells called morula. Ésta sufre entonces la cavitación para formar un blastocito que comprende una masa celular interna y un área de trofoblastos o células trofoectodérmicas que rodean a la masa celular interna y que rodean una cavidad conocida como blastocele. This then undergoes cavitation to form a blastocyst comprising an inner cell mass and area or trofoectodérmicas trophoblast cells surrounding the inner cell mass and surrounding a cavity known as blastocele.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un método de aislamiento de la MCI para producir células madres embrionarias que comprende la producción de un cigoto a partir de un cigoto tripronucleado mediante un método de acuerdo con la invención. A further aspect of the invention provides a method of isolating the MCI to produce embryonic stem cells comprising the production of a zygote from a zygote tripronucleado by a method according to the invention.

Preferiblemente, las células madres pluripotentes se obtienen haciendo crecer el cigoto diploide para producir un blastocito. Preferably, the pluripotent stem cells are obtained by growing the diploid zygote to produce a blastocyst. La masa celular interna de las células puede crecer entonces para dar lugar, por ejemplo, a células de alimentación tales como los fibroblastos. The inner cell mass can grow the cells to result then, for example, feeder cells such as fibroblasts.

Preferiblemente, se induce entonces la diferenciación de las células madres pluripotentes hasta células progenituras o células completamente diferenciadas. Preferably then it induces differentiation of pluripotent stem cells to progenitor cells or fully differentiated cells. La inducción de las células madres pluripotentes en tipos celulares diferenciados se revisa, por ejemplo, en Pedersen, J., Reprod. Induction of pluripotent stem cells in differentiated cell types is reviewed, for example, Pedersen, J., Reprod. Fértil . Fertile. Dev. , Vol. 6 (1994), páginas 543-552. Dev., Vol. 6 (1994), pages 543-552. También se incluyen en esta invención los métodos para producir células progenituras diferenciadas o células completamente diferenciadas que comprenden el uso del método de obtención de un cigoto diploide, de acuerdo con la invención, induciendo a una o más células a diferenciarse en células progenituras o células diferenciadas. Also it included in this invention methods of producing differentiated progenitor cells or fully differentiated cells comprising use of the method for obtaining a diploid zygote, according to the invention, inducing one or more cells to differentiate into progenitor cells or differentiated cells .

Las células pueden obtenerse directamente de las células derivadas de la mórula o de las células de la masa celular interna a partir de un blastocito. Cells can be obtained directly from cells derived from the morula or cells the inner cell mass of a blastocyst from. Esta técnica se muestra, por ejemplo, en el documento WO 01/29206. This technique is shown, for example, in WO 01/29206 the.

Los métodos de la invención pueden usarse para producir células que se diferencian en células neurales, células cardiacas, células intestinales, células estomacales, células esofágicas, células retinales, células corneales, cartílago, células óseas, células hematopoyéticas o células musculares. The methods of the invention can be used to produce cells that differentiate into neural cells, cardiac cells, intestinal cells, stomach cells, esophageal cells, retinal cells, corneal cells, cartilage, bone cells, hematopoietic cells or muscle cells. También se proporcionan las células madres pluripotentes, las células progenitoras diferenciadas o las células diferenciadas obtenidas mediante los métodos de la invención. pluripotent stem cells, progenitor cells or differentiated differentiated cells obtained by the methods of the invention are also provided. Tales células pueden ser útiles para el tratamiento de la enfermedad. Such cells may be useful for the treatment of disease. También se incluye dentro del alcance de la invención un método de terapia que comprende la implantación de una o más células en un paciente o animal que sufre una enfermedad que ha de tratarse. Also it included within the scope of the invention a method of therapy comprising the implantation of one or more cells in a patient or animal suffering from a disease to be treated.

La enfermedad puede ser degenerativa neural, tal como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson. The disease can be degenerative neural, such as Alzheimer's disease or Parkinson's disease. En este caso, la célula usada puede ser una célula neural o una célula capaz de diferenciarse en una célula neural. In this case, the used cell may be a neural cell or a cell capable of differentiating into a neural cell. La enfermedad también puede ser una enfermedad hematopoyética. The disease can also be a hematopoietic disease. Por ejemplo, el uso de la quimioterapia para tratar la leucemia a menudo da como resultado la muerte de las células de la médula ósea, incluyendo estás células madres a partir de las que se producen los glóbulos rojos y blanco. For example, the use of chemotherapy to treat leukemia often results in the death of cells of the bone marrow, stem cells are including from which red and white blood cells are produced. Las células de la invención pueden usarse para reemplazar las células de la médula espinal para posibilitar que un paciente produzca nuevos glóbulos rojos y blancos. Cells of the invention can be used to replace cells of the spinal cord to enable a patient make new red and white blood cells. Las células de la invención también pueden usarse in vitro para estudiar la diferenciación celular. Cells of the invention can also be used in vitro to study cell differentiation.

La invención se describirá ahora únicamente a modo de ejemplo. The invention will now be described by way of example.

1. Micromanipulación de cigotos tripronucleares 1. micromanipulation of zygotes tripronucleares

MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALS AND METHODS

Los cigotos humanos tripronucleares a partir de la FIV convencional se obtuvieron el Dia 1 (recuperación del oocito: Dia 0) para la micromanipulación o el cultivo a partir de parejas que se someten al tratamiento contra la infertilidad en el programa de FIV tras firmar su consentimiento informado. Human zygotes tripronucleares from conventional IVF Day 1 (oocyte retrieval: Day 0) were obtained for micromanipulation or culture from couples undergoing treatment for infertility in IVF program after signing consent informed. El uso de cigotos humanos anormalmente fertilizados para la investigación se aprobó por la junta de revisión institucional sobre el uso de sujetos humanos en investigación en el Instituto Valenciano de Infertilidad (IVI) , y cumple con la Ley Española de Tecnologías de Reproducción Asistida (35/88). The use of abnormally fertilized for research human zygotes was approved by the institutional review board on the use of human subjects in research in the Valencia Infertility Institute (IVI), and complies with the Spanish Law Technology Assisted Reproduction (35 / 88). Todos los pacientes que participaron en este estudio firmaron una declaración escrita de consentimiento y recibieron información. All patients in this study signed a written consent and received information statement.

En este estudio se incluyeron 114 embriones tripronucleados, que tenian los tres cuerpos polares, comprobados de las 18 a las 22 horas tras la inseminación. In this study 114 tripronucleados embryos, which had the three polar bodies, tested from 18 to 22 hours after insemination included. Los protocolos para la estimulación folicular, la recuperación del oocito, la inseminación in vitro (Dia 0) y el cultivo embrionario inicial (Dia 1 a Dia 6), no se describen aqui (Gil-Salom et al., 1996) . Protocols for follicular stimulation, oocyte retrieval, in vitro insemination (Day 0) and the initial embryo culture (Day 1 to Day 6), are not described here (Gil-Salom et al., 1996).

Procedimiento de epronucleación: microherramientas y micromanipulación Para la micromanipulación, se colocaron cigotos 3-PN en una pequeña gota (25 μL) del medio FIV-20 (MediCult, EMB, Barcelona, España) que contiene citocalasina B 7,5 μg/mL (C6762; Sigma, Madrid, España) y demecolcina 0,1M (D1925; Sigma, Madrid, España) y se cubrieron con aceite mineral equilibrado. Epronucleación procedure: To microtools and micromanipulation micromanipulation, 3-PN zygotes were placed in a small drop (25 .mu.L) IVF-20 medium (MediCult, EMB, Barcelona, Spain) containing cytochalasin B 7.5 mg / mL ( C6762; Sigma, Madrid, Spain) and demecolcine 0.1 M (D1925, Sigma, Madrid, Spain) and covered with mineral oil balanced. Los cigotos se incubaron durante 5 minutos en condiciones controladas de cultivo (véase más adelante) . Zygotes were incubated for 5 minutes under controlled culture conditions (see below). Después, la placa se colocó en la platina de un microscopio invertido (Diaphot 300, Nikon) ajustado con micromanipuladores hidráulicos (MM188, Narishige) . The plate was placed on the stage of an inverted microscope (Diaphot 300, Nikon) fitted with hydraulic micromanipulators (MM188, Narishige). Se usaron dos microherramientas para la micromanipulación: una pipeta de mano (100 μm de diámetro externo; 20 μm de diámetro interno) y una microaguja abierta de 6 μm de diámetro externo. ; And an open microneedle 6 .mu.m outer diameter hand pipette (internal diameter 20 .mu.m 100 .mu.m OD): Two microtools were used for micromanipulation. Para acomodar el sistema de micromanipulación, se doblaron dos microherramientas hasta un ángulo de 45° y se usó el sistema de jeringa estándar (IM-26-2; Narishige) . To accommodate the micromanipulation system, two microtools bent to an angle of 45 ° and the standard syringe system (IM-26-2; Narishige) was used. Se llenaron los tubos de teflón para los sistemas hidráulicos con aceite mineral ligero. Teflon tubes for hydraulic systems filled with light mineral oil.

Antes de la epronucleación, los cigotos 3-PN se aglutinaron contra la pipeta manual y se giraron y se almacenaron hasta que de un vistazo se pueden identificar todos los pronúcleos y los dos cuerpos polares. Before epronucleación, 3-PN zygotes coalesced against manual pipette and turned and stored until a glance you can identify all the pronuclei and two polar bodies. Los tres pronúcleos se sitúan normalmente en una forma típica piramidal en el centro del ooplasma. The three pronuclei are usually placed in a typical pyramidal shape in the center of the ooplasm. En este momento, el pronúcleo masculino supernumerario se sacó y se situó en la posición más lejana del segundo cuerpo polar (Malter y Cohén, 1989; Wiker et al., 1990; Palermo et al., 1994; Tang et al., 1994). At this time, the supernumerary male pronucleus was removed and placed in the farthest position of the second polar body (Malter and Cohen, 1989; Wiker et al., 1990 Palermo et al, 1994;.. Tang et al, 1994) .

Para la epronucleación, la punta de la micropipeta se insertó a través de la zona pelúcida en el vitelo y se colocó suavemente cerca de la superficie objetivo del pronúcleo. For epronucleación, the micropipette tip is inserted through the zona pellucida in the yolk and gently placed near the target surface of the pronucleus. Se aplicó entonces presión negativa hasta que se recogió el pronúcleo. Negative pressure was then applied until the pronucleus was collected. Se mantuvo la presión mientras que la pipeta y el pronúcleo se retiraban suavemente del área de singamia hasta el oolema. while the pressure remained pipette and gently withdrew pronucleus area syngamy to oolema. En esta región, la aspiración progresa hasta la eliminación total del pronúcleo y hasta que cierta cantidad del citoplasma se extrajo libremente al interior de la aguja de epronucleación. In this region, the suction progresses until total elimination of the pronucleus and until certain amount of cytoplasm freely extracted into epronucleación needle. Entonces, se extrajo la micropipeta y se liberó el cigoto. Then, the micropipette was removed and the zygote was released. Cada manipulación de cada cigoto fue de aproximadamente 5 minutos . Each manipulation of each zygote was about 5 minutes.

Tras la manipulación, los cigotos se lavaron tres veces en medio FIV-20 y se cultivaron en una atmósfera con un 5% de C0 2 en aire a 37,5°C durante tres horas. After manipulation, the zygotes were washed three times in medium FIV-20 and cultured in an atmosphere of 5% C0 2 in air of 37.5 ° C for three hours. Después, se evaluó la supervivencia y el número de pronúcleos . Then, the survival and the number of pronuclei was evaluated. Sólo se cultivaron los embriones que sobrevivieron y que tenían dos pronúcleos; Only embryos that survived and had two pronuclei were grown; los que degeneraron o que tenían un estado nuclear distinto de dos, se comprobaron y se suprimieron del cultivo. which they degenerated or had a different nuclear status of two, were tested and were removed from the culture.

Algunos cigotos tripronucleados se manejaron de forma similar, aunque no se manipularon microquirúrgicamente, y sirvieron como grupo de control de 3-PN. Some tripronucleados zygotes were handled similarly, although they are not manipulated microsurgical, and served as a control group 3-PN.

Capacidad de desarrollo del embrión Embryo development capacity

Los cigotos humanos bipronucleados (2-PN) rescatados y algunos cigotos 3-PN control se cultivaron hasta la etapa de blastocito en células epiteliales del endometrio humano (CEEh) empleadas habitualmente en nuestra clínica (JCEM) . The (2-PN) zygotes bipronucleados rescued and some 3-PN zygotes cultured to control the blastocyst stage in human endometrial epithelial cells (CEEH) usually employed in our clinic (JCEM). Cuarenta y ocho horas después de la inseminación, se cocultivaron individualmente de dos a cuatro células embrionarias en la monocapa de CEEh. Forty-eight hours after insemination, they were individually cocultured two to four embryonic cells in monolayer CEEH. En este momento, los embriones se hicieron crecer en 1 mL de FIV-20/CCM (1/1; v/v) , hasta que alcanzaron la etapa de 8 células. At this time, the embryos were grown in 1 mL of IVF-20 / CCM (1/1; v / v), until they reached 8 cell stage. En la mañana del Dia 3, el medio se sustituyo por 1 mL CCM (MediCult, EMB, Barcelona, España) y los embriones se cultivaron durante tres o más dias. On the morning of Day 3, the medium was replaced with 1 mL CCM (MediCult, EMB, Barcelona, Spain) and embryos were cultured for three or more days. El desarrollo embrionario se comprobó todos los dias. Embryonic development was checked every day. Durante la realización de este estudio, los datos de desarrollo de los embriones fertilizados normales de los tratamientos en curso, obtenidos por la inseminación in vitro y el cocultivo embrionario, se agruparon retrospectivamente y aleatoriamente y sirvieron como grupo de control del cocultivo. During this study, data from development of normal fertilized embryos of ongoing treatments, obtained by in vitro insemination and embryo coculture, pooled and randomly retrospectively and served as control group coculture.

La capacidad de desarrollo de los embriones bi y tripronucleados se comparó estadísticamente usando la prueba del Chi cuadrado. Capacity development and tripronucleados bi embryos was compared statistically using the chi-square test. Cuando estuvo implicado un único grado de libertad, se usó la corrección de Yate para la continuidad. When he was involved a single degree of freedom, Yate's correction for continuity was used.

Análisis cromosómico chromosomal analysis

El Dia 5 o el 6, ocho blastocitos morfológicamente normales, derivados del cocultivo de embriones rescatados diploides, se fijaron y se procesaron para evaluar la presencia de los cromosomas X e Y y de los 18 autosomas (CEP 18/ X Orange/ Y Aqua; Vysis Inc., EE. UU.) al menos en 20 células, mediante hibridación triple fluorescente in situ (FISH: Munné et al., 1993) . On day 5 or 6, eight morphologically normal blastocysts derived from co-culture of embryos rescued diploid, fixed and processed for evaluating the presence of the X and Y chromosomes 18 autosomes (CEP 18 / X Orange / Y Aqua; Vysis Inc., USA) at least 20 cells by fluorescence in situ triple (FISH hybridization:.. Munné et al, 1993)..

Cuatro blastocitos, derivados de los cigotos tripronucleares cocultivados se procesaron de forma similar y se informó sobre el análisis cromosómico y la relación de sexos como un grupo de control. Four blastocysts derived from zygotes co-cultured tripronucleares similarly processed and reported on the chromosomal analysis and the sex ratio as a control group.

Determinación parental parental determination

Almacenamiento de blastocitos y de muestras de sangre y extracción de ADN Blastocysts and storage of blood samples and DNA extraction

El Dia 5, los blastocitos humanos diploidizados se colocaron en tubos PCR de 0,2 mi que contenían 15 μl de disolución tampón de lisis (KC1 50 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8,3, Tween-20 al 0,5% y 100 μg/ml de proteinasa K) . On day 5, the diploidizados human blastocysts were placed in 0.2 ml PCR tubes containing 15 ul of lysis buffer (50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, Tween-20 0.5% solution and 100 ug / ml proteinase K). Cada embrión se identificó y se congeló inmediatamente y se almacenó a -80°C hasta la amplificación por PCR. Each embryo was identified and immediately frozen and stored at -80 ° C until PCR amplification.

Todas las muestras de sangre de los parentales de los embriones se recogieron en tubos con 5ml de EDTA. All blood samples parental embryos were collected in EDTA tubes 5ml. Las muestras se identificaron y, o bien se congelaron directamente a -80°C, o se procesaron para obtener los especímenes de la capa leucocitaria. Samples were identified and either directly frozen at -80 ° C or processed to obtain specimens of the buffy coat. Después, se congelaron a de -15 a -25°C hasta la extracción del ADN mediante el kit de aislamiento del ADN genómico PUREGENE™ (Gentra Systems, Minneapolis, MN) . Then frozen at -15 to -25 ° C until DNA extraction by isolation kit PUREGENE ™ genomic DNA (Gentra Systems, Minneapolis, MN). El ADN genómico recuperado se disolvió en una disolución tampón que contenia un estabilizador de ADN y se almacenó a -20°C hasta la amplificación por PCR. The genomic DNA recovered was dissolved in a buffer solution containing a stabilizing DNA and stored at -20 ° C until PCR amplification.

Amplificación por PCR de los loci de repetición cortas en tándem PCR amplification of the loci of short tandem repeat

La amplificación por PCR de los loci de repeticiones cortas en tándem (RTS) se llevó a cabo usando el kit de amplificación de PCR amplification of the loci of short tandem repeats (STRs) was carried out using the amplification kit

PCR AmpFISTR ® Profiler Plus™ (Applied Biosystems, Foster City, PCR AmpFISTR ® Profiler Plus ™ (Applied Biosystems, Foster City,

CA) . CA). Este kit coamplifica diez regiones de repetición poli órficas correspondientes a D3S1358 (li et al., 1993), vWA This co-amplified kit Orphic ten regions corresponding to D3S1358 repeat poly (li et al., 1993), vWA

(Kimpton et al., 1981), FGA (Mills et al., 1992), D8S1179 (Oldroyd et al., 1995), D21S11 (Sharma y Litt, 1992), D18S51 (Urquhart et al., 1995), D5S818 (Hudson et al., 1995), D13S317 (Hudson et al., 1995), D7S820 (Green et al., 1991) y un segmento del gen homólogo a XY amelogenina (Sullivan et al, 1993) . (Kimpton et al., 1981), FGA (Mills et al., 1992), D8S1179 (Oldroyd et al., 1995), D21S11 (Sharma and Litt, 1992), D18S51 (Urquhart et al., 1995), D5S818 ( Hudson et al., 1995), D13S317 (Hudson et al., 1995), D7S820 (Green et al., 1991) and a segment homologous amelogenin gene XY (Sullivan et al, 1993).

Las concentraciones del componente de la PCR y los parámetros del ciclo estaban indicados por el fabricante. Component concentrations and PCR cycle parameters were specified by the manufacturer. Con el fin de optimizar los resultados, se usó una entrada de 1,5 ng de DNA a partir de las muestras de sangre. To optimize the results, an input of 1.5 ng DNA from blood samples was used. Antes de añadir la mezcla de componentes de la PCR, se descongelaron los blastocitos congelados, en hielo durante 2-3 minutos, seguido por la incubación a 37°C durante 10 minutos y después, se colocaron inmediatamente a 95°C durante 5 minutos. Before adding the mixture of PCR components, frozen on ice for 2-3 minutes, followed by incubation at 37 ° C for 10 minutes and then they were immediately placed at 95 ° C for 5 minutes thawed blastocysts.

Análisis del fragmento en el analizador genético ABI Prism™ 310 Fragment analysis in the genetic analyzer ABI Prism ™ 310

Se preparó una mezcla de 1,5 μl de productos fluorescentes de PCR, 12 μl de formamida desionizada y 0,5 μl de patrones de tamaño (GeneScan-500 [ROX] , Applied Biosystems) y se desnaturalizó a 95°C durante 3 minutos. a mixture of 1.5 .mu.l of fluorescent PCR products, 12 .mu.l of deionized formamide and 0.5 .mu.l of size standards (GeneScan-500 [ROX], Applied Biosystems) was prepared and was denatured at 95 ° C for 3 minutes . El patrón interno de tamaño cargado con cada muestra permitió la determinación automática de los tamaños de los productos de la PCR y la normalización de las diferencias en la movilidad electroforética entre las muestras. The internal standard of each sample size allowed loaded with automatic determination of the sizes of the PCR products and standardization of differences in electrophoretic mobility between samples.

Las muestras desnaturalizadas se sometieron a electroforesis capilar usando el polímero POP-4™, con 3 s de tiempo de inyección. The denatured samples were subjected to capillary electrophoresis using POP-4 ™ polymer with 3 s injection time. Los datos de los fragmentos de RTS obtenidos a partir de la amplificación del ADN de la sangre y de los embriones humanos, se analizaron usando el software de análisis GeneScan ® 3.1.2 (Applied Biosystems). Data RTS fragments obtained from amplification of DNA from blood and human embryos, were analyzed using GeneScan software analysis ® 3.1.2 (Applied Biosystems). Se usaron tres tintes fluorescentes, 5-FAM (azul), JOE (verde), y NED (amarillo) con el kit para el análisis de multicomponente de las muestras estudiadas. three fluorescent dyes were used, 5-FAM (blue), JOE (green) and NED (yellow) with the kit for multicomponent analysis of the samples studied. Un cuarto tinte, ROX (rojo), se usó para el patrón interno de tamaño. A fourth dye, ROX (red), was used for the internal standard size.

RESULTADOS RESULTS

Eficacia técnica technical efficiency

Cincuenta y seis de 72 cigotos humanos tripronucleados (77,7%) sobrevivieron a la manipulación microquirúrgica, de los que 51 cigotos finalmente tuvieron dos pronúcleos (71%) . Fifty six of 72 human zygotes tripronucleados (77.7%) survived microsurgical manipulation, of which 51 zygotes were finally two pronuclei (71%). La aparición general normal de los cigotos normalmente tiene lugar dentro de los 30 minutos tras la manipulación, siendo identificable el pronúcleo. The normal overall appearance zygotes usually takes place within 30 minutes after manipulation, being identifiable the pronucleus. En este momento, también se observaron algunos cigotos degenerativos (n=16) . At this time, some degenerative zygotes (n = 16) were also observed.

Capacidad de desarrollo Capacity development

Todos los embriones diploidizados microquirúrgicamente se dividieron a las 24 horas del cultivo y el 96% alcanzó el estado de 6-8-células en el dia 3 del desarrollo. All embryos were divided diploidizados microsurgical 24 hours of culture and 96% achieved the status 6-8-cells on day 3 of development. En el Dia 6, veintiún cigotos humanos rescatados progresaron a la etapa de blastocito (41%) . On day 6, human zygotes rescued twenty progressed to the blastocyst stage (41%). La capacidad de los embriones diploidizados a desarrollarse es comparable con el desarrollo de los embriones cocultivados fertilizados normales (estado de 8 células: 85%; blastocitos: 50%). The ability of the embryos to develop diploidizados is comparable to the development of embryos fertilized cocultivated normal (state 8 cells: 85%; blastocysts: 50%). Además, el blastocito morfológicamente normal derivado de los embriones epronucleados o cocultivados control se caracterizó por una masa celular interna y un trofoectodermo bien definidos. Furthermore, the standard morphologically epronucleados blastocyst embryos derived from control or cocultured characterized by an inner cell mass and trophectoderm well-defined. Esto se opone claramente a los embriones 3-PN control, que progresaron con una eficacia significativamente menor en el sistema de cocultivo, dando lugar sólo a un 19% de blastocitos. This is clearly opposed to 3-PN embryos control progressed significantly less effective in the coculture system, resulting in only 19% of blastocysts. Estos embriones fueron anormales morfológicamente, caracterizados por una masa celular interna ausente o reducida y por un trofoectodermo lineal. These embryos were morphologically abnormal, characterized by absent or reduced inner cell mass and trophectoderm a linear.

Origen parental parental origin

Usando los cuatro tintes fluorescentes, la detección y la identificación de los fragmentos positivos control de ADN determinó que el tamaño era desde 103 a 312 pb (Figura 1A) . Using the four fluorescent dyes, detection and identification of positive control DNA fragments determined that the size was from 103-312 bp (Figure 1A). Las muestras de sangre dieron como resultado electroferogramas con patrones de amplificación esperados para los loci de RTS analizados. Blood samples gave as result electropherograms with patterns expected for amplification RTS loci analyzed. En estas muestras, los fragmentos oscilaron desde 103,24 ± 0,07 (media ± DE) hasta 240,26 que corresponde con la amplificación de la amelogenina X y el locus más grande humano del alfa fibrinógeno (AFG) , respectivamente (Figura IB, C) . In these samples, fragments ranged from 103.24 ± 0.07 (mean ± SD) to 240.26 corresponding to the amplification of the X amelogenin locus and the largest human fibrinogen alpha (AFG), respectively (Figure IB , C). Resulta sorprendente que fueran relativamente más cortos de lo esperado. Surprisingly, it was relatively shorter than expected.

Cuatro de seis embriones analizados (67%) mostraron un claro patrón de amplificación que oscilaba desde 103,93 ± 0,53 (media ± DE) hasta 304,26, correspondiendo con el gen de la amelogenina X y con el alelo más grande D18S51, respectivamente (Figura ID) . Four of six embryos analyzed (67%) showed a clear pattern of amplification ranging from 103.93 ± 0.53 (mean ± SD) to 304.26, corresponding to the amelogenin gene X and the larger allele D18S51 respectively (Figure ID). El análisis de la herencia de los marcadores indicó que los cuatro embriones amplificados eran diploides y genéticamente heteroparentales . The analysis of the inheritance of the markers indicated that the four amplified embryos were diploid and genetically heteroparentales. Tres embriones eran femeninos y uno era masculino. Three embryos were female and one was male.

DISCUSIÓN DISCUSSION

La epronucleación microquirúrgicca de los cigotos tripronucleados propuesta en el presente documento da lugar a blastocitos morfológica y genéticamente normales (diploides y heteroparentales) . The microquirúrgicca epronucleación of zygotes tripronucleados proposed herein results in blastocysts morphologically and genetically normal (diploid and heteroparentales).

Técnicamente, el procedimiento de micromanipulación ha dado como resultado tasas exitosas de supervivencia y reconstrucción del número de pronúcleos, puesto que el 71% de los cigotos manipulados sobrevivió y contuvo dos pronúcleos . Technically, the micromanipulation procedure has resulted in successful reconstruction survival rates and the number of pronuclei, since 71% of the manipulated zygotes survived and contained two pronuclei.

La tasa de supervivencia (78%) podria ser suficientemente alta para la aplicación generalizada, en particular si se considera que estos resultados representan los primeros esfuerzos iniciales. The survival rate (78%) could be high enough for widespread application, particularly if it is considered that these results represent the first initial efforts. Los relajantes del citoesqueleto, como la citocalasina o la colcemida se usan habitualmente en los estudios de transferencia nuclear en mamíferos (Willadsen, 1986; S ith y Wilmut, 1989; Collas y Robl, 1990), ya que inducen la despolimerización de los filamentos de actina con posibles efectos sobre la membrana plasmática, lo que determina las tasas globales de supervivencia. Relaxants cytoskeleton, as cytochalasin or colcemid are commonly used in studies of nuclear transfer in mammals (Willadsen, 1986; S ith and Wilmut, 1989; Collas and Robl, 1990), since they induce depolymerization of filaments actin with possible effects on the plasma membrane, which determines the overall survival rates. A pesar de tales efectos, estos fármacos se han aplicado con precaución a los humanos, debido a los efectos citotóxicos sugeridos. Despite these effects, these drugs have been applied with caution to humans, because the suggested cytotoxic effects. De hecho, la epronucleación microquirúrgica de los embriones 3- PN, usando citocalasina de tipo B (CCB) o D durante 30 minutos perjudicó el desarrollo posterior del embrión (Rawlins et al., 1988; Gordon et al., 1989). In fact, microsurgical epronucleación 3- PN embryos, using cytochalasin B-type (CCB) or D for 30 minutes detracted the embryo development (Rawlins et al., 1988; Gordon et al., 1989). Sin embargo, en el presente trabajo, la limitación del tiempo de exposición de la CCB y la demecolcina durante un tiempo de incubación realmente corto de 10 minutos, dio lugar a embriones rescatados capaces de dividirse y desarrollarse hasta la etapa de blastocito (41%) tan eficazmente como los fertilizados normales (50%) . However, in this work, limiting the exposure time of the CCB and demecolcine during a time of really short incubation of 10 minutes, it resulted in embryos rescued able to divide and develop to the blastocyst stage (41%) as effectively as normal fertilized (50%). Por tanto, los efectos del tipo de citocalasina y la aplicación del tratamiento (dosis y tiempo de exposición) podrían, no sólo afectar a la eficacia de la supervivencia, sino también a la capacidad posterior de desarrollo del embrión. Therefore, the effects of cytochalasin type and application of the treatment (dosage and exposure time) may not only affect the efficiency of survival, but also the subsequent embryo development capacity.

Desgraciadamente, el manejo del grupo de control no fue una elección óptima, porque los cigotos 3-PN hacen escasos progresos en el desarrollo in vitro (Plachot y Mandelbaum, 1990; Plachot y Crozet, 1992; Sathananthan et al., 1999; este trabajo) , dando lugar finalmente a blastocitos anormales caracterizados por tener una masa celular interna reducida o ausente y por un trofoectodermo lineal. Unfortunately, the handling of the control group was not an optimal choice because zygotes 3-PN made little progress in the development in vitro (Plachot and Mandelbaum, 1990; Plachot and Crozet, 1992; Sathananthan et al., 1999; this work ), ultimately resulting in abnormal blastocysts characterized as having reduced or absent inner cell mass and trophectoderm a linear. Estas observaciones sugieren que el desarrollo del embrión humano in vitro podria perjudicarse gravemente por la ploidia o posiblemente por la combinación parental, no siendo lo suficientemente informativa acerca de los efectos de la CCB y de la demecolcina. These observations suggest that the development of the human embryo in vitro could suffer severe damage by ploidy or possibly by the parental combination, not being enough information about the effects of CCB and demecolcine.

Con respecto a la importancia de la ploidia o de la combinación parental, los cigotos humanos 3-PN dispérmicos son triploides y tienen la proporción de cromosomas sexuales XXX:XXY:XYY como 7:9:5 (Rosenbusch et al., 1997, 1998). Regarding the importance of ploidy or parental combination, human zygotes 3-PN dispérmicos are triploid and have the ratio of sex chromosomes XXX: XXY: XYY as 7: 9: 5 (Rosenbusch et al, 1997, 1998. ). En el presente trabajo, en todos los blastocitos analizados derivados de tripronucleados, la distribución estaba alterada al cariotipo 69,XXY, sin detectarse embriones 69, XX ni 69, XYY. In this paper, in all analyzed tripronucleados derived from blastocysts, the distribution was altered to karyotype 69, XXY, without embryos 69, XX or 69, XYY detected. Este cambio podria indicar que en las etapas más avanzadas, aparecen más limitaciones en el desarrollo, según la combinación parental final o también podria sugerir la necesidad de una herencia bialélica para el desarrollo embrionario con éxito. This change could indicate that in the most advanced stages, more limitations in development appear as the final parental combination or also might suggest the need for a biallelic inheritance for embryonic development successfully. Sin embargo, el cariotipo de las molas parcialmente hidatidiformes, normalmente triploides (69, XXX, 69,XXY y 69, XYY) y que normalmente contienen un complemento materno y dos paternos (Lawler et al., 1991) puede implantarse (Edwards et al., 1990). However, the karyotype of normally triploid partially hydatidiform moles (69, XXX, 69, XXY and 69, XYY) and usually contain a native complement and two paternal (Lawler et al., 1991) can be implemented (Edwards et al ., 1990). Por tanto, podria ser posible que los embriones 3-PN tuvieran diferentes requerimientos nutricionales, que no se suministran mediante el cocultivo (Plachot y Mandelbaum, 1990; este trabajo) o las condiciones definidas de cultivo (Plachot y Cohén, 1992; Sathananthan et al., 1999) . Therefore, it could be possible that embryos 3-PN have different nutritional requirements, which are not supplied by the co-culture (Plachot and Mandelbaum, 1990; this study) or the defined conditions of cultivation (Plachot and Cohen, 1992; Sathananthan et al ., 1999) .

La extracción del pronúcleo más lejano en relación con la posición del 2CP restablece la contribución parental normal, como se sugiere por las observaciones morfológicas y genéticas, lo que confirma el origen paterno de tal pronúcleo. Extraction pronucleus farthest relative to the position of 2CP restores normal parental contribution, as suggested by the morphological and genetic observations, confirming the paternal origin of such pronucleus.

En el presente trabajo, los embriones rescatados progresaron en su desarrollo, tras el programa normal, dando lugar a blastocitos 46, XX y 46, XY (40%) que contenían masas celulares internas y trofoectodermo bien definidos. In this paper, the rescued embryos progressed in its development after the normal program, resulting in 46 blastocysts, XX and 46, XY (40%) containing well-defined internal cell mass and trophectoderm. Estos resultados contrastan con los informes anteriores en los que los embriones diploidizados sólo se desarrollaron hasta la etapa de 8 células (Palermo et al., 1994) y raramente hasta las etapas de compactación (Gordon et al., 1989; Malter y Cohén, 1994) . These results contrast with previous reports in which diploidizados embryos only developed into the 8-cell stage (Palermo et al., 1994) and rarely up stages of compaction (Gordon et al., 1989; Malter and Cohen, 1994 ). En el presente documento, la mejora conseguida en el desarrollo podria deberse, tal como se trató anteriormente, a la realización de la manipulación (aplicación de relajantes del citoesqueleto) o, como alternativa, al propio procedimiento de epronucleación. Herein, the improvement achieved in the development could be due, as previously discussed, to the realization of handling (applying relaxants cytoskeleton) or, alternatively, the procedure itself epronucleación. Si los cigotos tripronucleados tienen origen dispérmico, deberla esperarse una doble herencia del centrosoma paterno (Palermo et al., 1994; Santhananthan et al., 1999). If zygotes tripronucleados have dispérmico origin, deberla expected a double inheritance of the paternal centrosome (Palermo et al., 1994; Santhananthan et al., 1999). La restauración del estado parental normal en los cigotos polipronucleares por aspiración del contenido en exceso del pronúcleo, deja la membrana pronuclear, los componentes yuxta y extranucleares, incluyendo el centrosoma extra (Palermo et al., 1994) en el cigoto, lo que podria ser la causa del perjuicio observado en el desarrollo embrionario. The restoration of normal parental status in polipronucleares zygotes aspiration of content in excess of pronucleus, leaves the pronuclear membrane, the yuxta components and extranuclear, including the extra centrosome (Palermo et al., 1994) in the zygote, which could be the cause of the injury observed in embryonic development. Como alternativa, la extracción del pronúcleo al interior de un carioplasto también podria eliminar estos componentes extras, permitiendo el desarrollo embrionario posterior normal, como el observado en ratones (Niemierko y Opas, 1978; Surani et al., 1986) . Alternatively, extraction into a pronucleus karyoplast could also eliminate these extra components, allowing subsequent embryonic development normal as observed in mice (Niemierko and Opas, 1978; Surani et al., 1986). En este estudio, el procedimiento de epronucleación conduce a la extracción del pronúcleo completo y de alguna cantidad del citoplasma cercano y se observó un desarrollo embrionario normal in vitro. In this study, the procedure leads to epronucleación complete extraction pronucleus and some amount of nearby cytoplasm and a normal embryonic development in vitro was observed. Si se extrajera el centrosoma extra paterno deberla identificarse en el análisis posterior de inmunocitoquimica ultraestructural . If extra paternal centrosome deberla identified in the subsequent analysis immunocytochemistry ultrastructural was mined.

Pese al hecho de que la epronucleación materna no es el objetivo, su aparición no puede descartarse. Despite the fact that breast epronucleación is not the goal, its appearance can not be ruled out. Aun cuando podria haberse producido (0,3 de probabilidad), habrían surgido embriones diploides androgenéticos . Even if it could have occurred (0.3 probability) would have arisen androgenetic diploid embryos. Estos embriones, que tienen dos juegos de cromosomas paternos, denominados molas hidatidiformes completos (MHC) , pueden progresar en el desarrollo hasta conceptos anormales 46, XX y raramente hasta 46, XY, que se caracterizan morfológicamente por una masa celular interna ausente o por trofoectodermo lineal (Kajii y Ohama, 1977; Surti et al., 1979). These embryos, which have two sets of paternal chromosomes, called complete hydatidiform moles (MHC), can progress in development to abnormal concepts 46, XX and rarely to 46, XY, which is morphologically characterized by an absent inner cell mass or trophoectoderm linear (Kajii and Ohama, 1977; Surti et al., 1979). Por tanto, tanto el aspecto morfológico normal de la masa celular interna y del trofoectodermo, como la proporción normal de sexos confirmada por el recuento cromosómico, sugieren la normalidad genética heteroparental de los blastocitos obtenidos, aunque la confirmación genética de la normalidad embrionaria se proporcionó mediante el análisis de polimorfismo del ADN. Therefore, both the normal morphological appearance of the inner cell mass and trophectoderm, as the normal ratio confirmed by chromosome count sexes suggest genetic normal heteroparental blastocyst obtained, although the genetic confirmation of embryo normality was provided by analysis of DNA polymorphism.

Puesto que cada locus es un marcador independiente, la herencia paterna en los embriones puede confirmarse a partir de estos loci amplificados de muestras sanguíneas y embrionarias. Since each locus is an independent marker, paternal inheritance in embryos it can be confirmed from these amplified loci and embryonic blood samples. En trabajos sucesivos, intentamos mejorar la amplificación de la muestra de ADN añadiendo albúmina sérica bovina en tampón de lisis para evitar o minimizar la inhibición de la PCR (Comey et al., 1994) por los compuestos hemo (Akane et al., 1994). In subsequent work, we try to improve the amplification of the DNA sample by adding bovine serum albumin in lysis buffer to prevent or minimize PCR inhibition (Comey et al., 1994) by heme compounds (Akane et al., 1994) . Además, asegurar la constitución genética normal de los embriones rescatados contrastará sus patrones de expresión genética y la distribución de proteínas con los procedentes de embriones no manipulados normales diploides y triploides. In addition, ensure normal genetic makeup of the rescued embryos contrasted patterns of gene expression and protein distribution with embryos from normal diploid and triploid manipulated.

En resumen, se concluye que los embriones humanos heteroparentales normales pueden rescatarse de los cigotos tripronucleados mediante la extracción del pronúcleo paterno en exceso localizado en la posición más lejana del segundo cuerpo polar. In summary, it is concluded that normal human embryos can be rescued heteroparentales of zygotes tripronucleados by removing the excess paternal pronucleus located in the farthest position of the second polar body. De ese modo, el 2CP puede considerarse como un buen indicador morfológico del origen paterno del pronúcleo. Thus, PB2 can be considered as a good indicator of paternal origin morphological the pronucleus.

2. Producción de la célula madre 2. Production of stem cell

Aislamiento de la masa celular interna Isolating the inner cell mass

Se cultivaron blastocitos calentados en 1 mL de CCM en una atmósfera con un 5% de C0 2 en aire y un 95% de humedad a 37,5° durante 12 horas para evaluar su supervivencia y su progresión en el desarrollo. Blastocysts heated in 1mL CCM in an atmosphere with 5% C0 2 in air and 95% humidity at 37.5 ° were cultured for 12 hours to assess their survival and developmental progression. El aislamiento de la masa celular se llevó a cabo tras un procedimiento inmunoquirúrgico. The isolation of cell mass was carried out following a procedure inmunoquirúrgico. Por tanto, en primer lugar se eliminó la zona pelúcida mediante incubación en 1 mL de disolución acida de Tyrodes (ZD-10; Vitrolife) a temperatura ambiente durante menos de un minuto. Therefore, first the zona pellucida by incubation in 1 mL of Tyrodes acid solution (ZD-10; Vitrolife) was removed at room temperature for less than one minute. Los blastocitos libres de la zona se lavaron dos veces en 1 mL de CCM y se incubaron en 1 mL de CCM en condiciones de cultivo durante 3 horas. Free area blastocysts were washed twice in 1 ml of CCM and incubated in 1mL CCM under culture conditions for 3 hours. Después se incubaron los blastocitos libres de zona en gotas de 75 μL de suero de linfocito anti-humano de conejo (CL8010, Cedarlane Laboratories Limited) en CCM (3:1, respectivamente) en aceite mineral en condiciones de cultivo durante 30 minutos. After free zone blastocysts were incubated in 75 uL drops of serum anti-human lymphocyte rabbit (CL8010, Cedarlane Laboratories Limited) in TLC (3: 1, respectively) in mineral oil on culture conditions for 30 minutes. Después, se lavaron los blastocitos brevemente dos veces en 100 μL de CCM y se incubaron en 75 μL de complemento de conejo para su uso con anticuerpos monoclonales para los linfocitos humanos (Sera-Lab) en condiciones de cultivo durante 30 minutos. Then briefly blastocysts were washed twice in 100 mL of CCM and incubated in 75 mL of rabbit complement for use with monoclonal antibodies to human lymphocytes (Sera-Lab) in culture conditions for 30 minutes. Los blastocitos se transfirieron entonces a una gota fresca de 100 μL de CCM y se pipetearon suavemente para extraer las células trofoectodérmicas Usadas. Blastocysts were then transferred to a fresh drop of 100 mL and gently pipetted CCM to remove cells trofoectodérmicas used. La masa celular interna aislada se lavó entonces en 1 mL de CCM durante 30 minutos, quedando lista para cultivarse en una monocapa de fibroblastos inactivados de ratón para obtener células madre embrionarias humanas . Isolated inner cell mass was then washed in 1mL CCM for 30 minutes, being ready to be cultured on a monolayer of mouse fibroblasts inactivated for human embryonic stem cells.

Tales células madre pueden inducirse para diferenciación usando técnicas conocidas en la técnica. Such stem cells can be induced to differentiate using techniques known in the art.

BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAPHY

Wobus AM, 2001. Potential of embryonic stem cells. Wobus AM, 2001. Potential of embryonic stem cells. Mol mol

Aspects Med 22(3): 149-164 Notarianni et al., 1991. Derivation of pluripotent, embryonic cell Unes from the pig and sheep. Aspects Med 22 (3). 149-164 Notarianni et al, 1991. Derivation of pluripotent, embryonic cell Unes from the pig and sheep. J Reprod Fértil J Reprod Fertil

Suppl, 43: 255-260. Suppl, 43: 255-260. Van Stekelenburg-Hamers et al., (1995) Isolation and characterization of permanent cell Unes from inner cell mass of bovine blastocysts. Van Stekelenburg-Hamers et al., (1995) Isolation and characterization of permanent cell Unes from inner cell mass of blastocysts bovine. Mol Reprod Dev 40: 444-454. Mol Reprod Dev 40: 444-454. Thomson et al., (1998) Embryonic stem cells Unes derived from human blastocysts. Thomson et al., (1998) Embryonic stem cells from human blastocysts derived Unes. Science 282: 1145-1147. Science 282: 1145-1147. Modlinski J, 1975. Haploid mouse embryos obtained by microsurgical removal of one pronucleus . Modliński J, 1975. Haploid mouse embryos Obtained by microsurgical removal of one pronucleus. J Embryol Exp Morphol 33, 897-905. J Embryol Exp Morphol 33, 897-905. Hoppe PC, Illmensee K. Full-term development after transplantation of parthenogenetic embryonic nuclei into fertilized mouse eggs. Hoppe PC, K. Illmensee Full-term development after transplantation of parthenogenetic embryonic nuclei into mouse fertilized eggs. Proc Nat Acad Sci USA 1982; Proc Nat Acad Sci USA 1982; 74: 5657-5661. 74: 5657-5661. MacGrath J, Solter D. Nuclear transplantation in the mouse embryo by microsurgery and cell fusión. MacGrath J, Solter D. Nuclear transplantation in the mouse embryo by microsurgery and cell fusion. Science 1983; Science 1983;

220: 1300-1303. 220: 1300-1303. Surani MAH, Barton SC, Norris ML. Surani MAH, Barton SC, Norris ML. Nuclear transplantation in the mouse: Hereditable differences between parental genomes after activation of the embryonic genome. Nuclear transplantation in the mouse: heritable Differences Between parental genomes after activation of the embryonic genome. Cell 1986; Cell 1986; 45: 127-136. 45: 127-136.

Escriba MJ, Garcia-Ximénez F. Reconstruction of the heteroparental diploid condition in rabbit zygotes by nuclear transfer. Write MJ, Garcia-Ximenez F. Reconstruction of the heteroparental diploid condition in rabbit zygotes by nuclear transfer. Theriogenology 2001; Theriogenology 2001; 55: 771-784. 55: 771-784. Rawlins RG, Binor Z, Radwanska E, Dmowski WP. RG Rawlins, Binor Z, E Radwanska, Dmowski WP. Microsurgical enucleation of tripronuclear human zygotes . Microsurgical enucleation of tripronuclear human zygotes. Fértil Fertile

Steril 1988; Steril 1988; 50: 266-272. 50: 266-272. Gordon JW, Grunfeld L, Garrisi GJ, Navot D, Laufer MD. JW Gordon, Grunfeld L, Garrisi GJ, Navot D, Laufer MD. Successful microsurgical removal of a pronucleus from tripronuclear human zygotes. Successful microsurgical removal of a pronucleus from tripronuclear human zygotes. Fértil Steril 1989; Fertil Steril 1989; 52: 367-372. 52: 367-372. Malter HE, Cohén J. Embryonic development after icrosurgical repair of polyspermic human zygotes. HE Malter, Cohen J. Embryonic development icrosurgical after repair of polyspermic human zygotes. Fértil Steril 1989; Fertil Steril 1989; 52: 373-380. 52: 373-380.

Palermo G, Munné S, Cohén J. The human zygote inherits its mitotic potential from the male gamete. G Palermo, Munné S, Cohen J. The human zygote inherits from the ITS mitotic potential male gamete. Hum Reprod Hum Reprod

1994; 1994; 9: 1220-1225. 9: 1220-1225.

Ivakhnenko V, Cieslak J, Verlinsky Y. A microsurgical technique for enucleation of multipronuclear human zygotes. Ivakhnenko V, J Cieslak, Verlinsky Y. A microsurgical technique for enucleation of multipronuclear human zygotes. Hum Reprod 2000; Hum Reprod 2000; 15: 911-916. 15: 911-916. Kola I, Trounson A. Dispermic human fertilization: violation of expected cell behavior. Kola I, Trounson A. Dispermic human fertilization: violation of expected cell behavior. In Schatten H, Chatten G (eds) , The cell biology of fertilization. In Schatten H, Chatten G (eds), The cell biology of fertilization. 1989. Academic Press, San Diego, CA pp. 1989. Academic Press, San Diego, CA pp. 277-293. 277-293.

Wiker S, Malter H, Wright G, Cohén J. Recognition of paternal pronuclei in human zygotes. Wiker S, Malter H, Wright G, Cohen J. Recognition of paternal pronuclei in human zygotes. J In Vitro Fértil J In Vitro Fertil

Embryo Transfer. Embryo Transfer. 1990; 1990; 7: 33-37. 7: 33-37.

Tesarik J, Kopecny V. Development of human male pronucleus: ultrastructure and timing. Tesarik J, Kopečný V. Development of human male pronucleus: ultrastructure and timing. Gamete Res. 1989; Gamete Res. 1989; 24: 135- 149. Goud P, Goud A, Van Oostveldt P, Van der Elst J, Dhont M. Fertilization abnormalities and pronucleus size asynchrony after intracytoplasmic sperm injection are related to oocyte postmaturity. 24: 135- 149. Goud P, Goud A, Van Oostveldt P, Van der Elst J, Dhont M. Fertilization and pronucleus size asynchrony abnormalities after intracytoplasmic sperm injection are related to oocyte postmaturity. Fértil Steril. Fertil Steril. 1999; 1999; 72: 245-252. 72: 245-252. Tang YX, Munné S, Reing A, Schattman G, Grifo J, Cohén J. The parental origin of the distal pronucleus in dispermic human zygotes. Tang YX, Munné S, Reing A, Schattman G, Grifo J, Cohen J. The parental origin of the distal pronucleus in dispermic human zygotes. Zygote 1994; Zygote 1994; 1: 79-85. 1: 79-85.

Gil-Salom M, Romero J, Minguez Y, Rubio C, De los Santos MJ, Remohi J, Pellicer A. Pregnancies after intracytoplasmic sperm injection with cryopreserved testicular spermatozoa. Gil-Salom M, Romero J, Minguez And Rubio C, De los Santos MJ, Remohi J, Pellicer A. Pregnancies after intracytoplasmic sperm injection With cryopreserved testicular spermatozoa. Hum Reprod 1996; Hum Reprod 1996; 6: 1309-1313 6: 1309-1313

Kaufman MH. Kaufman MH. The experimental production of mammalian parthenogenetic embryos. The experimental production of mammalian parthenogenetic embryos. In: Daniel JC (ed) , Methods in Mammalian Reproduction. In: Daniel JC (ed), Methods in Mammalian Reproduction. New York: Academic Press, 1978; New York: Academic Press, 1978; 21-47. 21-47. Mittwoch U. Parthenogenesis. U. Mittwoch Parthenogenesis. J Med Genet 1978; J Med Genet 1978; 15: 165-181. 15: 165-181. Niemierko A, Opas J. Manipulation of ploidy in the mouse. Niemierko A, Opas J. Manipulation of ploidy in the mouse.

In: Daniel JC (ed) , Methods in Mammalian Reproduction. In: Daniel JC (ed), Methods in Mammalian Reproduction.

New York: Academic Press, 1978; New York: Academic Press, 1978; 50-65. 50-65. Markert CL. Markert CL. Parthenogenesis, homozygosity and cloning in mammals. Parthenogenesis, homozygosity and cloning in mammals. J Hered 1982; J Hered 1982; 73: 390-397. 73: 390-397. Plachot M, Crozet N. Fertilization abnormalities in human in-vitro fertilization. Plachot M, Crozet N. Fertilization abnormalities in human in-vitro fertilization. Hum Reprod 1992; Hum Reprod 1992; 7: 89-94. 7: 89-94. Munné S, Lee A, Rosenwaks Z, Grifo J, Cohén J. Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplentation embryos. Munne S, Lee A, Rosenwaks Z, Grifo J, Cohen J. Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human embryos preimplentation. Hum Reprod 1993; Hum Reprod 1993; 8: 2185-2191. 8: 2185-2191. Li H, Schmidt L, Wei MH, Hustad T, Lerman MI, Zbar B, Tory K. Li H, Schmidt L, Wei MH, Hustad T, Lerman MI, Zbar B, Tory K.

Three tetranucleotide polymorphisms for loci: D3S1352; Three polymorphisms for tetranucleotide loci: D3S1352;

D3S1358; D3S1358; D3S1359. D3S1359. Hum Mol Genet 1993; Hum Mol Genet 1993; 2: 1327. Kimpton C, Walton A, Gill P. A further tetranucleotide repeat polymorphism in the vWF gene. 2: 1327. Kimpton C, Walton A, Gill P. A further tetranucleotide repeat polymorphism in the vWF gene. Hum Mol Genet 1981; Hum Mol Genet 1981; 1: 1:

287. Mills KA, Even D, Murray JC. 287. Mills KA, Even D, Murray JC. Tetranucleotide repeat polymorphism at the human alpha fibrinogen locus (FGA) Hum Mol Genet 1992; Tetranucleotide repeat polymorphism at the human alpha fibrinogen locus (FGA) Hum Mol Genet 1992; 1:779. 1: 779.

Oldroyd NJ, Urquhart AJ, Kimpton CP, Millican ES, Watson SK, NJ Oldroyd, AJ Urquhart, Kimpton CP, Millican ES, SK Watson,

Downes T, Gill PD. Downes T, Gill PS. A highly discriminating octoplex short tándem repeat polymerase chain reaction system suitable for human individual identification. A highly discriminating octoplex short tandem repeat polymerase chain reaction single system suitable for human identification. Electrophoresis 1995; Electrophoresis 1995; 16: 334-337. 16: 334-337.

Sharma V, Litt M. Tetranucleotide repeat polymorphism at the Sharma V, M. Litt Tetranucleotide repeat polymorphism at the

D21S11 locus. D21S11 locus. Hum Mol Genet 1992; Hum Mol Genet 1992; 1: 67. 1: 67.

Urquhart A, Oldroyd NJ, Kimpton CP, Gill P. Highly discriminating heptaplex short tándem repeat PCR system for forensic identification. Urquhart A, Oldroyd NJ, Kimpton CP, Gill P. Highly heptaplex short tandem repeat discriminating PCR system for forensic identification. Biotechniques 1995; Biotechniques 1995; 18: 18:

116-121. 116-121.

Hudson TJ, Stein LD, Gerety SS, Ma J, Castle AB, Silva J, TJ Hudson, LD Stein, Gerety SS, Ma J, Castle AB, Silva J,

Slonim DK, Baptista R, Kruglyak L, Xu SH, et al. Slonim DK, R Baptista, Kruglyak L, Xu SH, et al. An STS- based map of the human genome. An STS-based map of the human genome. Science 1995; Science 1995; 270: 1945- 1954. Sullivan KM, Mannucci A, Kimpton CP, Gill P. A rapid and quantitative DNA sex test: fluorescence-based PCR analysis of XY homologous gene amelogenin. 270: 1945- 1954. Sullivan KM, Mannucci A Kimpton CP, Gill P. A rapid and quantitative DNA sex test: fluorescence-based PCR analysis of XY homologous amelogenin gene. Biotechniques 1993; Biotechniques 1993; 15: 636-641. 15: 636-641.

Willadsen SM. SM Willadsen. Nuclear transplantation in sheep embryos. Nuclear transplantation in sheep embryos.

Nature 1986; Nature 1986; 320: 63-65. 320: 63-65. Smith LC, Wilmut I. Influence of nuclear and cytoplasmic activity on the development in vivo of sheep embryos after nuclear transplantation. LC Smith, Wilmut I. Influence of nuclear and cytoplasmic activity in vivo on the development of sheep embryos after nuclear transplantation. Biol Reprod 1989; Biol Reprod 1989; 40: 40:

1027-1035. 1027-1035. Collas P, Robl JM. Collas P, JM Robl. Factors affecting the efficiency of nuclear transplantation in the rabbit embryo. Factors Affecting the efficiency of nuclear transplantation in the rabbit embryo. Biol Reprod 1990; Biol Reprod 1990; 43: 877-884. 43: 877-884. Plachot M, Mandelbaum J. Oocyte maturation, fertilization and embryonic growth in vitro. Plachot M J. Mandelbaum Oocyte maturation, fertilization and embryonic growth in vitro. British Med Bull 1990; British Med Bull 1990; 46: 675-694. 46: 675-694. Plachot M, Crozet N. Fertilization abnormalities in human in- vitro fertilization. Plachot M, Crozet N. Fertilization abnormalities in human in- vitro fertilization. Hum Reprod 1992; Hum Reprod 1992; 1: 89-94. 1: 89-94. Sathananthan AH, Tarin JJ, Gianaroli L, Ng SC, Dharmawardena V, Magli MC, Fernando R, Trounson AO. Sathananthan AH, Tarin JJ, Gianaroli L, Ng SC, Dharmawardena V, Magli MC, Fernando R, Trounson AO. Development of the human dispermic embryo. Development of the human embryo dispermic. Hum Reprod Update 1999; Hum Reprod Update 1999; 5: 553-560. 5: 553-560. Rosenbusch B, Schneider M, Sterzik K. The chromosomal constitution of multipronuclear zygotes resulting from in-vitro fertilization. Rosenbusch B, Schneider M, Sterzik K. The chromosomal constitution of multipronuclear RESULTING zygotes from in-vitro fertilization. Hum Reprod 1997; Hum Reprod 1997; 10: 2257-2262. 10: 2257-2262. Rosenbusch B, Schneider M, Sterzik K. Chromosomal analysis of multipronuclear zygotes obtained after partial zona disection of the oocytes . Rosenbusch B, Schneider M, Sterzik K. Chromosomal analysis of multipronuclear zygotes disection Obtained after partial area of the oocytes. Mol Hum Reprod 1998; Mol Hum Reprod 1998; 11: 1065-1070. 11: 1065-1070.

Lawler SD, Fisher RA, Dent J. A prospective genetic study of complete and partial hydatidiform moles. Lawler SD, Fisher RA, Dent J. A prospective study of genetic complete and partial hydatidiform moles. Am J Obstet Am J Obstet

Gynecol 1991; Gynecol 1991; 164: 1270-1277. 164: 1270-1277.

Edwards R, Crow J, Dale S. Preimplantation diagnosis and recurrent hydatidiform moles. Edwards R, Crow J, Dale S. Preimplantation diagnosis and recurrent hydatidiform moles. Lancet 1990; Lancet 1990; 335: 1030- 1031 . 335: 1030- 1031.

Kajii T, Ohama K. Androgenetic origin of hydatidiform mole. Kajii T, Ohama K. origin of hydatidiform mole Androgenetic. Nature 1977; Nature 1977; 268: 633-634. 268: 633-634.

Surti U, Szulman AE, O'Brien S. Complete (Classic) hydatidiform mole with 46,XY karyotype of paternal origin. Surti U, Szulman AE, S. O'Brien Complete (Classic) hydatidiform mole With 46, XY karyotype of paternal origin. Hum Genet 1979; Hum Genet 1979; 51: 153. 51: 153.

Comey CT, Koons BW, Presley KW, Smerick JB, Sobieralski CA, Stanley DM, Baechtel FS . CT Comey, Koons BW, Presley KW, Smerick JB, Sobieralski CA, Stanley DM, Baechtel FS. DNA extraction strategies for amplified fragment length polymorphism analysis. DNA extraction strategies for amplified fragment length polymorphism analysis. J Forensic Sci 1994; J Forensic Sci 1994; 39: 1254-1269. 39: 1254-1269.

Akane A, Matsubara K, Nakamura H, Takahashi S, Kimura K Identification of the heme compound copurified with DNA from bloodstains, a major inhibitor of PCR a plification. Akane A, Matsubara K, Nakamura H, Takahashi S, Kimura K Identification of the heme compound copurified DNA from bloodstains With, a major inhibitor of PCR plification. J Forensic Sci 1994; J Forensic Sci 1994; 39: 362-372. 39: 362-372. Feng YL, Gordon JW. Feng YL, Gordon JW. Birth of normal mice after removal of the supernumerary male pronucleus from polyspermic zygotes. Normal Birth of mice after removal of the supernumerary male pronucleus zygotes from polyspermic. Hum Reprod 1996; Hum Reprod 1996; 2: 341-344. 2: 341-344.

Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; Science 1998; 282: 1145-1147. 282: 1145-1147.

A it A, Carpenter MK, Inokuma MS, Chiu CP, Harris CP, Waknitz A it A, Carpenter MK, Inokuma MS, Chiu CP, CP Harris, Waknitz

MA, Itskovitz-Eldor J, Thomson JA. MA, Itskovitz-Eldor J, Thomson JA. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Clonally derived human embryonic stem cell lines pluripotency and proliferative potential Maintain for Prolonged periods of culture. Dev Biol 2000; Dev Biol 2000; 227: 271-278. 227: 271-278.

Reubinoff BE, Pera MF, Fong CY. Reubinoff BE, Pera MF, Fong CY. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol 2000; Nat Biotechnol 2000; 18: 399-404. 18: 399-404.

Citas de patentes
Patente citada Fecha de presentación Fecha de publicación Solicitante Título
WO1999043785A1 *26 Feb 19992 Sep 1999Medical College Of Hampton RoadsDerivation of cells and tissues from embryonic pre-stem cells for transplantation therapies
WO2001029206A1 *13 Oct 200026 Abr 2001Advanced Cell Technology, Inc.Methods of producing differentiated progenitor cells and lineage-defective embryonic stem cells
WO2002018549A1 *30 Ago 20017 Mar 2002Maria Biotech Co., Ltd.Human embryonic stem cells derived from frozen-thawed embryo
US4664097 *9 May 198412 May 1987The Wistar Institute Of Anatomy & BiologyNuclear transplantation in the mammalian embryo by microsurgery and cell fusion
US5843780 *18 Ene 19961 Dic 1998Wisconsin Alumni Research FoundationPrimate embryonic stem cells
Otras citas
Referencia
1 *GORDON J.W. ET AL: "Successful microsurgical removal of a pronucleus from tripronuclear human zygotes", FERTIL. STERIL., vol. 52, 1989, pages 367 - 372, XP002971798
2 *MALTER H.E. ET AL: "Embryonic development after microsurgical repair of polispermic human zygotes", FERTIL. STERIL., vol. 52, 1989, pages 373 - 380, XP002971797
3 *PRATHER ET AL: "Effects of cytochalasin b and demecolcine on freeze-thaw survival of murine embryos in vitro", JOURNAL OF EXPERIMENTAL ZOOLOGY, vol. 239, no. 1, July 1986 (1986-07-01), pages 37 - 40, XP002971779
4 *RAWLINS R.G. ET AL: "Microsurgical enucleation of tripronuclear human zygotes", FERTIL. STERIL., vol. 50, 1988, pages 266 - 272, XP002971778
5 *SIRACUSA ET AL: "The effect of microtubule and microfilament disrupting drugs on preimplantation mouse embryos", JOURNAL OF EMBRYOLOGY AND EXPERIMENTAL MORPHOLOGY, vol. 60, December 1980 (1980-12-01), pages 71 - 82, XP002971780
6 *TANG ET AL: "The parental origin of the distal pronucleus in dispermic human zygotes", ZYGOTE, vol. 1, 1994, pages 79 - 85, XP002971795
7 *WIKER S. ET AL: "Recognition of paternal pronuclei in human zygotes", J. IN VITRO FERTIL EMBRYO TRANSFER, vol. 7, 1990, pages 33 - 37, XP002971796
Citada por
Patente citante Fecha de presentación Fecha de publicación Solicitante Título
WO2005026332A1 *1 Sep 200424 Mar 2005Equipo Ivi Investigación, S.L.Generation of human embryonic stem cells from triploid zygotes
EP1516924A1 *17 Sep 200323 Mar 2005CNIC, Fundacion Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos IIIGeneration of human embryonic stem cells from triploid zygotes
EP1516925A1 *18 Sep 200323 Mar 2005CNIC, Fundacion Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos IIIGeneration of human embryonic stem cells from triploid zygotes
Clasificaciones
Clasificación internacionalC12N15/873, C12N5/0735
Clasificación cooperativaC12N15/873, C12N5/0606
Clasificación europeaC12N5/06B2P, C12N15/873
Eventos legales
FechaCódigoEventoDescripción
18 Sep 2003ALDesignated countries for regional patents
Kind code of ref document: A1
Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG
18 Sep 2003AKDesignated states
Kind code of ref document: A1
Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZM ZW
12 Nov 2003121Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
5 Feb 2004DFPERequest for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
20 Jul 2005122Ep: pct application non-entry in european phase
21 Jun 2006WWWWipo information: withdrawn in national office
Country of ref document: JP
21 Jun 2006NENPNon-entry into the national phase in:
Ref country code: JP