WO2003085107A1 - Cellules à génome modifié - Google Patents

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WO2003085107A1
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antibody
cells
antibody composition
sugar chain
fucose
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Naoko Ohnuki
Mitsuo Satoh
Katsuhiro Mori
Kazuya Yamano
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to an N-glycoside-linked complex type sugar chain, wherein the activity of an enzyme involved in sugar chain modification in which the 6-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end is lower or higher than that of the parent cell line.
  • the present invention relates to a cell whose genome has been modified so as to be deleted and a method for producing an antibody molecule using the cell. Background art
  • N-glycoside-type sugar chain binding sites There are two N-glycoside-type sugar chain binding sites in the Fc region of an antibody IgG molecule, and IgG in serum usually contains sialic acid or bisecting N-acetylethyl glucoside at these sites.
  • Complex-type sugar chains with multiple branches with little addition of samin are bound. It is known that there is diversity in the addition of galactose at the non-reducing end of this complex type sugar chain and the addition of fucose to N-acetyldarcosamine at the reducing end [Biochemistry] , 36, 130, 1997] o
  • sugar chain gene that is, a gene for a glycosyltransferase that synthesizes a sugar chain and a gene for a glycolytic enzyme that degrades a sugar chain.
  • the following describes the biosynthesis of N-daricoside-linked sugar chains.
  • Glycoproteins undergo sugar chain modification in the lumen of the endoplasmic reticulum (hereinafter referred to as ER).
  • ER endoplasmic reticulum
  • N-acetyldarcosamine transferase I GnTI
  • GnTII N-acetyldarcosamine transferase II
  • 1,6-fucosyltransferase 1,6-fucosyltransferase
  • the addition of fucose to the N-glycidyl-linked glycan at the reducing end of the N-glycoside-linked sugar chain of the antibody results in the antibody-dependent cytotoxicity of the antibody.
  • ADCC activity (Hereinafter referred to as ADCC activity) has been reported to change significantly
  • the present invention relates to the following (1) to (43).
  • 1,6-fucosinoretransferase is an enzyme involved in sugar chain modification in which fucose is connected to position 6 of fucose at position 6 of ⁇ ⁇ -glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal
  • the cell according to any one of (1) to (3).
  • al, 6-fucosyltransferase is a protein encoded by a DNA selected from the group consisting of the following (a), (b), (c) and (d).
  • the 1,6-fucosyltransferase is a protein selected from the group consisting of the following (a), (b), (c) (d), (e) and (f): ).
  • mouse myeloid cell line SP2 / 0-Agl4 cells (d) mouse myeloid cell line SP2 / 0-Agl4 cells; (e) BHK cells derived from Syrian hamster-kidney tissue;
  • the antibody-dependent cytotoxicity is high, and the antibody composition is one of all N-glycoside-linked complex type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition.
  • the 1-position of the fucose is located at the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the N-daricoside-linked complex-type sugar chain (3 ⁇ 4 The cell according to (14).
  • the antibody composition having a high antibody-dependent cytotoxicity activity is the N-acetyldarco at the reducing end of the sugar chain among all N-glycoside-linked complex type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition.
  • the antibody composition having a high antibody-dependent cytotoxicity activity is an antibody composition having no sugar chain by combining N-acetylglucosamine at the reducing end of sugar chain and fucose, (13) to ( 16.
  • a method for producing an antibody composition comprising using the cell according to any one of (10) to (: 17).
  • a method for producing an antibody composition comprising:
  • the antibody composition having a high antibody-dependent cytotoxicity is characterized in that, among all N-glycoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, N-acetyldarco at the reducing end of the sugar chain is used. (20) The method according to (20), wherein the ratio of sugar chains in which samin and fucose are not bound is higher than that of the antibody composition produced by the parent cell line.
  • the sugar chain to which fucose is not bound is a sugar chain in which the 1-position of the fucose is not a-linked to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the N-daricoside-linked complex type sugar chain. And (21).
  • An antibody composition having a high antibody-dependent cytotoxic activity is one of the complex N-dalicoside-linked sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition.
  • the antibody composition having a high antibody-dependent cytotoxic activity is an antibody composition having no sugar chain in which N-acetyldarcosamine at the sugar chain reducing end and fucose are bound,
  • the transgenic non-human animal is an animal selected from the group consisting of a red sea lion, a sheep, a goat, a pig, a poma, a mouse, a rat, a chicken, a monkey, and a heron.
  • the transgenic non-human animal according to any one of (27 :) to (29) is a plant or a body or a body fluid containing an antibody composition introduced from the bred animal or plant. And obtaining the antibody composition from the tissue or body fluid.
  • (31) Obtaining the antibody-producing cells of the transgenic non-human animal or plant or the progeny thereof according to any one of (26) to (29), and culturing the obtained antibody-producing cells in a medium And producing and accumulating the antibody composition in the culture, and collecting the antibody composition from the culture.
  • the antibody composition is an antibody composition having higher antibody-dependent cytotoxic activity than an antibody composition obtained from a non-human animal or plant whose genome has not been modified, or a progeny thereof. 30) or the method according to (31).
  • the antibody composition having a high antibody-dependent cytotoxicity is characterized in that, among all N-dalicoside-linked complex type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, N-acetyldarco at the reducing end of the sugar chain is used.
  • the ratio of a sugar chain in which samin and fucose are not bound is higher than that of an antibody composition obtained from a non-human animal or plant whose genome has not been modified, or a progeny thereof. the method of.
  • the sugar chain to which fucose is not bound is a sugar chain in which the 1-position of the fucose is not ⁇ -linked to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the N-daricoside-linked complex type sugar chain.
  • An antibody composition having a high antibody-dependent cytotoxic activity is characterized in that, among all N-daricoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, N-acetyldarco at the reducing end of the sugar chain is used.
  • the antibody composition having high antibody-dependent cytotoxic activity is an antibody composition having no sugar chain in which N-acetyldarcosamine at the sugar chain reducing end and fucose are bound, (32) to (35). Le, deviation or the method described in paragraph 1.
  • An antibody composition comprising an antibody molecule having an N-glycoside-linked sugar chain in the Fc region, wherein all the daricoside-linked complex-type bran chains which bind to the Fc region contained in the antibody composition are selected from the group consisting of: An antibody composition having a sugar chain, wherein fucose is not bound to N-acetyldaricosamine at the chain reducing end.
  • the sugar chain to which fucose is not bound is a sugar chain in which the 1-position of the fucose is not a-linked to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complexed bran chain.
  • a medicament comprising the antibody composition according to any one of (37) to (40) as an active ingredient.
  • the drug is a diagnostic, prophylactic or therapeutic agent for a disease associated with a tumor, a disease associated with allergy, a disease associated with inflammation, an autoimmune disease, a cardiovascular disease, a disease associated with a viral infection or a disease associated with a bacterial infection.
  • cells of the present invention the position of fucose at the 6th position of ⁇ ⁇ -acetylglucosamine at the reducing end of ⁇ -daricoside-linked complex type sugar chain,
  • hi 1,6-fucose modifying enzyme an enzyme involved in sugar chain modification that binds to ⁇
  • the parent cell is a cell before the method for reducing or deleting the activity of 1,6-fucose modifying enzyme is applied to the genome.
  • the parent cell is not particularly limited. For example, the following cells can be mentioned.
  • NS0 cells The parent cells of NS0 cells are described in the literature such as Bio / Technology (BI0 / TECHN0L0GY), 10, 169 (1992), Biotechnology. Bioengineering (Biotechnol. Bioeng.), 73, 261, (2001), etc. NS0 cells that have been used. Ma There are also NSO cell lines (RCB0213) registered with the RIKEN Cell Development Bank, or sublines obtained by adapting these strains to a growth medium.
  • the parental cells of SP2 / 0-Agl4 cells include, for example, Journal 'Op' Immunol. (J. Immunol.), 126, 317, (1981), Nature, 276, 269, (1978), Huyman ' SP2 / 0-Agl4 cells described in the literature such as Antiibodies 'and' Nodipuri Domas (Human Antibodies and Hybridomas), 3, 129, (1992). Also, there are SP2 / 0-Agl4 cells (ATCC CRL-1581) registered with the ATCC, or a substrain (ATCC CRL-1581.1) obtained by adapting these strains to a growth medium.
  • CH0 cells derived from Chinese hamster ovary tissue include Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968), Genetics, 55, 513 (1968). Chromosoma, 41, 129 (1973), Methods in Cell Science, 18, 115 (1996), Radiation Research, 148, 260 (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. 60, 1275 (1968), Cell, 6, 121 (1975), and Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (p883-900).
  • CH0-K1 strains ATCC CCL-61
  • DUXB11 strains ATCC CRL-9096
  • Pro- 5 strains ATCC CRL-1781 registered with the ATCC
  • commercially available CHO-S strains Lifetechnologies Cat # 11619
  • the parent cell line of the rat myeloma cell line YB2 / 3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 cell includes a cell line established from Y3 / Agl. 2.3 cell (ATCC CRL-1631). Specific examples thereof include YB2 / 3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 cells described in references such as J. Cell. Biol. 93, 576 (1982) and Methods Enzymol. 73B, 1 (1981). Is raised. Also, there are YB2 / 3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 cells (ATCC CRL-1662) registered with the ATCC, or substrains obtained by adapting these strains to a medium capable of growing.
  • a 1,6-Fucose-modifying enzyme is an enzyme that participates in the reaction in which the 6-position of N-acetyltilcosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex type sugar chain and the 1-position of fucose are ⁇ -linked. Such enzymes are also included.
  • the enzyme involved in the reaction in which the 6-position of ⁇ ⁇ -acetyl-darcosamine at the reducing end of ⁇ -glycoside-linked complex-type sugar chain and the 1-position of fucose are ⁇ -linked also includes an enzyme that affects the reaction. W
  • CK I, 6-fucose modifying enzyme examples include 1,6-fucosyltransferase ⁇ ⁇ -L-fucosidase.
  • the enzyme that influences the ⁇ - bonding reaction between the 6-position of ⁇ ⁇ -acetyldarcosamine at the reducing end of ⁇ -glycoside-linked complex type sugar chain and the 1-position of fucose is the aforementioned 1,6-fucose modifying enzyme Enzymes that affect the activity of the enzyme or that affect the structure of a substance serving as a substrate for the enzyme are also included.
  • the al, 6-fucosyltransferase includes a protein encoded by the DNA of the following (a;), (b), (c) or (d), or the following (e), (f) or (g): , (H), (i) or (j).
  • DNA that hybridizes under stringent conditions refers to, for example, colony hybridization using a DNA such as a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or a fragment thereof as a probe.
  • Chillon method This refers to DNA obtained by using the Lark hybridisation method or Southern blot'hybridization method. Specifically, using a filter on which DNA derived from colonies or plaques has been immobilized, a DNA filter is used.
  • the hybridizable DNA is a DNA having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more. % Or more, particularly preferably 95% or more, most preferably 98% or more.
  • one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5 comprise deletion, substitution, insertion and Z or an added amino acid sequence, and ⁇ 1,6-fucosyltransferase activity
  • a protein having the following structure is referred to as "Molecula monocroc Jung 2nd edition", “Kyrent Protocornoles 'in' Molecular Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985), etc.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and Z or added is one or more, and the number thereof is not particularly limited. Deletion, substitution, The number is such that it can be inserted or added, for example, 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.
  • a protein having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5 and having a 1,6-fucosyltransferase activity is defined as BLAST (J.
  • the protein is at least 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, and most preferably 99% or more.
  • the activity of an enzyme involved in sugar chain modification in which the 6-position of fucose is attached to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal is reduced or deleted from the parent cell line.
  • genome modification means that a mutation is introduced into the expression control region of the gene of the enzyme so as to decrease or delete the expression of the enzyme, or the genome is altered so as to reduce or delete the function of the enzyme.
  • This refers to introducing a mutation into the amino acid sequence of a gene.
  • Introducing a mutation refers to modifying a nucleotide sequence such as deletion, substitution, insertion and / or addition to a nucleotide sequence on the genome.
  • a cell in which a genomic gene is knocked out refers to a cell that completely suppresses the expression or function of the genomic gene.
  • a specific example of a cell in which a genomic gene has been knocked out is a cell in which all or part of a target gene has been deleted from the genome.
  • any method can be used as long as the desired genome can be modified, but a genetic method is preferable.
  • a specific method for obtaining such cells, any method can be used as long as the desired genome can be modified, but a genetic method is preferable. As a specific method,
  • Lectin-resistant cells are cells whose growth is not inhibited even when an effective concentration of lectin is given.
  • the effective concentration is the concentration above which the parent cell cannot grow normally. Yes, preferably at the same concentration as the concentration at which the parent cell cannot grow normally, more preferably
  • the effective concentration of lectin that it does not inhibit growth may be appropriately determined according to each cell line, usually 10 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 ⁇ 10. 0m g / ml, preferably 0. 5 to 2. Omg / Fill with ml.
  • a lectin that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex type sugar chain and the 1-position of fucose are bonded a lectin that can recognize the sugar chain structure If present, any lectin is included. Specific examples include Lentil lectin LCA (Lentil Agglutinin from Lens Culinaris), Endum bean lectin PSA (Pea Lectin from Pi sum sativum), Broad bean lectin VFA (Agglutinin from Vicia faba), and Hiirochiwan Takelectin AAL (Lectin from Aleuria aurantia) and the like.
  • Lentil lectin LCA Lientil Agglutinin from Lens Culinaris
  • Endum bean lectin PSA Pea Lectin from Pi sum sativum
  • Broad bean lectin VFA Adgglutinin from Vicia faba
  • the cells of the present invention may be any cells as long as they can express the antibody molecule, and include yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like. Specific examples of these cells are described below. Items listed in 3. Specific examples of animal cells include CH0 cells derived from Chinese hamster ovarian fibrous tissue, rat myeloma cell line YB2 / 3HL.P2Gil.16Ag.20 cell, mouse myeloma cell line NSO cell, mouse myeloma Cell line SP 2 / 0—Agl4 cells, Syrian hamster BHK cells derived from kidney tissue, antibody-producing hybridoma cells, human leukemia cell line Namalva cells, embryonic stem cells, fertilized egg cells, and the like.
  • the above-mentioned myeloma cells, hybridoma cells, host cells for producing humanized antibodies and human antibodies, and transcells other than humans that produce human antibodies are used in the production of the antibody composition.
  • Examples include embryonic stem cells or fertilized egg cells used for producing a digenic animal, and plant cells used for producing a transgenic plant producing a humanized antibody and a human antibody.
  • the cells of the present invention can produce an antibody product having higher ADCC activity than the antibody composition produced by the parent cell line.
  • the cell of the present invention is characterized in that, among all N-glycoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, N-acetyldarcosamine at the reducing end of the bran chain is bound to fucose. It is possible to produce an antibody composition in which the proportion of unlinked sugar chains is higher than that of the parent cell line.
  • the present invention relates to a method for producing an antibody composition, which comprises using the cell of the present invention.
  • the antibody composition refers to a composition comprising an antibody molecule having an N-glycoside-linked complex type sugar chain in the Fc region.
  • Antibodies are tetramers in which two types of polypeptide chains, a heavy chain and a light chain (hereinafter, referred to as “H chain” and “L chain”, respectively), are associated with each other by two molecules. About one-fourth of the N-terminal side of the H chain and about one-quarter of the N-terminal side of the L chain (each more than 100 amino acids) are called variable regions (hereinafter referred to as V regions). Rich and directly involved in antigen binding. Most of the part other than the V region is called the constant region (hereinafter referred to as C region). Antibody molecules are classified into IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE classes based on the homology of the C region.
  • the IgG class is further classified into IgG1 to IgG4 subclasses based on the homology of the C region.
  • the H chain is divided into four immunoglobulin domains, VH, CHI, CH2, and CH3, from the N-terminal side.There is a highly flexible peptide region called the hinge region between CH1 and CH2, which separates CH1 and CH2.
  • Can be The structural unit consisting of CH2 and CH3 after the hinge region is called the Fc region, to which N-glycoside-linked sugar chains are bound. This region is where the Fc receptor and complement bind. (Immunology Illustrated Original 5th edition, published February 10, 2000, Nankodo edition, Introduction to antibody engineering, January 25, 1994 First edition, Citizen Library).
  • N-glycoside-linked sugar chains have a basic common core structure as shown in the following structural formula (I) [Biochemical Experiments 23—Glycoprotein Glycan Research Method (Society Press Center), edited by Reiko Takahashi ( 1989)].
  • the N-glycoside-linked sugar chain may be any as long as it has the core structure of the above structural formula (I), but it may be a high mannose type in which only mannose is bonded to the non-reducing end of the core structure, It has one or more parallel branches of galactose-N-acetyl-cosamine (hereinafter referred to as Gal-GlcNAc) on the reducing end, and sialic acid and pi-secting N- on the non-reducing end of Gal_GlcNAc.
  • Examples include a complex type (complex type) having a structure such as acetilda lucosamine, and a hybrid type having both high mannose type and complex type branches on the non-reducing terminal side of the core structure.
  • the Fc region of the antibody molecule has a region in which N-glycoside-linked sugar chains bind one by one, two sugar chains are bound per antibody molecule. Since the N-glucoside-linked sugar chain that binds to the antibody molecule includes any sugar chain containing the core structure represented by the structural formula (I), two N-darcoside-linked sugar chains that bind to the antibody are included. Has many combinations of sugar chains.
  • the antibody composition produced using the cell of the present invention may be composed of an antibody molecule having a single sugar chain structure as long as the effects of the present invention can be obtained. Alternatively, it may be composed of antibody molecules having a plurality of different sugar chain structures.
  • an antibody composition obtained by the present invention preferably, among all the daricoside-bonded complex-type bran chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, N-acetyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain is used.
  • An antibody composition in which the ratio of sugar chains to which fucose is not bound is higher than that of an antibody composition produced by a parent cell whose genome has not been modified.
  • the product may be composed of an antibody molecule having a single sugar chain structure, or may be composed of a plurality of antibody molecules having different sugar chain structures, as long as the effects of the present invention can be obtained. Is also good.
  • an antibody composition preferably, sugars in which fucose is not bound to N-acetylethyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain among all glycoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition
  • An antibody composition whose chain ratio is higher than an antibody composition produced by a non-human animal or plant whose genome has not been modified, or a progeny thereof (hereinafter referred to as a parent individual) is exemplified.
  • Transgenic non-human animal or plant or a progeny thereof, whose genome has been modified so that the activity of the 1,6-fucose modifying enzyme is deleted or reduced, is an embryonic stem cell, fertilized egg cell, or plant cell It can be manufactured using.
  • the ratio of the sugar chain in which fucose is not bonded to N-acetyltyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain among the total N-daricoside-linked complex sugar chains binding to the Fc region contained in the antibody composition is as follows. For all N-glycoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the composition, The ratio of the number.
  • a sugar chain in which fucose is not bonded to N-acetyldarcosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain is defined as fucose that is linked to N-acetyldarcosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain.
  • a sugar chain that is not ⁇ -linked is exemplified.
  • the total N-daricoside-linked complex sugar chains binding to the Fc region contained in the antibody composition of the present invention is preferably 20% or more, more preferably 30% or more, still more preferably 40% or more, particularly preferably 5 °% or more, and most preferably 100%.
  • An antibody composition having a higher ADCC activity than the antibody composition produced by the parent cell line or the parent individual includes sugar chain reduction among all N-glycoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition.
  • the ratio of the sugar chain in which fucose is not bound to the terminal N-acetyltyldarcosamine is higher than the ratio of the antibody composition produced by the parent cell line or the parent individual.
  • an antibody composition in which the ratio is at least 2 times, preferably at least 3 times, more preferably at least 5 times, particularly preferably at least 10 times, is mentioned, and binds to an Fc region contained in the antibody composition.
  • an antibody composition in which all of the N-glycoside-linked complex-type sugar chains are sugar chains in which the 1-position of fucose is not bonded to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain.
  • an antibody composition in which all of the darcoside-linked complex-type sugar chains are sugar chains in which the 1-position of fucose is not bonded to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain Means that fucose is substantially undetectable in the sugar chain analysis described in 5 below.
  • the antibody composition obtained according to the present invention has higher ADCC activity than the antibody composition consisting of the antibody molecule produced by the parent strain or the parent individual.
  • ADCC activity means that in vivo, an antibody that binds to a cell surface antigen such as a tumor cell activates the effector cell through the binding between the antibody Fc region and the Fc receptor present on the surface of the effector cell.
  • a cell surface antigen such as a tumor cell
  • Examples of the effector cells include killer cells, natural killer cells, and macrophages that have been killed.
  • the proportion of sugar chains in which fucose is not bound to N-acetyltyldarcosamine at the sugar chain reducing end, which is contained in a composition comprising an antibody molecule having an N-daricoside-linked complex-type sugar chain in the Fc region, is determined by the ratio of the antibody Using known methods such as hydrazine decomposition and enzymatic digestion from molecules [Biochemical Experimental Method 23-Glycoprotein Glycosylation Research Method (Academic Press Center), Reiko Takahashi (ed., 1989)] It can be determined by labeling the chains with a fluorescent label or an isotope and separating the labeled sugar chains by a single chromatography method. It can also be determined by analyzing the released sugar chains by the HPAED-PAD method [Journal of Liquid 'Chromatography (J. Liq. Chromatogr.), 6, 1577 (1983)]. .
  • the antibodies of the present invention include an antibody that recognizes a tumor-associated antigen, an antibody that recognizes an allergy associated with inflammation, an antibody that recognizes an antigen that is associated with circulatory disease, and an antibody that recognizes an autoimmune disease.
  • An antibody that recognizes an antigen, or an antibody that recognizes an antigen associated with a virus or bacterial infection is preferable, and IgG is preferable as the antibody class.
  • Antibodies that recognize tumor-associated antigens include anti-GD2 antibody (Anticancer Res., 13, 331-336, 1993), anti-GD3 antibody (Cancer Immunol. Immunother., 36, 260-266, 1993), anti-GM2 antibody (Cancer Res., 54, 1511-1516, 1994), anti-HER2 antibody
  • Anti-basic fibroblast growth factor antibody Anti-basic fibroblast growth factor antibody, anti-FGF8 receptor antibody (J. Biol. Chem., 265, 16455-16463, 1990) , Anti-basic fibroblast growth factor receptor antibody, anti-insulin-like growth factor antibody (J. Neurosci. Res., 40, 647-659, 1995), anti-insulin-like growth factor receptor antibody (J. Neurosci. Res., 40, 647-659, 1995), anti-PMSA antibody (J.
  • Antibodies that recognize antigens associated with allergy or inflammation include anti-interleukin-6 antibody (Immunol. Rev., 127, 5-24, 1992) and anti-interleukin-6 receptor antibody (Molecular Immunol., 31, 371- 381, 1994), anti-interleukin 5 antibody (Immunol. Rev., 127, 5-24, 1992), anti-interleukin 5 receptor antibody, anti-interleukin 4 antibody (Cytokine, 3, 562-567, 1991) , Anti-interleukin-4 receptor antibody (J. Immunol.
  • anti-tumor necrosis factor antibody Hybridoma, 13, 183-190, 1994
  • anti-tumor necrosis factor receptor Antibody Molecular Pharmacol., 58, 237-245, 2000
  • anti-CCR antibody Nature, 400, 776-780, 1999
  • anti-chemokine antibody J. Immunol. Meth., 174, 249-257, 1994
  • Anti-chemoforce-in receptor antibody J. Exp.
  • Antibodies that recognize antigens associated with cardiovascular diseases include anti-GpIIb / IIIa antibodies (J. Immunol., 152, 2968-2976, 1994) and anti-platelet-derived growth factor antibodies (Science, 253, 1129—1132, 1991). ), Anti-platelet-derived growth factor receptor antibody (J. Biol. Chem., 272, 17400-17404, 1997) or anticoagulation factor antibody (Circulation, 101, 1158-1164, 2000).
  • Antibodies that recognize antigens associated with autoimmune diseases include anti-self DNA antibodies
  • Antibodies that recognize antigens associated with viral or bacterial infection include anti-gp120 antibody (Structure, 8, 385-395, 2000), anti-CD4 antibody (J. Rheumatology, 25, 2065-2076, 1998), anti-CCR4 Antibodies, anti-verotoxin antibodies (J. Clin.
  • autoimmune diseases psoriasis, rheumatoid arthritis, Crohn's disease, ulcerative colitis, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, etc.
  • Anti-CDlla antibody, anti-ICAM3 antibody, anti-CD80 antibody, anti-CD2 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-integrin ⁇ ; 4j3 7 antibody, anti-CD40L antibody, anti-IL-2 receptor antibody Immunology Today, 21 (8), 403-410
  • the antibody molecule includes any molecule that contains the Fc region of the antibody. Specific examples include an antibody, an antibody fragment, and a fusion protein containing an Fc region.
  • the antibody may be any protein that is produced in vivo by an immune reaction as a result of stimulation with a foreign antigen and has an activity of specifically binding to the antigen.
  • An antibody secreted by a hybridoma cell prepared from spleen cells of an immunized animal, an antibody prepared by gene recombination technology, that is, an antibody expression vector containing an antibody gene is introduced into host cells. Examples include acquired antibodies. Specific examples include antibodies, humanized antibodies, and human antibodies produced by hybridomas.
  • a hybridoma is a monoclonal antibody having a desired antigen specificity, obtained by cell fusion of B cells obtained by immunizing a mammal other than human with an antigen and myeloma cells derived from mice, rats, etc. Refers to cells that produce
  • humanized antibody examples include a human chimeric antibody and a human CDR-grafted antibody.
  • the human chimeric antibody is composed of a non-human animal H chain V region (hereinafter, also referred to as HV or VH) and an antibody L chain V region (hereinafter, also referred to as LV or VL) and a human antibody H chain C region (hereinafter, also referred to as LV or VL).
  • HV or VH non-human animal H chain V region
  • LV or VL antibody L chain V region
  • LV or VL human antibody H chain C region
  • CL human antibody H chain C region
  • Non-human animals include mice, rats, and c. Anything can be used as long as it is possible to produce a high-priority dorma, such as a muster or a heron.
  • a human chimeric antibody is obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL from a hybridoma producing a monoclonal antibody, and converting the cDNAs into host cell expression vectors having genes encoding human antibody CH and human antibody CL, respectively.
  • a human-type chimeric antibody expression vector can be constructed by insertion and expressed and produced by introducing it into a host cell.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any CH as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter, referred to as hlg), but is preferably of the hlgG class, and furthermore, hIgGl, hIgG2, Any of the subclasses hIgG3 N hIgG4 can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody may be any CL as long as it belongs to hlg, and a ⁇ class or L class can be used.
  • the human CDR-grafted antibody refers to an antibody obtained by grafting the amino acid sequence of CDRs of VH and VL of an antibody of a non-human animal to an appropriate position of VH and VL of a human antibody.
  • the human CDR-grafted antibody is constructed by constructing a cDNA encoding the V region obtained by grafting the VH and VL CDR sequences of a non-human animal antibody to the VH and VL CDR sequences of a desired human antibody.
  • the human CDR-grafted antibody expression vector is constructed by inserting the expression vector into a host cell expression vector having the genes encoding the CH and the human antibody CL, and the expression vector is introduced into the host cell.
  • the transplant antibody can be expressed and manufactured.
  • the CH of the human CDR-grafted antibody may be any CH as long as it belongs to hlg, but the hlgG class is preferable, and any subclass such as hIgGl, hIgG2, gG3, hIgG belonging to the hlgG class may be used. it can.
  • the CL of the human-type CDR-transplanted antibody may be any CL as long as it belongs to hlg, and may be of the ⁇ class or the ⁇ ⁇ ⁇ class.
  • a human antibody originally refers to an antibody naturally occurring in a human body.
  • a human antibody phage library and a human antibody phage library produced by recent advances in genetic, cell engineering, and developmental engineering techniques have been developed. Also included are antibodies obtained from transgenic non-human animals producing human antibodies or transgenic plants producing human antibodies.
  • Antibodies present in the human body can be obtained, for example, by isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting EB virus and the like, immortalizing them, and cloning the cells to produce the antibody-producing lymphocytes.
  • the antibody can be further purified.
  • the human antibody phage library 1 is a library in which antibody fragments such as Fab and single-chain antibodies are expressed on the phage surface by inserting an antibody gene prepared from human B cells into the phage gene. From the library, phage expressing an antibody fragment having the desired antigen-binding activity can be recovered using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index.
  • the antibody fragment can be further converted to a human antibody molecule consisting of two complete H chains and two complete L chains by genetic engineering techniques.
  • the human antibody-producing transgenic non-human animal refers to a non-human animal in which a human antibody gene has been integrated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic animal can be produced by introducing a human antibody gene into mouse embryonic stem cells, transplanting the embryonic stem cells into an early embryo of another mouse, and then developing the embryonic stem cells. it can.
  • a transgenic non-human animal that produces a human antibody can be produced by introducing a human antibody gene into a fertilized egg of an animal and generating the fertilized egg.
  • a method for producing a human antibody from a human antibody-producing non-transgenic nonhuman animal is performed by obtaining a human antibody-producing hybridoma by a conventional method for producing a hybridoma in a mammal other than a human, and culturing the antibody. Human antibodies can be produced and accumulated in the culture.
  • transgenic non-human animals examples include porcupines, sheep, goats, goats, stags, pomas, mice, rats, chickens, monkeys, and egrets.
  • the antibody may be an antibody that recognizes a tumor-associated antigen, an antibody that recognizes an allergy or an inflammation-related antigen, an antibody that recognizes a circulatory disease-related antigen, an autoimmune disease-related antigen
  • the antibody is an antibody that recognizes an antigen, or an antibody that recognizes an antigen associated with a virus or bacterial infection.
  • a human antibody whose antibody class is IgG is preferable.
  • the antibody fragment refers to a fragment containing at least a part of the Fc region of the antibody.
  • the Fc region means a C-terminal region of the H chain of an antibody, a CH2 region and a CH3 region, and includes a natural type and a mutant type thereof.
  • At least a part of the Fc region preferably refers to a fragment containing the CH2 region, more preferably a region containing the first aspartic acid present in the CH2 region.
  • antibody fragments include H chain monomers and H chain dimers.
  • a fusion protein having a part of the Fc region is a substance obtained by fusing an antibody or a fragment of an antibody containing a part of the Fc region of an antibody with a protein such as an enzyme or cytokin (hereinafter referred to as Fc Fusion protein).
  • the cells of the present invention can be prepared by the method described below.
  • the cells of the present invention can be prepared by targeting the gene for the ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme and using a gene disruption method.
  • Examples of the enzyme in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of ⁇ -glycidyl-linked glycan at the 6-position of ⁇ -glycoside-linked complex type sugar chain are specifically al, 6-fucosyltransferase, Fucosidase and the like.
  • the method for gene disruption includes any method capable of disrupting the gene of the target enzyme. Examples thereof include a homologous recombination method, an RNA-DNA oligonucleotide (RDO) method, a method using retrovirus / less, a method using transposon, and the like. Hereinafter, these will be described in detail.
  • RDO RNA-DNA oligonucleotide
  • the cells of the present invention can be prepared by targeting the gene of the 1,6-fucose modifying enzyme and modifying the target gene on the chromosome using the homologous recombination method.
  • Modification of the target gene on the chromosome can be performed using the method described in the Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor laboratory Press (1994) (hereinafter, ⁇ manipulating the mouse Embryo A laboratory laboratory ''). Yuanore ”), Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), Biomanual Series 8 Gene Targeting, Production of Mutant Mice Using ES Cells, Yodosha (1995) (hereinafter The method can be performed as follows, for example, by using the chromosome engineering technique described in “Generation of mutant mouse using ES cells”). a Obtain cDNA of 1,6-fucose modifying enzyme.
  • a genomic DNA of al, 6-fucose modifying enzyme is prepared.
  • a target vector for homologous recombination of a target gene to be modified eg, a structural gene of al, 6-fucose modifying enzyme or a promoter gene.
  • the host cell of the present invention can be prepared by introducing the prepared target vector into a host cell and selecting a cell in which homologous recombination has occurred between the target gene and the target vector.
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like can be used as long as it has the gene of the target a1,6-fucose modifying enzyme.
  • Specific examples include the cells described in 3. below.
  • Methods for obtaining cDNA and genomic DNA of a 1,6-fucose modifying enzyme include, for example, the methods described below.
  • a cDNA library is prepared from the prepared total RNA or mRNA.
  • a degenerative primer was prepared. Obtain a gene fragment encoding the 1,6-fucose modifying enzyme.
  • the cDNA library can be screened to obtain cDNA encoding a1,6-fucose modifying enzyme.
  • MRNA of various host cells may be commercially available (for example, manufactured by Clontech), or may be prepared from various host cells as described below.
  • Methods for preparing total RNA from various host cells include guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)], guanidine acid thiocyanate. Phenol 'Cloth Holm (AGP C) method [Analytical' Analytical Biochemistry, 162, 156 (1987); Experimental Medicine, 9, 1937 (1991)].
  • AGP C Phenol 'Cloth Holm
  • mRNA as poly (A) + RNA from total RNA an oligo (dT) -immobilized cellulose column method (Molecular Clawing, 2nd edition) and the like can be mentioned.
  • mRNA can be prepared by using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen) or Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen) or Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • CDNA libraries are prepared from the prepared host cell mRNAs.
  • Methods for preparing a DNA library include the methods described in Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current-Protocols in Molecular-Norology, A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989), or Examples thereof include a method using a commercially available kit, for example, a Superscript Plasmid System ior cDNA Synthesis and Plasmia Coating (manufactured by Life Technologies) and a ZAP-cDNA Synthesis Kit (manufactured by STRATAGENE).
  • any phage vector, plasmid vector, or the like can be used as long as it can replicate autonomously in the Escherichia coli K12 strain.
  • ZAP Express [Stratagies, Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research], 17, 9494 (1989)], Lambda ZAP II (manufactured by STRATAGENE); LgtlO, ⁇ gtll [DNA cloning, A practical approach], 1, 9 (1985)], XTriplEx (Clontech), ExCell (Pharmacia), pT7T318U (Pharmacia), pcD2 [Molecular 'Cellular' Biology (Mol. Cell. Biol.), 3, 280 (1983)] and pUC18 [Gene (Gene ), 33, 103 (1985)].
  • Escherichia coli As a host microorganism for producing a cDNA library, any microorganism can be used, but Escherichia coli is preferably used. Specifically, Escherichia coli XL1-Blue MRF '[Stratagies, 5, 81 (1992)], Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] , Escherichia coli Y1088 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli NM522 [Giananole 'ob. (J. Mol.
  • This cDNA library may be used as is for subsequent analysis, but in order to reduce the proportion of incomplete-length cDNA and obtain full-length cDNA as efficiently as possible, the oligocap method developed by Sugano et al. [Gene ( Gene), 138, 171 (1994); Gene, 200, 149 (1997); Protein nucleic acid enzyme, 41, 603 (1996); Experimental medicine, 11, 2491 (1993); (1996); Production of Gene Library (Yodosha) (1994)].
  • the fact that the obtained gene fragment is DN ⁇ encoding ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme can be determined by a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the dideoxy method of Sanger et al. Using a base sequence analyzer such as 'National' Academy 'of Science' (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1977)] or AB IPRIS M377 DNA Sequencer (manufactured by PE Biosystems). Can be confirmed by analysis.
  • cDNA or a cDNA library pair synthesized from mRNA contained in various host cells is subjected to colony hybridization and plaque hybridization (molecular cloning second edition). al, DNA of 6-fucose modifying enzyme can be obtained.
  • a cDNA or cDNA library synthesized from mRNA contained in various host cells was used as a By performing screening using the PCR method, the DNA of al, 6-fucose modifying enzyme can also be obtained. From the end, the nucleotide sequence of D ⁇ encoding the obtained 1,6-fucose modifying enzyme was analyzed from the end by a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the didoxy method of Sanger et al. National 'Academy' of Science '(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1977)] or AB IPRI SM377D NA Sequencer (manufactured by PE Biosystems). By doing so, the nucleotide sequence of the DNA is determined.
  • a base sequence database such as GenBank, EMBL, and DDBJ is searched using a homology search program such as BLAST, so that the database Among the genes, the gene encoding the a 1,6-fucose modifying enzyme can also be determined.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the 1,6-fucose modifying enzyme obtained by the above method includes, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
  • Enzyme cDNA can also be obtained.
  • Examples of a method for preparing genomic DNA of ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme include the following methods. Preparation of Genome DN II
  • genomic DNA of c ⁇ l, 6-fucose modifying enzyme can be isolated by using a genomic DNA library screening system (Genome Systems) or Universal GenomeWalker TM Kits (CL0NTECH).
  • the base sequence of the genomic DNA of the ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme obtained by the above method includes, for example, the base sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Target vectors for homologous recombination of the target gene are as follows: Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), Neu-Shi Manual Manual Series 8 Gene Targeting, Generation of Mutant Mice Using ES Cells ( (Yodosha) (19%).
  • Target The cut vector can be used in either a replacement type or an insertion type.
  • the method for introducing a recombinant vector suitable for various cells described in 3. below can be used.
  • Examples of methods for efficiently selecting homologous recombinants include, for example, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), Nozuma-manual series 8 Gene targeting, and mutant mouse using ES cells. For example, methods such as positive selection, promoter selection, negative selection, and poly A selection described in Production (Yodosha) (1995) can be used. Methods for selecting the desired homologous recombinant from the selected cell lines include the Southern hybridization method for genomic DNA (molecular cloning, second edition) and the PCR method [PCR Protocols (PCR Protocols)]. ), Academic Press (1990)].
  • homologous recombinants were obtained by using as an index the change in enzyme activity related to sugar chain modification in which the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the N-daricoside-linked sugar chain and the 1-position of fucose are ⁇ -linked. You can also. As a specific method, for example, a method for selecting a transformant described below can be mentioned. How to select transformants
  • Biochemical methods include, for example, a method of evaluating enzyme activity using an enzyme-specific substrate.
  • Examples of the genetic engineering method include Northern analysis for measuring the amount of mRNA of an enzyme gene and the RT-PCR method.
  • Methods for selecting cells based on changes in traits resulting from reduced activity of a 1,6-fucose modifying enzyme include, for example, selecting transformants using the bran chain structure of a produced antibody molecule as an index. And a method of selecting a transformant using the sugar chain structure of a glycoprotein on the cell surface as an index. Examples of a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index include the method described in 5. below.
  • a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of a glycoprotein on the cell surface as an index is as follows. The 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked sugar chain and the 1-position of fucose are ⁇ -linked.
  • a method for selecting a strain that is resistant to a lectin that recognizes a sugar chain structure can be mentioned. Specific examples thereof include a method using a lectin described in Somatake 'Cell' and 'Molecular' Genetics, 12, 51 (1986).
  • any lectin can be used as long as it recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the N-daricoside-linked sugar chain and the 1-position of fucose are ⁇ -linked.
  • Lentil Lectin LCA Lientil Agglutinin from Lens Culinaris
  • Enduma Lectin PSA Pea Lectin from Pi sum sativum
  • Broad Bean Lectin VFA Adgglutinin from Vicia faba
  • AAL Aleuriaur from Aloiaur Lectin
  • Cells can be selected.
  • the cells of the present invention can be prepared as follows, for example, using the RDO method, targeting the gene of the 1,6-fucose modifying enzyme.
  • the base sequence of the prepared cDNA or genomic DNA is determined. Based on the determined DNA sequence, design and synthesize an RDO construct of an appropriate length, including the portion encoding the al, 6-fucose modifying enzyme, the untranslated region, or the intron.
  • the synthesized RDO into a host cell enzymes that target, i.e. by selecting a transformant mutations in alpha 1,6-fucose modifying enzyme produced can Seisuru cells action of the present invention .
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like can be used as long as it has the gene of the target ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme.
  • Specific examples include the host cells described in 3. below.
  • Examples of a method for preparing cDNA of the ⁇ , 6-fucose modifying enzyme include the “method for preparing cDNA” described in (a) of (1) above.
  • the DNA sequence of DNA is digested with an appropriate restriction enzyme and the like, cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene), and analyzed by a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, dideoxy by Sanger et al. Method [Proceding of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 74, 5463 (1977)]
  • the base sequence of the DNA can be determined by analysis using ALF DNA Sequencer (Pharmacia) or the like.
  • RDO can be prepared by a conventional method or by using a DNA synthesizer.
  • Methods for introducing RDO into host cells and selecting cells in which the gene for the targeted enzyme, ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme, has been mutated include molecular 'cloning second edition, current' protocols 'in'. Examples include a method for directly detecting a mutation of a gene on a chromosome described in Molecular 'Biology and the like.
  • the cells of the present invention can be prepared by using the transposon system described in Nature Genet., 25, 35, (2000), etc., for the activity of ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme, or for the production of antibody molecules or on the cell membrane. By selecting a mutant using the sugar chain structure of the glycoprotein as an index, the cell of the present invention can be produced.
  • the transposon system is a system in which a foreign gene is randomly introduced into a chromosome to induce mutation.
  • a foreign gene contained in a transposon is used as a vector to induce mutation, and this gene is At the same time, a transposase expression vector for randomly introducing chromosomes into the chromosome is introduced into cells.
  • transposase Any transposase can be used as long as it is suitable for the sequence of the transposon to be used.
  • any gene can be used as long as it can induce mutation in the DNA of a cell.
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like can be used as long as they have the gene of the targeted ⁇ 1,6_fucose modifying enzyme.
  • Specific examples include the host cells described in 3. below.
  • the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 3. below can be used.
  • a method for selecting a mutant using the activity of ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme as an index for example, a method for changing the activity of al, 6 -fucose modifying enzyme described in (a) of (1) above is used. "A method for selecting a transformant" is used as an index.
  • the cells of the present invention target (3 ⁇ 41,6-fucose-modifying enzyme-encoding gene, cell engineering, 12, 239, (1993), bio-Z technology (BI0 / TECHN0L0GY), 17, 1097, ( 1999), Hum. Mol. Genet., 5, 1083, (1995), Cell Engineering, 13 ⁇ 4 255, (1994), Proceedings 'Ob the National' Academia. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1886 (1999) and the like, using the antisense method or the ribozyme method, for example, can be prepared as follows.
  • the nucleotide sequence of the prepared cDNA or genomic DNA is determined.
  • an antisense gene or ribozyme construct of an appropriate length including a translated region, untranslated region or intron portion of the target gene is designed.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the prepared DNA fragment or full length downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • the cells of the present invention can be obtained by selecting a transformant using the activity of the protein encoded by the target gene as an indicator.
  • the cells of the present invention can also be obtained by selecting a transformant using the sugar chain structure of the glycoprotein on the cell membrane or the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index.
  • any cell having a target gene such as yeast, animal cells, insect cells, and plant cells
  • yeast, animal cells, insect cells, and plant cells can be used.
  • specific examples include the host cells described in 3. below.
  • an expression vector it can replicate autonomously in the above host cells or can be integrated into the chromosome, and transcribe the designed antisense gene or ribozyme. Those containing a promoter at the position where they can be used are used.
  • Specific examples include the expression vectors described in 3. below.
  • the method for introducing a gene into various host cells As a method for introducing a gene into various host cells, the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in the following section 3 can be used.
  • Methods for obtaining cDNA and genomic DNA of the target gene include, for example, “method for preparing cDNA” and “method for preparing genomic DNA” described in (a) of (1) above. Is raised.
  • Examples of a method for selecting a transformant using the activity of the protein encoded by the target gene as an index include the “method for selecting a transformant” described in (a) of (1) above.
  • Methods for selecting cells based on changes in traits resulting from reduced activity of the protein encoded by the target gene include, for example, selecting transformants using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index, and selecting a transformant.
  • a method of selecting a transformant using the sugar chain structure of a glycoprotein on the cell surface as an index is exemplified. Examples of a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index include the method described in 5. below.
  • the cells of the present invention can also be obtained by directly introducing an antisense oligonucleotide or lipozyme designed based on the base sequence of the target gene without using an expression vector into a host cell.
  • the antisense oligonucleotide or ribozyme can be prepared by a conventional method or by using a DNA synthesizer. Specifically, of the base sequences of the cDNA and genomic DNA of the target gene, a sequence corresponding to 5 to 150 consecutive bases, preferably 5 to 60 bases, and more preferably 10 to 40 bases. It can be prepared by synthesizing an oligonucleotide (antisense oligonucleotide) corresponding to a sequence complementary to the oligonucleotide or a ribozyme containing the sequence of the oligonucleotide based on the sequence information of the oligonucleotide. Oligonucleotides include oligo RNAs and derivatives of the oligonucleotides (hereinafter referred to as oligonucleotide derivatives).
  • oligonucleotide derivative examples include an oligonucleotide derivative in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and a phosphodiester bond in an oligonucleotide in which N 3′—P 5 ′ phosphoramidate is used.
  • Oligonucleotide derivative converted to bond Oligonucleotide derivative in which report and phosphodiester bond in oligonucleotide are converted to peptide nucleic acid bond, and peracyl in oligonucleotide substituted with C-15 propynyl peracyl
  • Oligonucleotide derivatives Oligonucleotide derivatives, oligonucleotide derivatives in which peracyl in oligonucleotides are substituted with C-15 thiazole peracyl, oligonucleotide derivatives in which cytosines in oligonucleotides are substituted with C-15 propynylcytosine, oligonucleotides
  • Oligonucleotide derivative in which cytosine in the product is replaced with phenoxazine-modified cytosine
  • the cells of the present invention can be prepared using the RNAi (RNA interference) method targeting the gene encoding the protein of the present invention, for example, as follows.
  • the RNAi method is a method in which double-stranded RNA is introduced into cells, and mRNA homologous to the RA sequence present in the cells is degraded and broken to suppress gene expression.
  • the base sequence of the prepared cDNA is determined.
  • ⁇ which is a part of the translation region of the target gene, designs an RNAi gene construct of an appropriate length including a part of the untranslated region.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the prepared DNA fragment or its full length downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • the cells of the present invention can be obtained by selecting a transformant based on the activity of the protein encoded by the target gene or the sugar chain structure of the produced antibody molecule or the glycoprotein on the cell surface.
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like that have the target gene can be used. Specific examples include the host cells described in 3. below.
  • the expression vector those which can replicate autonomously in the above-mentioned host cells or can be integrated into the chromosome, and which contain a promoter at a position where the designed RNAi gene can be transcribed are used.
  • Specific examples include an expression vector of a type in which transcription is performed by polymerase III or an expression vector described in 3. below.
  • Examples of a method for selecting a transformant using the activity of the protein encoded by the target gene as an index or a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as an index include, for example, the method described in the above 1 ( The method described in (a) of 1) can be used.
  • Examples of a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index include the method described in 5. below.
  • Examples of the method for preparing cDNA of the protein encoded by the target gene include the “method for preparing cDNA” described in (1) (a) above.
  • the cells of the present invention can also be obtained by directly introducing the RNAi gene designed based on the base sequence of the target gene without using an expression vector into a host cell.
  • the RNAi gene can be prepared by a conventional method or by using a DNA synthesizer.
  • RNAi gene construct is described in [Nature, 391, 806, (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 15502, (1998); Nature, 395, 854, (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049, (1999); Cell, 95, 1017, (1998); Proceedings' of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 1451, (1999); The 'National' Academy 'of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 13959, (1998); Nature's Cell's Pyology (Nature Cell Biol.), 2, 70, (2000)] Etc. can be designed.
  • the RA used in the RNAi method of the present invention includes an enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing terminal of N-dalicoside-linked complex type sugar chain.
  • RNA corresponding to the DNA encoding the protein can be mentioned.
  • New - grayed glycosidic bond in a complex type sugar chain enzyme proteins involved in the 1-position force S alpha binding to sugar chain modification of ⁇ - the 6-position of ⁇ cetyl Darco Sa Min fucose reducing end, shed 1, 6 - fucosyl transflector RNA corresponding to DNA that is erase is included.
  • RNA used in the RNAi method of the present invention is a double-stranded RNA that is composed of RNA and its phase capture RNA and is capable of reducing the mRNA amount of al, 6-fucosyltransferase. Any length may be used as long as the length of the RNA is preferably 1 to 30, more preferably 5 to 29, further preferably 10 to 29, and most preferably 15 to 29. RNA.
  • the cells of the present invention are prepared by targeting a 1,6-fucose modifying enzyme and using a technique of introducing a dominant negative body of the protein. Can be made.
  • a specific example of a dominant negative body is an example of a protein involved in transport of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus.
  • the intracellular sugar nucleotide transporter functions by forming a dimer on the membrane of the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus [Journal of Biological 'Chemistry (J. Biol. Chem.), 275, 17718, 2000].
  • intracellular sugar nucleotide transporter mutants by forcibly expressing intracellular sugar nucleotide transporter mutants in cells, they form heterodimers with wild-type transporters, and the formed heterodimers exhibit inhibitory activity against wild-type homodimers. [Journal of Biological 'Chemistry (J. Biol. Chem.), 275, 17718, 2000]. Therefore, by producing a mutant of the intracellular sugar nucleotide transporter and introducing it into the cell, it is possible to function as a dominant negative form. The generation of such mutants is described in Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current
  • the cells of the present invention were prepared using the dominant-negative gene of the 1,6-fucose modifying enzyme prepared as described above, using molecular 'Clawing 2nd ed., Current'protocols' in 'Molekiura' ⁇ biology, According to the method for gene transfer described in Manipulating, Mouse, and Embryo, 2nd edition, for example, it can be prepared as follows.
  • a DNA fragment having an appropriate length containing a portion encoding the protein is prepared.
  • a recombinant vector is prepared.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • the host cells of the present invention can be prepared by selecting transformants based on the activity of the 1,6-fucose modifying enzyme or the sugar chain structure of the produced antibody molecule or the glycoprotein on the cell membrane.
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like can be used as long as they have the gene of the target protein. Specific examples include the host cells described in 3. below.
  • the expression vector those which can replicate autonomously in the above-mentioned host cells or can be integrated into the chromosome, and which contain a promoter at a position where DNA encoding the dominant negative body of interest can be transcribed are used. Specific examples include the expression vectors described in 3. below.
  • the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 3. below can be used.
  • a method for selecting a mutant using the activity of the target protein as an index or a method for selecting a mutant using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as an index, for example, the method described in the above 1 (1) Method.
  • a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index include the method described in 4. below.
  • the cells of the present invention can be prepared by introducing a mutation into the gene of the 1,6-fucose modifying enzyme and selecting a desired cell line in which the enzyme has been mutated.
  • Examples of the enzyme in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the N-daricoside-linked complex type sugar chain specifically, 1,6-fucosyltransferase, and -L-fucosidase and the like.
  • mutants obtained by treating the parent cell line in the mutagenesis treatment or from naturally occurring mutants using the change in ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme activity as an index
  • a desired cell line from the mutant or spontaneously generated mutant obtained by treating the parent cell line by mutagenesis using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index.
  • a desired structure is obtained by using the sugar chain structure of a glycoprotein on the cell membrane of the cell as an index. Examples include a method for selecting a cell line.
  • any treatment can be used as long as it induces a point mutation, a deletion or a frame shift mutation in the DNA of the parent cell line.
  • Specific examples include treatment with ethyl ditrosperia, nitrosoguanidine, benzopyrene, and atharidin dye, and irradiation with radiation.
  • various alkylating agents and carcinogens can also be used as mutagens. Examples of the method of causing a mutagen to act on cells include, for example, the third edition of tissue culture technology (Asakura Shoten), edited by The Japanese Society for Tissue Culture (1996), Nature Genet., 24, 314, (2000).
  • Spontaneously occurring mutants include those spontaneously generated by continuing subculture under normal cell culture conditions without special mutagenesis treatment. .
  • a method for selecting a desired cell line using the change in ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme activity as an index a method for selecting a desired cell line using the sugar chain structure of a produced antibody molecule as an index, a sugar chain of a glycoprotein on a cell membrane
  • a method for selecting a desired cell line using the structure as an index for example, the method described in (1) (1) (a) above, which is based on the change in ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme activity described in (1) above, is used.
  • Method for selecting transformants ”.
  • the host cell of the present invention targets an ⁇ , 6-fucose modifying enzyme gene and uses antisense RNA / DNA technology [Bioscience and Industry, 50, 322 (1992), Chemistry,, 681 (1991), Biotechnology, 9, 358 (1992), Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992), Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992), Cell Engineering, l ⁇ , 1463 (1997)], triple helicopter It can be prepared by suppressing the transcription or translation of a target gene using the X-ray technology [Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992)] and the like.
  • the transgenic non-human animal or plant or the progeny thereof, in which the genomic gene is modified so that the activity of the enzyme involved in the modification of the sugar chain of the antibody molecule of the present invention is controlled, is an ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme
  • the gene can be produced from the embryonic stem cell, fertilized egg cell, or plant cell prepared by the method described in 1. using a known method.
  • Examples of an enzyme in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of ⁇ ⁇ -acetyldarcosamine at the reducing end of ⁇ -glycoside-linked complex-type sugar chain include a 1,6-fucosyltransferase, a _L_fucosidase and the like.
  • the target non-human animals for example, embryonic stem cells such as porcupines, sheep, goats, stags, pomas, mice, rats, chicks, monkeys, and egrets, are described in 1.
  • embryonic stem cells of the present invention in which the activity of al, 6-fucose modifying enzyme is controlled can be produced.
  • a gene encoding al, 6-fucose modifying enzyme on a chromosome can be obtained by a known homologous recombination technique [eg, Nature, 326, 6110, 295 (1987), Cell, 51, 3, 503 ( 1987) etc.], and a mutant clone inactivated or substituted with an arbitrary sequence.
  • a mutant clone inactivated or substituted with an arbitrary sequence.
  • embryonic stem cells for example, the mutant clone
  • a chimeric individual consisting of a sex stem cell clone and normal cells by a technique such as injection chimera method or assembly chimera method of injecting animal fertilized eggs into blastocysts. Can be prepared.
  • a transgenic non-human animal having reduced a1,6-fucose modifying enzyme activity in whole body cells By crossing the chimeric individual with a normal individual, a transgenic non-human animal having reduced a1,6-fucose modifying enzyme activity in whole body cells can be obtained.
  • the target vector for homologous recombination of the target gene is prepared according to the method described in Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), Production of Mutant Mouse Using ES Itoda Tsukiha, etc. be able to.
  • As the target vector any of a replacement type, an insertion type, and a gene trap type can be used.
  • any method for introducing a target vector into embryonic stem cells any method can be used as long as it introduces DNA into animal cells.
  • electroporation method Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2-227075
  • riboxoxy method procedures 'ob''the' national 'akademiobu' science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 84, 7413 (1987)]
  • injection method manipulating 'mouse' Employ second edition
  • the method using a particle gun (gene gun) Japanese Patent No.
  • Methods for efficiently selecting homologous recombinants include, for example, positive selection and promoter described in Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), production of mutant mice using ES Itoda vesicle, etc. Methods such as selection, negative selection, and poly A selection can be used. Specifically, in the case of a target vector containing the hprt gene, after introduction into the embryonic stem cells lacking the hprt gene, the embryonic stem cells are cultured in a medium containing aminopterin, hypoxanthine and thymidine, and aminobuterin is obtained. By selecting resistant strains, positive selection for selecting homologous recombinants containing the hprt gene can be performed.
  • a target vector containing the neomycin resistance gene embryo-derived stem cells into which the vector has been introduced are cultured in a G418-containing medium, and G418-resistant strains are selected to select homologous recombinants containing the neomycin resistance gene. Positive selection can be performed.
  • a target vector containing the DT gene embryonic stem cells into which the vector has been introduced are cultured, and the growing strain is selected. (Recombinants randomly inserted into the chromosome other than homologous recombination have the DT gene in the chromosome.
  • embryonic stem cells When embryonic stem cells are incorporated into a fertilized egg by using the chimeric assembly method, it is generally preferable to use a fertilized egg at a developmental stage before the 8-cell stage. When embryonic stem cells are incorporated into a fertilized egg using the injection chimera method, it is generally preferable to use a fertilized egg from the 8-cell stage to the stage of blastocyst development.
  • LHRH fertilizing hormone-releasing hormone
  • the method described in 1 above should be used for fertilized egg cells of the target non-human animal, for example, a porcupine, a sheep, a goat, a pig, a poma, a mouse, a rat, a chicken, a monkey, a rabbit, etc.
  • the fertilized egg cell of the present invention in which the activity of the 1,6-fucose modifying enzyme has been reduced can be produced.
  • the resulting fertilized egg cells are transplanted into the oviduct or uterus of a pseudopregnant female using the method of embryo transfer described in Manipulating 'Mouse' Embrio, 2nd edition, etc. to give birth to 1,6-fucose.
  • Transgenic non-human animals with reduced activity of the modifying enzyme can also be produced.
  • the target plant virulent or cells are subjected to the method described in 1 above to reduce the activity of the ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme to the virulent plant comprising the plant cells of the present invention. Can be produced.
  • the prepared callus is subjected to auxin and cytokinin according to a known method [tissue culture, 20 (1994); tissue culture, 21 (1995); Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)].
  • auxin and cytokinin according to a known method [tissue culture, 20 (1994); tissue culture, 21 (1995); Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)].
  • tissue culture, 20 (1994); tissue culture, 21 (1995); Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997) By culturing the cells in a medium containing, the transgenic plants having reduced ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme activity can be produced. 3. Production method of antibody composition
  • Antibody compositions are described in Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current' Protocols' in * Mole and DuPont-Iron, Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (hereinafter abbreviated as Antibodies). , Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1996 (hereinafter abbreviated as monoclonal 'antibodies'), Antibody Engineering, A Practical Approacn, IRL Press at Oxford University Press, 1996 (hereafter T, Antibody) The method can be obtained by expressing in a host cell as described below, for example.
  • a DNA fragment of an appropriate length including a portion encoding the protein is prepared.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the DNA fragment or full-length cDNA into the downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant producing the antibody composition By introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector, a transformant producing the antibody composition can be obtained.
  • Any host cell can be used as long as it can express the gene of interest, such as yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like.
  • Enzymes involved in the modification of N-glycoside-linked sugar chains that bind to the Fc region of an antibody molecule are introduced using genetic engineering techniques.
  • Cells such as yeast, animal cells, insect cells, and plant cells are used as host cells. It can also be used.
  • Examples of the host cells used in the method for producing the antibody composition include the cells of the present invention prepared in 1. above.
  • An expression vector that is capable of autonomous replication in the above-described various host cells or that can be integrated into a chromosome and that contains a promoter at a position where the DNA encoding the antibody molecule of interest can be transcribed is used. .
  • cDNA can be obtained from a human or non-human animal tissue or cell by a probe specific to the antibody molecule of interest. It can be prepared using primers.
  • yeast When yeast is used as a host cell, examples of expression vectors include YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), and YCp50 (ATCC37419).
  • the promoter any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast strains.
  • Examples include the PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock protein promoter, MFal promoter, CUP 1 promoter and the like.
  • yeast belonging to the genera Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Krybetella genus, Trichosporon, Schuniomyces, and the like. Can s power.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • an electroporation method [Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)]
  • the Spheroplast method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA], 84, 1929 (1978)]
  • acetic acid Lithium method [Journal of Bacteriology (J. Bacteriology), 153, 163 (1983)], Proceedings' Ob 'The National' Academy 'Ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 1929 (1978)].
  • examples of expression vectors include pcDNAI, pcDM8 (commercially available from Funakoshi), pAGE107 [JP-A-3-22979; Cytotechnology, 3, 133, (1990). )], PAS3-3 [Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-227075], PCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)], pcDNAI / Amp (manufactured by Invitrogen), pREP4 (manufactured by Invitrogen), pAGE103 [journal Biochemistry, 101, 1307 (1987)], pAGE210 and the like. Any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 early promoter examples thereof include a cytomegalovirus (CMV) IE (immediate early) gene promoter, an SV40 early promoter, and a retro-inoles promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • Examples include the meta mouth thionine promoter, the heat shock promoter, and the SRa promoter.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • Examples of the host cells include Naraalwa cells, which are human cells, COS cells, which are monkey cells, CH0 cells, which are Chinese hamster cells, and HBT5637. 63-299), rat myeloma cells, mouse myeloma cells, Syrian hamsters, kidney-derived cells, embryonic stem cells, fertilized egg cells, and the like.
  • any method for introducing DNA into animal cells can be used.
  • electroporation [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • Calcium phosphate method [Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 2-227075]
  • Ribobox method [Proceedings, Op. ]
  • Injection method [Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) (hereinafter abbreviated as "Manipi Euling 'Mouse' Emprio 2nd Edition)"
  • Particle gun (Genetic gun) a method of using a [Japanese Patent No. 26068 56, Japan Patent No.
  • the recombinant virus can be obtained in the insect cell culture supernatant, and further, the recombinant virus can be transmitted to insect cells to express the protein.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (all manufactured by Invitorogen) and the like.
  • Examples of the paculovirus include the ability to use Autographa californica nuclear polynedrosis virus, which is a virus that infects night-moth insects, such as Autographa californica nuclear polynedrosis virus.
  • Autographa californica nuclear polynedrosis virus which is a virus that infects night-moth insects, such as Autographa californica nuclear polynedrosis virus.
  • insect cells Sf9 and Sf21, which are ovarian cells of Spodopterafrugiperda [current protocoron's in molecular, bio-biotics, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992)], Trichoplusia ni Ovarian cells such as High 5 (manufactured by Invitrogen) or the like can be used.
  • examples of the expression vector include a Ti plasmid and a tobacco mosaic virus vector.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in plant cells, and examples thereof include the 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV) and the geneactin 1 promoter.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • host cells include plant cells such as tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, oilseed rape, alfa alfa, rice, wheat, and wheat.
  • Any method for introducing a recombinant vector can be used as long as it is a method for introducing DNA into plant cells.
  • a method using Agrobacterium Japanese Patent Laid-Open No. 59-140885, 60-70080, W094 / 00977
  • an electroporation method Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-251887
  • a method using a particle gun (gene gun) Japanese Patent No. 2517813
  • Japanese Patent No. 2517813 Japanese Patent No. 2517813
  • a method for expressing an antibody gene in addition to direct expression, secretory production, expression of a fusion protein between the Fc region and another protein, and the like can be performed according to the method described in Molecular Cloning Second Edition. it can.
  • an antibody molecule having a sugar or a sugar chain added by the introduced gene may be obtained. it can.
  • the antibody composition can be produced by culturing the transformant obtained as described above in a medium, producing and accumulating antibody molecules in the culture, and collecting from the culture.
  • the method for culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing host cells.
  • the medium for culturing the transformant obtained using yeast as a host is a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like, which can be used by the organism, and which can efficiently culture the transformant. If so, either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • the carbon source may be any one that can be assimilated by the organism; glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, Alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate and other ammonium salts of inorganic or organic acids, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor. , Casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermentation cells and digests thereof can be used.
  • potassium potassium phosphate potassium potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, man sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • the culture is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the cultivation temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the cultivation time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • isopropyl-1] -D-thiogalatatopyranoside can be used to culture microorganisms transformed with a recombinant vector using the trp promoter.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • a commonly used RPMI1640 medium [The Journal of the American 'Medium Canole' Aso Shay Chaon ( The Journal of the American Medical Association), 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 ( 1959)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine], 73, 1 (1950)], Whitten medium [Developmental engineering experiments Manyua How to make transgenic mice (Kodansha) Motoya Katsuki (ed., 1987)] or a culture medium obtained by adding fetal bovine serum to these culture media can be used.
  • Culture is carried out usually p H6 ⁇ 8, 30 ⁇ 40 ° C, 5 % C0 2 present 1 to 7 days under conditions such as lower. Culture can be carried out for one day to several months using culture methods such as hued patch culture and holofiber culture.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
  • TNM-FH medium Pulsen
  • Sf-900II SFM medium Life Technologies
  • ExCell400 ExCell405
  • Grace's Insect Medium a medium for culturing a transformant obtained by using insect cells as host cells.
  • the cultivation is usually performed under conditions of pH 6 to 7 and 25 to 30 ° C for 1 to 5 days.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant obtained using a plant cell as a host cell can be cultured as a cell or after being differentiated into a plant cell or organ.
  • a culture medium for culturing the transformant a commonly used Murashige and Starg (MS) medium, a white (White) medium, or a plant hormone such as auxin or cytokinin was added to these mediums.
  • MS Murashige and Starg
  • White white
  • plant hormone such as auxin or cytokinin
  • Cultivation is usually performed at pH 5 to 9 and 20 to 40 ° C for 3 to 60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • a yeast, animal cell, or plant cell-derived transformant harboring a recombinant vector incorporating a DNA encoding an antibody molecule is cultured according to a conventional culture method to produce and accumulate an antibody composition. Then, the antibody composition can be produced by collecting the antibody composition from the culture.
  • Methods for producing the antibody composition include a method of producing the antibody composition in a host cell, a method of secreting the antibody out of the host cell, and a method of producing the antibody composition on the host cell outer membrane.
  • the method can be selected by changing the structure.
  • the method of Paulson et al. the method of Paulson et al. [Journal of Biological 'Chemistry (J. Biol. Chem.), 264, 17619 ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989); Gene Development. Develop.), 4, 1288 (1990)]
  • the methods described in JP-A-05-336963, JP-A-06-823021, and the like whereby the antibody composition is actively secreted out of host cells. Can be done.
  • a DNA encoding an antibody molecule and a DNA encoding a signal peptide suitable for expression of the antibody molecule are introduced into an expression vector, and the expression vector is introduced into host cells.
  • the target antibody molecule can be actively secreted out of the host cell.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • an individual animal transgenic non-human animal
  • individual plant transgenic plant
  • An antibody composition can also be produced using an individual.
  • the transformant is an animal or plant individual
  • the animal is bred or cultivated according to a conventional method to produce and accumulate the antibody composition, and the antibody composition is collected from the animal or plant individual.
  • the antibody composition can be produced.
  • Examples of a method for producing an antibody composition using an animal individual include, for example, a known method [American Journal of Clinical Nutrition], 63, 639S (1996); American ⁇ Transfer gene according to American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996); Bio / Technology, 9, 830 (1991)]
  • a method for producing a desired antibody composition in an animal created by the above method can be used.
  • an antibody composition is produced and accumulated in the animal, and the antibody composition is extracted from the animal.
  • an antibody composition can be produced.
  • Examples of the place of accumulation in the animal include milk of the animal (JP-A-63-309192), eggs, and the like.
  • the promoter used in this case Any one can be used as long as it can be expressed in animals.
  • a mammary gland cell-specific promoter such as the casein promoter, the casein promoter, the j8 lactoglobulin promoter, the whey acid protein promoter, and the like are preferably used. Used.
  • a transgenic plant into which DNA encoding an antibody molecule has been introduced can be prepared by a known method [tissue culture, 20 (1994); tissue culture, 21 (1995)]. ); Cultivated according to Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)] to produce and accumulate an antibody composition in the plant, and to produce the antibody composition from the plant.
  • a method of producing an antibody composition by collecting the antibody can be mentioned.
  • An antibody composition produced by a transformant into which a gene encoding an antibody molecule has been introduced is, for example, when the antibody composition is expressed in a lysed state in cells, after completion of the culture, the cells are collected by centrifugation. After suspension in an aqueous buffer, the cells are disrupted using an ultrasonic disrupter, French press, Mentongaulin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • a normal enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Getylaminoethyl (DEAE)-Sepharose, DIAI0N HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), etc.
  • the cells When the antibody composition is expressed by forming an insoluble form in the cells, the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to collect the insoluble form of the antibody composition as a precipitate fraction.
  • the recovered insoluble form of the antibody composition is solubilized with a protein denaturant. After diluting or dialyzing the lysate to restore the antibody composition to a normal three-dimensional structure, a purified sample of the antibody composition can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the antibody composition can be collected in the culture supernatant. That is, the culture is treated by a technique such as centrifugation as described above. In this manner, a soluble fraction is obtained, and a purified sample of the antibody composition can be obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above.
  • Examples of the antibody composition thus obtained include an antibody, a fragment of the antibody, a fusion protein having an Fc region of the antibody, and the like.
  • a humanized antibody expression vector is an expression vector for animal cells into which genes encoding the H chain and L chain C regions of the human antibody have been incorporated. And can be constructed by cloning the genes encoding CL and CL, respectively.
  • the C region of a human antibody can be CH and CL of any human antibody.
  • the C region of the IgGl subclass of the H chain of the human antibody hereinafter, referred to as hCyl
  • human C region of ⁇ class of L chain of the antibody hereinafter referred to as hC K
  • genes encoding CH and CL of the human antibody chromosomal DNA consisting of exons and introns can be used, and cDNA can also be used.
  • Any expression vector for animal cells can be used as long as it can integrate and express the gene encoding the C region of the human antibody.
  • PAGE107 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • pAGE103 [Journal of Pio. Biochemistry (j. Biochem.), 101, 1307 (1987)]
  • PHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]
  • pKCR Proceedings. Op. The 'National' Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 78, 1527 (1981)]
  • pSGl ⁇ d2- 4 Site Technology (Cytotechnology), 4, 173 (1990)].
  • promoters and enhancers used in animal cell expression vectors include the early promoter and enhancer of SV40 [Journal 'ob' Piochemistry (J. Biochem.), 101, 1307 (1987)], Moroni mouse leukemia. Virus LTR Radiochemical 'And Bio-Official Research' Research 'Communications (Biochem. Biophys. Res. Commun.), 149, 960 ( 1987)], immunoglobulin H chain promoter [cell 3 Le (Cell), 41, 479 ( 1985)] and Enhansa Cell (Cell), 33, 717 ( 1983)] and the like 0
  • the humanized antibody expression vector must be of either the type in which the antibody H chain and the L chain are present on various vectors or the type in which the antibody is present on the same vector (hereinafter referred to as tandem type). Tandem type, because of the ease of construction of a humanized antibody expression vector, ease of introduction into animal cells, and balance of expression levels of antibody H and L chains in animal cells.
  • the vector for expressing a humanized antibody is more preferable [Jan Immunol's "Immunologica Cannole” Methods (J. Immunol. Methods), 167, 271 (1994)].
  • the constructed humanized antibody expression vector can be used for expression of a human-type chimeric antibody or a human-type CDR-transplanted antibody in animal cells.
  • CDNAs encoding non-human animal antibodies for example, VH and VL of mouse antibodies, can be obtained as follows.
  • MRNA is extracted from hybridoma cells producing the desired mouse antibody, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as phage or plasmid to prepare a cDNA library.
  • each recombinant plasmid is isolated.
  • the entire nucleotide sequence of VH and VL of the target mouse antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, and the entire amino acid sequence of VH and VL is deduced from the nucleotide sequence.
  • any animal can be used as long as it can produce hybridoma cells, such as mice, rats, hamsters, and egrets.
  • Methods for preparing total RNA from hybridoma cells include guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)], and total RNA from RNA.
  • a method for preparing mRNA an oligo (dT) -immobilized cellulose column method [Molecular cloning: a lab laboratories, Molecular Cloning: A Laooratory Manual], Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989] And the like.
  • Hypri-Dorma Fine Examples of kits for preparing mRNA from cells include Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen), Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia) and the like.
  • the cDNA library can be prepared by a conventional method [Molecular Cloning: a Laboratory Tree: A Laboratory Manual], Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989 Current, protocol: ⁇ -norrez in molecular biology, Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 34), or some commercial kits, such as Super Script TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Methods using Cloning (GIBCO BRL) or ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene) can be used.
  • any vector can be used as a vector for incorporating a cDNA synthesized as a type II mRNA extracted from hybridoma cells, as long as the vector can incorporate the cDNA.
  • ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1992)]
  • pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)]
  • ⁇ zap II (Stratagene)
  • Lgtl0 Lgtl0
  • ⁇ gtll [DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49 (1985)]
  • Lambda BlueMid (Clontech)
  • ExCell pT7T3 18U (Pharmacia)
  • pcD2 [Molecular 'and' Cellular 'biology (Mol. Cell. Biol.), 3, 280 (1983)]
  • pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)]
  • Etc. are used.
  • any Escherichia coli can be used as long as the cDNA library can be introduced, expressed and maintained.
  • Methods for selecting cDNA clones encoding VH and VL of non-human animal antibodies from a cDNA library include colony hybridization or plaque hybridization using isotope or fluorescently labeled probes. The method can be selected according to the Yon method [Molecular cloning: a laboratory, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989].
  • PCR method Molecular cloning: a laboratory 1 ⁇ ⁇ manu / cloning (Molecular Cloning) : A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; VH and VL according to Current Protocols in Molecular Biology; Supplement 1-34]. Can also be prepared.
  • the cDNA selected by the above method is cleaved with an appropriate restriction enzyme or the like, and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene). Sanger) et al., And performed a reaction such as the dideoxy method [Proceedings of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 74, 5463 (1977)].
  • the base sequence of the cDNA can be determined by analysis using a sequence automatic analyzer, for example, ALF DNA Sequencer (Pharmacia).
  • the entire amino acid sequence of VH and VL was deduced from the determined base sequence, and the entire amino acid sequence of VH and VL of a known antibody was determined. [Sequences or Proteins of Proteins] Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991] to confirm that the cDNA obtained encodes the complete amino acid sequence of VH and VL of the antibody, including the secretory signal sequence. it can.
  • the length of the secretory signal sequence and the N-terminal amino acid sequence can be estimated. You can know which subgroup you belong to.
  • the amino acid sequences of the CDRs of VH and VL are also the amino acid sequences of VH and VL of known antibodies [Sequences of proteins, proteins, immunology, Interests, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991].
  • CDNA encoding VH and VL of non-human animal antibodies is cloned upstream of the genes encoding CH and CL of the human antibodies in the human antibody expression vector described in (1) of Section 3 of this section.
  • a human chimeric antibody expression vector can be constructed.
  • the cDNA encoding the VH and VL of the antibody of a non-human animal can be obtained by combining the nucleotide sequence at the 3 'end of the VH and VL of the antibody of a non-human animal with the 5- and 5-terminals of CH and CL of the human antibody.
  • each of the vectors is a vector for humanized antibody expression as described in (1) of this section 3
  • a human chimeric antibody expression vector can be constructed by cloning upstream of the genes encoding CH and CL of the human antibody so that they are expressed in an appropriate form.
  • CDNA encoding VH and VL of the human CDR-grafted antibody can be constructed as follows. First, the amino acid sequence of the VH and VL frameworks (hereinafter referred to as FR) of the human antibody to which the VH and VL CDRs of the antibody of the animal other than the target human are transplanted is selected. As the amino acid sequence of FRs of VH and VL of a human antibody, any amino acid sequence derived from a human antibody can be used.
  • FR amino acid sequences of human antibody VH and VL registered in databases such as the Protein Data Bank, and common amino acid sequences of FR subgroups of human antibody VH and VL [Sequences''Proteins' of biological interests (Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991], among which human CDR transplants with sufficient activity
  • the amino acid sequences of the CDRs of the VH and VL of the antibody of the non-human animal of interest are transplanted into the amino acid sequences of the FRs of the VH and VL of the selected human antibody, and the VH and VL of the human-type CDR-grafted antibody are grafted.
  • Design the amino acid sequence Frequency of codons found in the nucleotide sequence of the designed amino acid sequence in the antibody gene (Sequencys of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991], and design a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH and VL of the human CDR-grafted antibody.
  • the amplified product is cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), the nucleotide sequence is determined by the method described in (2) of this section 3, and the desired human CDR-grafted antibody is obtained.
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH and VL is obtained.
  • a human CDR-grafted antibody has the antigen-binding activity of the original non-human animal by simply grafting only the VH and VL CDRs of the target non-human animal antibody to the human antibody VH and VL FR. It is known to be lower than antibodies [Bio / Technology (BI0 / TECHN0L0GY), 9, 266 (1991)]. This is due to the fact that not only CDRs but also some amino acid residues of FRs directly or indirectly increase the antigen binding activity in the H chain and L chain V regions of antibodies of animals other than the original human. It is considered that these amino acid residues are changed to different amino acid residues of FR of VH and VL of human antibody upon CDR transplantation.
  • human CDR-grafted antibodies have amino acid residues involved in direct binding to antigens and amino acid residues of CDRs in the amino acid sequence of FRs of VH and VL of human antibodies. Identify amino acid residues that interact with groups or maintain the antibody's tertiary structure, and indirectly participate in antigen binding, and identify those amino acid residues found in the original non-human animal antibody Modified to Radio / technologies where increased antigen binding activity is being performed
  • a human CDR-grafted antibody In producing a human CDR-grafted antibody, it is of utmost importance how to efficiently identify the amino acid residues of FR involved in the binding activity between the antibody and the antigen.
  • Methods for identifying FR amino acids involved in the binding activity between an antibody and an antigen include X-ray crystallography [Journal 'ob' Molecular 'Biology (J. Mol. Biol.), 112, 535 (1977)]
  • a method of constructing and analyzing a three-dimensional structure of an antibody such as computer modeling [Protein Engineering, 7, 1501 (1994)] may be used. Information on the three-dimensional structure of these antibodies has provided much useful information for the production of human CDR-grafted antibodies.
  • a method for producing a human CDR-grafted antibody applicable to any antibody has not yet been established. Therefore, at present, various trials and errors are necessary, such as preparing several variants of each antibody and examining the correlation with each antigen-binding activity.
  • Amino acid residues in FRs of VH and VL of a human antibody can be modified by the PCR method described in 3 (5) of this section using synthetic DNA for modification.
  • the nucleotide sequence of the amplified product after PCR is determined by the method described in (2) of this section 3 to confirm that the target modification has been performed.
  • the humanized CDR transplant constructed in (5) and (6) of this section 3 was upstream of the genes encoding CH and CL of the human antibody in the humanized antibody expression vector described in (1) of this section 3.
  • the cDNA encoding the VH and VL of the antibody can be cloned to construct a human CDR-grafted antibody expression vector.
  • an appropriate restriction enzyme at the 5 'end of the synthetic DNA located at both ends By introducing the recognition sequence, the humanized antibody expression vector described in Section 3 (1) is cloned so that it can be expressed in an appropriate form upstream of the genes encoding CH and CL of the human antibody.
  • a human CDR-grafted antibody expression vector can be constructed.
  • a human chimeric antibody and a human CDR-grafted antibody (hereinafter, also referred to as a humanized antibody) ) Can be obtained stably.
  • Examples of a method for introducing a humanized antibody expression vector into animal cells include an electroporation method [Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891; Cytotechnology, 3, 133 (1990)] and the like.
  • any animal cell that can produce a humanized antibody can be used.
  • B HK cells and Namalva cells which are human myeloma cells, and the like, preferably, CH0 / DG44 cells, which are Chinese hamster ovary cells, rat myeloma YB2 / 0 cells, and the cells described in 1. can give.
  • G418 sulfate (hereinafter, referred to as G418; SIGMA) according to the method disclosed in JP-A-2-257891. ) Can be selected depending on the animal cell culture medium containing the drug.
  • RPMI1640 medium manufactured by Japan-made Kusurisha
  • GIT medium EX- CELL 3 02 medium
  • JRH Co., Ltd. IMDM medium
  • GBCO BRL Hybridoma-SFM medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the production amount and antigen-binding activity of the humanized antibody in the culture supernatant can be measured by an enzyme immunoassay (hereinafter referred to as ELISA method; Antibodies, 'Chapter 14, Monoclonal Antibodies).
  • ELISA method enzyme immunoassay
  • the transformant can increase the production of humanized antibody using a DHFR gene amplification system or the like according to the method disclosed in Japanese Patent Publication No. 2-257891.
  • Humanized antibodies can be purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A column [Antipodiz Chapter 8, Monoclonal 'Antibodies].
  • other purification methods usually used for protein purification can be used.
  • gel filtration, ion exchange mouth chromatography and ultrafiltration Purification can be performed by a combination of excess and the like.
  • the molecular weight of the purified humanized antibody H chain, L chain or whole antibody molecule can be determined by polyacrylamide gel electrophoresis [hereinafter referred to as SDS-PAGE; Nature, 227, 680 (1970)] or Western blot. It can be measured by the lotting method [Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 12, Monoclonal Antibody].
  • An expression vector for an Fc fusion protein is an expression vector for animal cells into which a gene encoding a protein to be fused with the Fc region of a human antibody is incorporated, and a protein to be fused to the expression vector for animal cells with the Fc region of a human antibody. It can be constructed by cloning the gene encoding
  • the Fc region of a human antibody includes a region containing the CH2 and CH3 regions, as well as a region containing the hinge region and a part of CH1. Any compound may be used as long as at least one amino acid of CH2 or CH3 has been deleted, substituted, added or inserted, and has substantially the binding activity to the Fey receptor.
  • chromosomal DNA consisting of exons and introns
  • cDNA can also be used.
  • PCR method Recura-I 'cloning 2nd edition; current' Protocols 'in' Molecular Biology, Supplement 1-34
  • Any expression vector for animal cells can be used as long as it can integrate and express a gene encoding the C region of a human antibody.
  • PAGE107 Cytotechnology, 3, 133 (1990)
  • pAGE103 Journal of Biochem., J.
  • promoters and enhancers used in animal cell expression vectors include the early promoter and enhancer of SV40 [Journal 'ob' Piochemistry (J. Biochem.), 101, 1307 (1987)], Moro-I mouse leukemia virus. LTR radiochemical 'and-by' "Research” Communications (Biochem. Biophys. Res. Commun.), 149, 960 (1987)], Immunoglobulin heavy chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)] and Enhancer [Cell] (Cell), 33, 717 (1983)].
  • DNA encoding a protein to be fused with the Fc region of a human antibody can be obtained as follows.
  • MRNA is extracted from cells or tissues that express the protein to be fused with the desired Fc, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or plasmid to prepare a cDNA library.
  • a recombinant phage or a recombinant plasmid having a cDNA encoding the target protein is isolated using the gene sequence portion of the target protein as a probe.
  • the entire nucleotide sequence of the target protein on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, and the entire amino acid sequence is estimated from the nucleotide sequence.
  • any animals such as mice, rats, hamsters, and egrets, can be used as long as cells and tissues can be removed therefrom.
  • Methods for preparing total RNA from cells and tissues include the guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)], and mRNA from total RNA.
  • Examples of the method for preparing E. coli include the oligo (dT) immobilized lignocellulose column method (Molecular 'Cloning 2nd Edition) and the like.
  • Examples of kits for preparing mRNA from cells or tissues include Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen), Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharraacia) and the like.
  • a conventional method (Molecular 'Clothing Second Edition; Current' Protocols', 'Molecular' Biology, Supplement 1-34), or a commercially available kit
  • a method using a Super Script TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL) or a ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene) can be used.
  • any vector can be used as a vector for incorporating a cDNA synthesized as a type II mRNA extracted from cells or tissues, as long as the vector can incorporate the cDNA.
  • ZAP Express [Strategy (Strategies), 5, 58 (1992)], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], ⁇ zapll (Stratagene), L gtlO L gtll [DNA Cloning: A Practical Approach], I, 49 (1985)], Lambda BlueMid (Clontech), L ExCell, pT7T3 18U (Pharmacia) And cD2 [Molecular 'and' Cellular 'biology (Mol. Cell. Biol.), 3, 280 (1983)], pUC18 [Gene, 33.103 (1985)] and the like.
  • any Escherichia coli can be used as long as the cDNA library can be introduced, expressed and maintained.
  • XLl-Blue MRF [Strategies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778] (1983)], Marauder 522 [Journal of Molecular Biology (J. Mol. Biol.), 166, 1 (1983)], K802 [Journal of Molecular Biology (J. Mol. Biol.)] Biol.), 16, 118 (1966)] and JM105 [Gene, 38, 275 (1985)].
  • Methods for selecting cDNA clones encoding the desired protein from the cDNA library include colony hybridization using an isotope or fluorescently labeled probe, or plaque 'hybridization' (Molecularization Cloning). 2 edition).
  • primers can be prepared, and cDNA encoding the target protein can be prepared by PCR using a cDNA or a cDNA library synthesized from raRNA as a type II.
  • a PCR method can be used as a method for fusing the target protein with the Fc region of a human antibody. For example, an arbitrary synthetic oligo DNA (primer) is set on the 5 ′ side and 3 ′ side of the gene sequence of the target protein, and a PCR method is performed to obtain a PCR product. Similarly, an arbitrary primer is set for the gene sequence of the Fc region of the human antibody to be fused, and a PCR product is obtained. At this time, primers are set so that the same restriction enzyme site or the same gene sequence exists on the 3 ′ side of the PCR product of the protein to be fused and the 5 ′ side of the PCR product of the Fc region.
  • primers are set so that the same restriction enzyme site or the same gene sequence exists on the 3 ′ side of the PCR product of the protein to be fused and the 5 ′ side of the PCR product of the Fc region.
  • the mutation is introduced by using a primer into which the mutation has been introduced.
  • the resulting genes are further subjected to PCR using the two types of PCR fragments to ligate both genes.
  • ligation can be performed by performing ligation after the same restriction enzyme treatment.
  • the gene sequence ligated by the above method is cut with an appropriate restriction enzyme or the like, and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene), and a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, Sanger The dideoxy method [Proceedings of Ob. 'The' National 'Academy' Ob '' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1977)] or ABI PRISM 377 DNA Theta-Encer (PE
  • the base sequence of the DNA can be determined by analysis using a base sequence analyzer such as Biosystems.
  • a transformant capable of stably producing the Fc fusion protein can be obtained.
  • Examples of a method for introducing the Fc fusion protein expression vector into animal cells include the electoporation method [Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891; Cytotechnology, 3, 133 (1990)] and the like.
  • any animal cell that can produce the Fc fusion protein can be used. Specifically, it is derived from mouse myeloma cells NS0 cells, SP2 / 0 cells, Chinese hamster ovary cells CHO / dhfr- cells, CH0 / DG44 cells, rat myeloma YB2 / 0 cells, IR983F cells, and Syrian hamster kidney.
  • Examples include BHK cells, Namalva cells which are human myeloma cells, etc., preferably, CH0 / DG44 cells which are Chinese hamster monoovary cells, rat myeloma YB2 / 0 cells, and the method of the present invention according to the above item 1.
  • the host cell to be used is exemplified.
  • a transformant that stably produces the FcS insect mating protein is selected using an animal cell culture medium containing a drug such as G418 according to the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-257891. it can.
  • culture media for animal cells RPMI1640 medium (Nissui Pharmaceutical), GIT medium (Nippon Pharmaceutical), EX-CELL302 medium (JRH), IMDM medium (GIBCO BRL), Hybridoma-SFM medium (Manufactured by GIBCO BRL) or a medium obtained by adding various additives such as fetal bovine serum to these media.
  • the Fc fusion protein is produced and accumulated in the culture supernatant. Can be made.
  • the production amount and antigen-binding activity of the Fc fusion protein in the culture supernatant can be measured by ELISA or the like.
  • the transformed strain can increase the production amount of the Fc fusion protein using a dhfr gene amplification system or the like according to the method disclosed in JP-A-2-2577891.
  • the Fc fusion protein can be purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A column or a protein G column (Antibodies, Chapter 8, Monoclonal Antibody).
  • a protein A column or a protein G column Antibodies, Chapter 8, Monoclonal Antibody
  • other purification methods usually used for protein purification can be used.
  • purification can be performed by a combination of gel filtration, ion exchange chromatography, ultrafiltration, and the like.
  • the molecular weight of the whole purified Fc fusion protein molecule is measured by SDS-PAGE [Nature, 227, 680 (1970)], Western blotting (Antibodies, Chapter 12, Monoclonal 'Antibodies'), etc. be able to.
  • the method for producing an antibody using an animal cell as a host has been described above. However, as described above, the antibody can be produced in an enzyme, an insect cell, a plant cell, an animal individual, or a plant individual.
  • antibody-producing cells are prepared using the method described in 1 above, and then the cells are cultured.
  • the antibody composition can be produced by purifying the antibody composition
  • the binding activity to an antigen and the binding activity to an antigen-positive cultured cell line can be determined by ELISA and immunofluorescence [Cancer Immunology] Immunotherapy. (Cancer Immunol. Iramunother.), 36, 373
  • Cytotoxic activity against an antigen-positive cultured cell line can be evaluated by measuring complement-dependent cytotoxicity (hereinafter, referred to as CDC activity), ADCC activity, etc. [Cancer's Immunology / Immunotherapy]
  • the sugar chain structure of the antibody molecule expressed in various cells can be determined according to the analysis of the sugar chain structure of a normal glycoprotein.
  • the sugar chains bound to IgG molecules are composed of neutral sugars such as galactose, mannose, and fucose, amino sugars such as N-acetyldarcosamine, and acidic sugars such as sialic acid.
  • the analysis can be performed using techniques such as composition analysis and sugar chain structure analysis using a two-dimensional sugar chain mapping method.
  • composition analysis of the sugar chain of an antibody molecule neutral sugar or amino sugar is released by acid hydrolysis of the sugar chain with trifluoroacetic acid or the like, and the composition ratio can be analyzed.
  • BioLC sugar composition analyzer
  • HPAEC-PAD high performance anion-exchange chromatography—pulsed amperometric detection
  • the composition ratio can also be analyzed by a fluorescent labeling method using 2-aminopyridine. Specifically, a sample obtained by acid hydrolysis according to a known method [Agrucural and Biological Chemistry (Agruc. Biol. Chem.), 55 (1), 283-284 (1991)] is used. -Fluorescent labeling by aminopyridylation and HPLC analysis can calculate the composition ratio.
  • Structural analysis of the sugar chain of the antibody molecule is performed by two-dimensional sugar chain mapping [Analytical Biochemistry., 171, 73 (1988), Biochemistry Experimental Method 23—Glycoprotein sugar chain research method (Academic Society) Publishing Center) Edited by Reiko Takahashi (1989)].
  • the X-axis shows the retention time or elution position of the reversed-phase chromatography sugar chain
  • the Y-axis shows the retention time of the sugar chain by normal-phase chromatography. This method estimates the sugar chain structure by plotting W or the elution position, and comparing them with the results of known sugar chains.
  • the antibody is hydrazinolyzed to release a sugar chain from the antibody, and fluorescent labeling of the bran chain with 2-aminopyridine (hereinafter abbreviated as PA) [Journal Oppy Biochemistry (J. Biochem.), 95, 197 (1984)], and the sugar chains are separated from excess PA reagent by gel filtration, followed by reverse phase chromatography. Next, normal phase chromatography is performed on each peak of the separated sugar chain. Based on these results, the results were plotted on a two-dimensional glycan map and compared with the glycan standard (TaKaRa) and the literature [Analytical 'Biochemistry., 171, 73 (1988)]. The sugar chain structure can be estimated from the comparison of the spots.
  • PA 2-aminopyridine
  • mass spectrometry such as MALDI-T0F-MS of each sugar chain can be performed to confirm the structure estimated by the two-dimensional sugar chain mapping method.
  • the antibody composition obtained according to the present invention has high ADCC activity.
  • Antibodies having high ADCC activity are useful in the prevention and treatment of various diseases including cancer, inflammatory diseases, autoimmune diseases, immune diseases such as allergies, cardiovascular diseases, and viral or bacterial infections.
  • Cancer cells ie, malignant tumors, have proliferating cancer cells.
  • Ordinary anticancer drugs are characterized by inhibiting the growth of cancer cells.
  • an antibody having high ADCC activity can treat cancer by damaging cancer cells by a cell-killing effect, and is therefore more effective as a therapeutic agent than ordinary anticancer drugs.
  • the antitumor effect of antibody drugs alone is often insufficient at present, and combination therapy with chemotherapy is performed [Science, 280, 1197, 1998]. If a stronger antitumor effect of the antibody composition alone obtained by is obtained, the dependence on chemotherapy is reduced, which leads to a reduction in side effects.
  • the in vivo reaction in those diseases is triggered by the release of mediator molecules by the immune cells, so the immune cells are eliminated using antibodies with high ADCC activity Thereby, the energy reaction can be suppressed.
  • Cardiovascular diseases include arteriosclerosis. Atherosclerosis is currently treated with balloon catheters, but ADCC increases arterial cell proliferation in restenosis after treatment. Suppression with an active antibody can prevent and treat circulatory diseases.
  • Antibodies that recognize tumor-associated antigens, recognize allergy or inflammation-related antigens, recognize circulatory disease-related antigens, recognize autoimmune disease-related antigens, or respond to viral or bacterial infections Specific examples of antibodies that recognize related antigens are described below.
  • Antibodies that recognize tumor-associated antigens include anti-GD2 antibody (Anticancer Res., 13, 331-336, 1993), anti-GD3 antibody (Cancer Immunol. Imraunother., 36, 260-266, 1993), anti-GM2 antibody (Cancer Res., 54, 1511-1516, 1994), anti-HER2 antibody
  • Anti-basic fibroblast growth factor antibody Anti-basic fibroblast growth factor antibody, anti-FGF8 receptor antibody (J. Biol. Chem., 265, 16455-16463, 1990) , Anti-basic fibroblast growth factor receptor antibody, anti-insulin-like growth factor antibody (J. Neurosci. Res., 40, 647-659, 1995), anti-insulin-like growth factor receptor antibody (J. Neurosci. Res. ., 40, 647-659, 1995), anti-PMSA antibody (J.
  • Antibodies that recognize antigens associated with allergy or inflammation include anti-interleukin-6 antibody (Immunol. Rev., 127, 5-24, 1992) and anti-interleukin-6 receptor antibody (Molecular Immunol., 31, 371). -381, 1994), anti-interleukin 5 antibody (Immunol. Rev., 127, 5-24, 1992), anti-interleukin 5 receptor antibody, Interleukin-4 antibody (Cytokine, 3, 562-567, 1991), anti-interleukin-4 receptor antibody (J. Immunol.
  • anti-tumor necrosis factor antibody Hybridoma, 13, 183-190, 1994
  • anti-tumor necrosis factor receptor antibody Molecular Pharmacol., 58, 237-245, 2000
  • anti-CCR4 antibody Nature, 400, 776-780
  • anti-chemokine antibody J. Immunol. Meth., 174, 249-257, 1994
  • anti-chemoforce receptor antibody J. Exp. Med., 186, 1373-1381, 1997)
  • anti-IgE antibody Anti-CD23 antibody
  • anti-CDlla antibody Immunology Today, 21 (8), 403-410 (2000)
  • anti-CRTH2 antibody J Immunol., 162, 1278-1286 (1999)
  • anti-CCR8 antibody W099 / 25734
  • Anti-CCR3 antibody US6207155
  • Antibodies that recognize antigens associated with cardiovascular diseases include anti-GpIIb / IIIa antibodies (J. Immunol., 152, 2968-2976, 1994) and anti-platelet-derived growth factor antibodies (Science, 253, 1129-1132, 1991). ), Anti-platelet-derived growth factor receptor antibody (J. Biol. Chem., 272, 17400-17404, 1997) or anti-coagulation factor antibody (Circulation, 101, 1158-1164,
  • Antibodies that recognize antigens associated with autoimmune diseases include anti-self DNA antibodies
  • Antibodies that recognize antigens associated with viral or bacterial infection include anti-gp120 antibody (Structure, 8, 385-395, 2000), anti-CD4 antibody (J. Rheumatology, 25, 2065-2076, 1998), anti-CCR4 Antibodies, anti-verotoxin antibodies (J. Clin.
  • autoimmune diseases psoriasis, rheumatoid arthritis, Crohn's disease, ulcerative colitis, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, etc.
  • Anti-CDlla antibody, anti-ICAM3 antibody, anti-CD80 antibody, anti-CD2 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-integrin ⁇ 4] 37 antibody, anti-CD40L antibody, anti-IL-2 receptor antibody Immunology Today, 21 (8), 403-410
  • the above antibodies were obtained from public institutions such as ATCC (The American Type Culture Collection), RIKEN Cell Development Bank, Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, or Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., R & D SYSTEMS, PharMingen, It can be obtained from commercial reagent sales companies such as Cosmo Bio Inc. and Funakoshi Inc.
  • the medicament containing the antibody composition obtained by the present invention can be administered alone as a therapeutic agent, it is usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers, and It is desirable to provide it as a pharmaceutical preparation produced by any method well known in the pharmaceutical art. It is desirable to use the most effective route for treatment, including oral administration or parenteral administration such as buccal, respiratory, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous administration. In the case of an antibody preparation, intravenous administration is preferred.
  • Dosage forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, p-hydroxy It can be produced using preservatives such as benzoic acid esters and flavors such as strawberry flavor and peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders, granules, etc. are excipients such as lactose, pudose, sucrose, manitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, poly It can be produced using a binder such as BURU alcohol, hydroxypropyl cellulose or gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin as an additive.
  • a binder such as BURU alcohol, hydroxypropyl cellulose or gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin as an additive.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • An injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • a powder injection can be prepared by freeze-drying the antibody composition according to a conventional method and adding sodium chloride thereto.
  • Suppositories are prepared using carriers such as rosin, hydrogenated fats or carboxylic acids.
  • Sprays are prepared using the antibody composition itself or a carrier that does not irritate the oral and respiratory tract mucosa of the recipient and disperses the antibody composition as fine particles to facilitate absorption.
  • the carrier include lactose and glycerin.
  • Formulations such as aerosols and dry powders are possible depending on the properties of the antibody composition and the carrier used. Also, in these parenteral preparations, the components exemplified as additives in the oral preparation can be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 / ig / kg to 20 mg / kg per adult per day.
  • Methods for examining the antitumor effect of the antibody composition on various tumor cells include CDC activity measurement and ADCC activity measurement in in vitro experiments, and in vivo experiments on mice and other experimental animals. Antitumor experiments using such tumor systems.
  • FIG. 1 shows the ADCC activity of the anti-CCR4 chimeric antibody produced by rat myeloma YB2 / 0 cell KM2760 # 58-35-16 strain 1-15 strain against CCR4 / EL-4 cells. .
  • the vertical axis indicates cytotoxic activity, and the horizontal axis indicates antibody concentration.
  • the mouth indicates the activity of KM2760 # 58-35-16 produced anti-CCR4 chimeric antibody KM2760-1, and the open triangle indicates the activity of anti-CCR4 chimeric antibody 1-15 produced KM2760-2.
  • FIG. 2 shows elution diagrams obtained by reverse-phase HPLC analysis of PA-glycans prepared from anti-CCR4 chimeric antibodies produced by mfFUT8-6 and pAGE249-introduced strains.
  • FIG. 2A shows the elution diagram of the PA-glycan prepared from the antibody produced by the mfFUT8-6 strain
  • FIG. 2B shows the elution diagram of the PA-glycan prepared from the antibody produced by the PAGE249-transformed strain.
  • the vertical axis shows the relative fluorescence intensity
  • the horizontal axis shows the elution time.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of quantification of the amounts of FUT8 and actin transcripts in each host cell strain using the RT-PCR method.
  • CDNA prepared from ⁇ 2760-1 producing strain ⁇ 2760 # 58-35-16, ⁇ 2760-2 producing strain 1-15, and parental rat myeloma ⁇ 2 / 0 cells was designated as ⁇ type and FU8 specific.
  • the results obtained by performing a PCR reaction using a primer set (SEQ ID NOS: 13 and 14) or a] 3-actin-specific primer (SEQ ID NOs: 11 and 12) and subjecting the reaction solution to agarose gel electrophoresis are shown.
  • FIG. 4 is a diagram showing the construction of plasmid ploxPPuro.
  • FIG. 5 is a diagram showing the construction of a plasmid P K0FUT8gE2- 1.
  • FIG. 6 is a diagram showing the construction of plasmid pK0FUT8gE2-2.
  • FIG. 7 shows the construction of plasmid pscFUT8gE2-3.
  • FIG. 8 is a diagram showing the construction of plasmid pK0FUT8gE2-3.
  • FIG. 9 is a diagram showing the construction of plasmid pK0FUT8gE2-4.
  • FIG. 10 is a diagram showing the construction of plasmid pK0FUT8gE2_5.
  • FIG. 11 is a diagram showing the construction of plasmid pK0FUT8Puro.
  • Fig. 12 shows the broken 1,0-fucosyltransferase gene CH0 cell line.
  • 1 is a photograph showing the results of genomic Southern analysis of 1st. AFUT8 2-46-1 strain and 1st. AFUT8 2-46 strain.
  • FIG. 13 shows the results of genomic Southern analysis of the ⁇ 1,6-fucosyltransferase (FUT8) gene disrupted CH0 cell line, lst. AFUT8 2-46 strain and 2-46-H10 strain.
  • FIG. 14 is a photograph showing ADCC activity of the anti-CCR4 chimeric antibody purified from the FUT8 allele-disrupted strain.
  • the vertical axis indicates cytotoxic activity, and the horizontal axis indicates antibody concentration.
  • ⁇ and Awake indicate the activity of the purified antibody derived from the anti-CCR4 chimeric antibody-producing CH0 cell 5-03 strain and the purified antibody derived from the 1st. AFUT8 2-46-1 strain, respectively.
  • FIG. 15 is a diagram showing the construction of a plasmid P K0FUT8Neo.
  • FIG. 16 is a photograph showing the result of genomic southern analysis of a clone in which one copy of the FUT8 allele of CH0 / DG44 cells was disrupted.
  • FIG. 17 is a photograph showing the result of genomic southern analysis of a clone in which both FUT8 alleles of CH0 / DG44 cells were disrupted.
  • FIG. 18 is a photograph showing the results of genomic Southern analysis of a clone in which drug resistance genes have been removed from both FUT8 alleles of CH0 / DG44 cells.
  • FIG. 19 is a diagram showing the construction of plasmid pBs-2B8L.
  • FIG. 20 is a diagram showing the construction of plasmid pBs-2B8H and plasmid pBs_2B8Hm.
  • FIG. 21 is a diagram showing the construction of plasmid pKANTEX2B8P.
  • FIG. 22 is a view showing ADCC activity of an anti-CD20 chimeric antibody purified from a CH0 / DG44 cell-derived FUT8 gene double knockout strain on a human B lymphocyte culture cell line Raji.
  • the vertical axis indicates cytotoxic activity, and the horizontal axis indicates antibody concentration.
  • FIG. 23 is a diagram showing the construction of plasmid CHfFUT8-pCR2.1. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Example 1 Preparation of cells stably producing anti-CCR4 chimeric antibody
  • MTX (SIGMA), which is an agent, is suspended in Hybridoma-SFM-FBS (5) medium containing ⁇ to a concentration of 1-2 ⁇ 10 5 cells / ml, and placed on a 24 ⁇ : plate (Greiner). Each 1 ml was dispensed. After culturing at 37 ° C. for 1 to 2 weeks in a 5% CO 2 incubator, a transformant showing 50 nM MTX resistance was induced. The antigen-binding activity of the anti-CCR4 chimeric antibody in the culture supernatant of the wells in which the growth of the transformed strain was observed was measured by the ELISA method described in Example 2 (2).
  • IMDM- dFBS (10) medium was changed to (dialyzed FBS IMDM medium containing 10%), were cultured for 1-2 weeks. Since a colony of a transformant showing HT-independent growth appeared, the culture supernatant was recovered from the wells in which growth was observed, and the expression level of the anti-CCR4 chimeric antibody in the supernatant was determined in Example 2 (2). It was measured by the ELISA method described.
  • IMDM-dFBS 10 nM containing 50 nM MTX
  • the cells were suspended in a medium at a concentration of 1-2 ⁇ 10 5 cells / ml, and 0.5 ml was dispensed into 24 ⁇ l plates (manufactured by Iwaki Glass). After culturing at 37 ° C. for 1 to 2 weeks in a 5% CO 2 incubator, a transformant showing 50 nM MTX resistance was induced.
  • the MTX concentration was increased to 200 nM by the same method as described above, and finally, it was possible to grow on IMDM-dFBS (10) medium containing MTX at a concentration of 200 nM.
  • a transformant highly producing an anti-CCR4 chimeric antibody was obtained.
  • the resulting transformant was named 5-03 strain.
  • Example 2 Comparison of antibody composition produced by antibody-producing cells with reduced expression of FUT8 gene and antibody composition produced by parental cells
  • the ADCC activity was compared between an antibody composition produced by an antibody-producing cell in which the activity of the 1,6-fucose modifying enzyme was lower than that of the parent cell and an antibody composition produced by the parent cell.
  • KM2760 # 58-35-16 having a low transcript amount of the FUT8 gene described in (1) of Example 1 is used.
  • the antibody composition KM2760-1 purified from the culture supernatant of the strain was used.
  • the antibody composition produced by the rat myeloma YB2 / 0 cell (ATCC CRL1662) as the parent cell line was prepared as follows.
  • Hybridoma-SFM containing ⁇ at a concentration of 200 ⁇ was finally raised by the same method as above.
  • -A transformant capable of growing in the FBS (5) medium and highly producing an anti-CCR4 chimeric antibody was obtained.
  • the obtained transformant was designated as 1-15 strain.
  • the 1-15 strains were not converted into single cells (cloning) by the limiting dilution method.
  • the anti-CCR4 chimeric antibody produced by the obtained transformant strain 1-15 was purified as follows.
  • Hybridoma-SFM manufactured by Invitrogen
  • a transformant 1-15 expressing the anti-CCR4 chimeric antibody was cultured in 2 ⁇ 10 5 cells / cell.
  • the mixture was suspended in a constant-temperature room at 37 ° C using a spinner bottle (manufactured by Iwaki Glass) and stirred and cultured. Culture supernatant collected after culturing for 8-10 days
  • the anti-CCR4 chimeric antibody was purified using a Prosep_A (Millipore) column and gel filtration.
  • the purified anti-CCR4 chimeric antibody was named KM2760-2.
  • the antigen binding activity of the two types of antibody compositions obtained in Example (1) was measured by the following ELISA method.
  • Compound 1 (SEQ ID NO: 6) was selected as a human CCR4 extracellular domain peptide to which the anti-CCR4 chimeric antibody can react.
  • a conjugate with BSA Bovine Serum Albumin (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) was prepared by the following method and used as an antigen to be used for activity measurement by ELISA. That is, 100 mL of 25 mg / mL SMCC [4- (N-maleimide methyl) cyclohexane-1-carboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester] was added to 900 mL of PBS solution containing 10 mg of BSA (manufactured by Sigma).
  • the conjugate prepared as above was dispensed into a 96-well EIA plate (manufactured by Grainer Co., Ltd.) at 0.05 Aig / mL, 501 / ml, and left at 4 ° C for adsorption. I let it. After washing with PBS, 1% BSA-PBS was added at lOO / z L / well, and reacted at room temperature for 1 hour to block the remaining active groups. After washing each well with PBS containing 0.05% Tween20 (hereinafter referred to as TweeN-PBS), the culture supernatant of the transformed strain was added at 50 L / well, and reacted at room temperature for 1 hour.
  • TweeN-PBS PBS containing 0.05% Tween20
  • ADCC activity of the purified KM2760-1 and KM2760-2 was measured by the following method.
  • the ADCC activity of the anti-CCR4 chimeric antibody on CCR4 / EL-4 cells was measured as follows.
  • the target cell solution prepared in (1) above was dispensed into each well of a 96-well U-bottom plate (Falcon). Then, the human effector cell solution prepared in the above (2) was added in an amount of 100 iL (5 ⁇ 10 5 cells / well, the ratio of one human effecta cell to the target cell was 50: 1). Further, an anti-CCR4 chimeric antibody was added to each final concentration of 0.0001 to 10 ⁇ g / mL, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 4 hours. After the reaction, the plate was centrifuged, and the amount of 51 Cr in the supernatant was measured with a counter.
  • the amount of spontaneously dissociated 51 Cr was determined by performing the same operation as above using only the medium instead of the human effector cell solution and the antibody solution, and measuring the amount of 51 Cr in the supernatant. All solution The amount of released 51 Cr was determined by adding an lmol / L hydrochloric acid solution instead of the antibody solution and the human effector cell solution, performing the same operation as above, and measuring the amount of 51 Cr in the supernatant. ADCC activity (%) was determined by the following equation (I).
  • ADCC activity (%) X 100 (I)
  • the sugar chains of KM2760-1 and KM2760-2 were analyzed according to the following method.
  • the sugar chain fraction was dried with a centrifugal concentrator to obtain a purified PA-linked sugar chain group.
  • reverse-phase HPLC analysis of the purified PA-glycans was performed using a CLC-0DS column (manufactured by Shimadzu) (Fig. 2).
  • Buffer B (%) 0 60 60 0 0
  • the peaks (1) to (8) shown in FIG. 2 have the following structures, respectively.
  • GlcNAc is N-acetyldarcosamine
  • Gal is galactose
  • Man is mannose
  • Fuc is fucose
  • PA is a pyridylamino group.
  • the ratio of the sugar chains having no eel, 6 -fucose is the area occupied by the peaks (1) to (4) among (1) to (8), and al, 6 -fucose is bound.
  • the ratio of the sugar chain group was calculated from the area occupied by the peaks (5) to (8) among (1) to ( 8 ).
  • FIG. 3 shows the results of measuring the amount of the substance according to the quantification method described in Example 8 of W000 / 61739.
  • the expression level of the FUT8 gene in the 1-15 strain was equivalent to that of the parental cell line, rat myeloma YB2 / 0 cells, but the expression level of the KM2760 # 58-35-16 strain was clearly lower than these strains.
  • antibody-producing cells in which the activity of ct1,6-fucose modifying enzyme is lower than that of the parent cell line can produce an antibody composition having higher ADCC activity than the antibody composition produced by the parent cell line. It was confirmed that there was.
  • Example 3 Preparation of CH0 cells in which the FUT8 gene has been disrupted and production of antibodies using the cells
  • CH0 cells CH0 cells deleted from the genomic region containing etason 2 of the FUT8 gene were prepared, and the ADCC activity of antibodies produced by the cells was evaluated.
  • Plasmid ploxPPuro was constructed by the following procedure (Fig. 4).
  • the plasmid ploxPl.Owg described in JP-A-11-314512 was dissolved in 35 ⁇ l of NEBuffer 4 (manufactured by New England Biolabs), and 20 units of a restriction enzyme (manufactured by New England Biolabs) was added thereto. The digestion reaction was performed with C for 2 hours. After the digestion reaction,
  • Plasmid pFUT8fgE2-2 which has a genomic region containing exon 2 of Chinese hamster FUT8 obtained in Reference Example (2)
  • plasmid pK0FUT8gE2-l was constructed according to the following procedure (FIG. 5).
  • the enzyme EcoRV (New England Biolabs) was added and digestion reaction was performed at 37 ° C for 2 hours. After the digestion reaction, the solution was subjected to 0.8% (w / v) agarose gel electrophoresis to purify a DNA fragment of about 1.5 Kb.
  • a plasmid pK0FUT8gE2-2 was constructed according to the following procedure (FIG. 6).
  • the DNA fragment was dissolved in 30 il of NEBuffer 1 (manufactured by New England Biolabs) containing lOO ⁇ ug / ml BSA (manufactured by New England Biolabs), and 20 units of The digestion reaction was performed at 37 ° C for 2 hours with the addition of restriction enzyme Kpnl (New England Biolabs). After the digestion reaction, the solution was subjected to 0.8% (w / v) agarose gel electrophoresis to purify a DNA fragment of about 1.5 Kb.
  • the plasmid ploxPPuro 1. is dissolved in 30 ⁇ l of NEBuffer 4 (New England Biolabs), and 20 units of restriction enzyme 1 ⁇ 1 (New England Biolabs) is added. The digestion reaction is performed at 37 ° C for 2 hours. went. A DNA fragment was recovered from the reaction solution by the ethanol precipitation method, and then dissolved in 30 ⁇ l of NEBuffer 1 (New England Biolabs) containing lOO ⁇ g / ml BSA (New England Biolabs). Unit restriction enzyme (New England Biolabs) was added and digestion reaction was performed at 37 ° C for 2 hours. After the digestion reaction, the solution was subjected to 0.8% (w / v) agarose gel electrophoresis to purify a DNA fragment of about 3.5 Kb.
  • Plasmid pscFUT8gE2-3 was constructed by the following procedure using plasmid P FUT8fgE2-4 having a genomic region containing exon 2 of Chinese hamster FUT8 obtained in Reference Example (2) (FIG. 7).
  • Hpall-Hindlll fragment (about 3.5 Kb) derived from plasmid pFUT8fgE2-4 (about 3.5 Kb) obtained above, EcoRV-Hindlll fragment (about 2.8 Kb) derived from plasmid LITMUS39 (about 2.8 Kb) 1.0 ⁇ l, Ligation High (Toyobo 5.0 ⁇ l were mixed and reacted at 16 ° C. for 30 minutes to perform a binding reaction. The reaction solution was used to transform Escherichia coli DH5a strain, and plasmid DNA was isolated from the obtained ampicillin-resistant clones in accordance with a known method. This plasmid is hereinafter referred to as pscFUT8gE2-3.
  • plasmid pBluescriptll KS (+) (Strategene) was dissolved in 3B ⁇ 1 of NEBuffer for EcoRI (New England Biolabs), and 20 units of restriction enzyme EcoRI (New England Biolabs) and The digestion reaction was performed for 2 hours at 37 ° C. by adding 20 units of restriction enzyme (1111 (manufactured by New England Biolabs)). The solution was subjected to 0.8% (w / v) agarose gel electrophoresis to purify a DNA fragment of about 3.0 Kb.
  • Hindlll-EcoRI fragment (about 1.8 Kb) derived from plasmid pFUT8fgE2-4 (about 1.8 Kb) 4.0 ⁇ 1, Hindlll-EcoRI fragment (about 3.0 Kb) derived from plasmid pBluescriptll KS (+) 1.0 ⁇ 1, Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 5.0 ⁇ 1 was mixed and reacted at 16 ° C for 30 minutes to perform a binding reaction. The reaction solution was used to transform Escherichia coli DH5a strain, and plasmid DNA was isolated from the obtained ampicillin-resistant clones in accordance with a known method. This plasmid following, P K0FUT8gE2 - referred to 3.
  • the plasmid pscFUT8gE2-31.0 / ig was dissolved in NEBuffer for Sail (New England Biolabs) 351 containing lOO g / ml BSA (New England Biolabs) and the restriction enzyme il (New England Biolabs)
  • the digestion reaction was performed at 37 ° C for 2 hours after adding 20 units.
  • the DNA fragment was dissolved in NEBuffer 2 (New England Biolabs) 30/1, and 20 units of restriction enzyme Hindi II (New England Biolabs) was added.
  • the digestion reaction was performed at 37 ° C for 2 hours.
  • the solution was subjected to 0.8% (w / v) agarose gel electrophoresis to purify a DNA fragment of about 3.6 Kb.
  • plasmid pK0FUT8gE2-3 was dissolved in 35 ⁇ l of NEBuffer for Sail (New England Biolabs) containing 100 ⁇ g / ml BSA (New England Biolabs), and the restriction enzyme Sail ( (New England Biolabs) 20 units were added and digestion reaction was performed at 37 ° C for 2 hours. After recovering a DNA fragment from the reaction solution by an ethanol precipitation method, the DNA fragment was dissolved in NEBuffer 2 (New England Biolabs) 35 1, and 20 units of restriction enzyme Hindlll (New England Biolabs) was added. The digestion reaction was performed at ° C for 2 hours.
  • the Sail-HindiII fragment (approximately 3.1 Kb) derived from the plasmid pscFUT8gE2-3 (approximately 3.1 Kb) obtained above, the Sail-Hindlll fragment (approximately 4.8 Kb) derived from the plasmid pK0FUT8gE23 1.01, Ligation High (Toyobo 5.0 ⁇ l were mixed and reacted at 16 ° C. for 30 minutes to perform a binding reaction. Escherichia coli DH5 strain was transformed using the reaction solution, and plasmid DNA was isolated from the obtained ampicillin-resistant clones in accordance with a known method. This plasmid is hereinafter referred to as pK0FUT8gE2-4.
  • plasmid PK0FUT8gE2- 2 and PK0FUT8gE2- 4 obtained in the item (3) and (6), to construct a plasmid pK0FUT8 g E2- 5 by the following procedure (Fig. 10).
  • the plasmid pK0FUT8gE2-41.0 ⁇ g was dissolved in NEBu; fer4 (New England Biolabs) 30 ⁇ 1 and added with 20 units of restriction enzyme (New England Biolabs) for 2 hours at 25 ° C.
  • a digestion reaction was performed. After recovering the DNA fragment from the reaction solution by using the ethanol precipitation method, the DNA fragment was dissolved in NEBuffer 2 (manufactured by New England Biolabs) 301, and 20 units of restriction enzyme BamHI (manufactured by New England Biolabs) was added thereto. The digestion reaction was performed at C for 2 hours. After the digestion reaction, the solution was subjected to 0.8% (w / v) agarose gel electrophoresis to purify a DNA fragment of about 5.2 Kb.
  • Dissolve plasmid pKOSelectDT (Lexicon) 1.0 / ig in 50 ⁇ NE of NEBuffer 4 (New England Biolabs), add 16 units of restriction enzyme ⁇ ⁇ (New England Biolabs) and add at 37 ° C. The digestion reaction was performed for 2 hours. After the digestion reaction, the solution was subjected to 0.8% (w / v) agarose gel electrophoresis to purify a DNA fragment of about 1.2 Kb containing a diphtheria toxin expression kit.
  • RsrII-RsrII fragment (about 1.2 Kb) derived from plasmid pKOSelectDT obtained above ⁇ . ⁇ 1, Rsrll-Rsrll fragment derived from plasmid pK0FUT8gE2-5 (about 10.4 Kb) 1.01, sterilized water 3 .0 ⁇ l and Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 5.01 were mixed and allowed to react at 16 ° C. for 30 minutes to perform a binding reaction. Escherichia coli DH5 strain was transformed using the reaction solution, and plasmid DNA was isolated from the obtained ampicillin-resistant clones according to a known method. This plasmid hereinafter referred to as P K0FUT8Puro.
  • the gene transfer of plasmid pK0FUT8Puro into strain 5-03 was carried out according to the electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] according to the following procedure. went. First, 150 ⁇ g of plasmid pK0FUT8Puro is dissolved in 1.8 ml of NEBuffer for Sail (New England Biolabs), and 600 units of restriction enzyme ⁇ JJ (New England Biolabs) are added for 5 hours at 37 ° C. It was linearized by performing a digestion reaction. The reaction solution was subjected to phenol / chloroform extraction treatment and ethanol precipitation, and the recovered linearized plasmid was used as an aqueous solution.
  • 5 - 03 Strain K-PBS buffer (137mraol / l KC1, 2. 7mmol / l NaCl, 8. lmmol / 1 Na 2 HP0 have 1. 5mmol / l KH 2 P0 4 , 4. Ommol / 1 MgCl 2 ) to 8 ⁇ 10 7 cells / ml.
  • Cell suspension 200 1 after the (1.
  • the cells were suspended in IMDM medium (manufactured by Life Technologies) and seeded on 30 10-cm dishes for adherent cell culture (manufactured by Falcon). 5% C0 2, 37 After culturing for 24 hours under the conditions of ° C, the culture supernatant was removed and, 15 ⁇ g / mlPuromycin (SIGMA Co.) and 10% ⁇ shea dialyzed fetal serum (Life Technologie, Inc.) 10 ml of the added IMDM medium (manufactured by Life Technologies) was dispensed. The culture medium was exchanged every 3 to 4 days, and cultivation was performed for 10 days to obtain a Pyuguchi mycin-resistant strain.
  • IMDM medium manufactured by Life Technologies
  • the culture supernatant was removed from the 10 cm dish in which the puromycin-resistant strain appeared, and 7 ml of a phosphate buffer solution was injected, followed by transfer under a stereoscopic microscope.
  • a pipette man GILS0N
  • the colony was picked up and sucked, and collected into a round-bottom 96-well plate (Falcon).
  • each clone was seeded on a flat-bottom 96-well plate for adherent cells (manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.), and 15 / ⁇ g / ml Puromycin (manufactured by SIGMA) and 10% fetal dialysis serum (Ufe It was cultured for 1 week using IMDM medium (manufactured by TECH) supplemented with IMDM medium (manufactured by Life Technologies). After culturing, each clone on the plate was trypsinized and mixed with twice the amount of a freezing medium (20% DMSO, 40% fetal serum, 40% IMDM).
  • Replica plates were prepared by culturing for 1 week in IMDM medium (Life Technologies) supplemented with 15 / ig / ml Puromycin (SIGMA) and 10% fetal dialysis serum (Life Technologies). did.
  • Diagnosis of homologous recombination by genomic PCR was performed on the 900 clones obtained in this section (2) according to the following procedure.
  • genomic DNA of each clone was prepared from the replica plate prepared in this section (2) according to a known method [Analytical Biochemistry, 201, 331 (1992)]. This was dissolved in 30 ⁇ l of TE-RNase buffer (pH 8.0) (10 ml / l Tris-HC1, lramol / 1 EDTA, 200 ⁇ g / ml RNase A).
  • TE-RNase buffer pH 8.0
  • a primer shown in SEQ ID NO: 15
  • a primer that binds to the 16 ⁇ sequence in the vector Shown below).
  • the reaction solution 25 / zl each containing 10 1 genomic DNA dissolved solution prepared above [ExTaq buffer (manufactured by Takara Shuzo), 0.2 negation ol / l dNTPs, 0 .5 / iniol / l
  • the above gene-specific primers (SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16) were prepared and subjected to polymerase chain reaction (PCR).
  • the PCR was performed under the conditions of heating at 94 ° C for 3 minutes, followed by 38 cycles in which a single reaction consisting of 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes was performed. .
  • reaction mixture was subjected to 0.8% (w / v) agarose gel electrophoresis, and a specific amplification of about 1.7 Kb including the border between the CH0 cell genomic region and the targeting vector homologous region was observed. Those were designated as positive clones. One positive clone was found by this method.
  • This section (3) One clone positive in this section (3) was diagnosed by a genomic Southern blot for homologous recombination by the following procedure. Among the master plates stored by cryopreservation in the above (2), this section select 96 well plates containing positive clones found in (3), 5% C0 2 , 37 ° 10 min under the conditions of C It was left still. After standing, cells were seeded from a well corresponding to a positive clone into a flat bottom 24-well plate for adherent cells (Greiner).
  • the genome is transferred to a nylon membrane according to a known method [Procedures 'Ob' 'The National' Academy 'Off,' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 76, 3683 (1979)].
  • the DNA was transcribed. After the completion of the transfer, a heat treatment was performed on the Ni-nickel film at 80 ° C for 2 hours.
  • a probe used for Southern blot was prepared as follows. First, primers (SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10) were designed to bind to the sequence of the FUT8 genomic region obtained in the reference example that exceeded the targeting vector homologous region. Next, using DNA polymerase ExTaq (Takara Shuzo), 20 ⁇ l of a reaction solution [ExTaq buffer (Takara Shuzo) containing plasmid P FUT8fgE2-2 4. Ong obtained in Reference Example (2), 0.
  • the obtained probe DNA solution (5 ⁇ l) was radiolabeled using [ ⁇ - 32 P] dCTP 1.75 MBq and Megaprime DNA Labeling system, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech).
  • the hybridization was performed as follows. First, the above nylon membrane was sealed in a bottle, and hybridization solution [5 X SSPE, 50 X Denhaldt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 100 II g / ml salmon sperm DNA] was added and prehybridization was performed at 65 ° C for 3 hours. Next, the 32 P-labeled probe DNA was heat-denatured and put into a bottle, and heated at 65 ° C. for 1 B.
  • the nylon membrane was immersed in 50 ml of 2 ⁇ SSC-0.1% (w / v) SDS and heated at 65 ° C. for 15 minutes. After repeating the above washing operation twice, the membrane was immersed in 50 ml of 0.2 ⁇ SSC-0.1% (w / v) SDS, and heated at 65 ° C. for 15 minutes. After washing, the nickel film was exposed to X-ray film at ⁇ 80 ° C. and developed.
  • the Cre recombinase expression vector pBS185 (manufactured by Life Technologies) was introduced into the 1st. AFUT82 2-46 strain prepared in Section 2 of this Example.
  • Plasmid pBS185 was introduced into the 1st. AFUT82 2-46 strain by the following procedure according to the electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)].
  • 1st. AFUT8 the 2-46 strain K-PBS buffer [137 ⁇ ol / l KC1, 2. 7 thigh ol / l NaCl, 8. lmmol / 1 Na 2 HP0 4, 1. 5 Yuzuru ol / l KH 2 P0 4, was 4. 0 mmol / l suspended in MgCl 2] Nigoshi to 8 X 10 7 cells / ml. After the cell suspension 200 ⁇ ⁇ the (1.
  • the culture supernatant was removed from a 10-cm dish, 7 ml of a phosphate buffer was injected, and then transferred under a stereoscopic microscope.
  • colonies were picked up using a pipetman (manufactured by GILSON), sucked, and collected into a round-bottom 96-well plate (manufactured by Falcon).
  • trypsinization each clone was seeded on a flat-bottomed 96-well plate for adherent cells (manufactured by Iwaki Glass), and IMDM medium (manufactured by Life Technologies) supplemented with 10% fetal dialysis serum (manufactured by Life Technologies) ) For 1 week.
  • each clone on the plate was trypsinized, and mixed with twice the amount of a freezing medium (20% DMSO, 40% fetal serum, 40% IMDM). One half of this was seeded on a flat-bottom 96-well plate for adherent cells (Iwaki Glass Co., Ltd.) to prepare a replica plate, and the other half was frozen and stored as a master plate.
  • a freezing medium (20% DMSO, 40% fetal serum, 40% IMDM).
  • Diagnosis of drug-resistance gene elimination was performed by genomic Southern blot on any 6 of the positive clones found in this section (2) by the following procedure.
  • Genomic DNA of each clone was prepared from the plate according to a known method [Nucleic Acids Research, 3, 2303 (1976)], and ⁇ -RNase buffer (pH 8.0) (I0 mmol / 1 Tris-HC1, lmmol / 1 EDTA, 200 ⁇ g / ml RNase A) dissolved in 150 ⁇ l.
  • the sample is transferred to a nylon membrane according to a known method [Procedures 'Ob' 'The' National 'Academi 1' Ob Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 76, 3683 (1979)].
  • Genomic DNA was transcribed. After the completion of the transfer, a heat treatment was performed on the nip film at 80 ° C for 2 hours.
  • a probe used for the Southern plot was prepared as follows. First, primers (SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10) were designed to bind to the sequence of the FUT8 genomic region obtained in the reference example that exceeded the targeting vector homologous region. Next, using a DNA polymerase ExTaq (Takara Shuzo), 20 ⁇ l of the reaction solution [ExTaq buffer (Takara Shuzo), containing the plasmid pFUT8fgE2-2 4. Ong obtained in Reference Example (2), 0.2 The original gene-specific primers (SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10) were prepared and subjected to polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR was performed at 94 ° C for 1 minute, followed by 25 cycles of one cycle consisting of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 1 minute. .
  • the reaction solution was subjected to 1.75% (w / v) agarose gel electrophoresis to purify a probe DNA fragment of about 230 bp. 5 ⁇ l of the obtained probe DNA solution was radioactively labeled using [ ⁇ - 32 P] dCTP 1.75 MBq and Megaprime DNA Labeling system, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech).
  • the hybridization was performed as follows. First, the above nylon membrane was sealed in a bottle, and hybridization solution (5 X SSPE, 50 X Denhaldt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 100 ⁇ g / ml salmon sperm) DNA) and add 3 ml at 65 ° C for 3 hours. A pre-hyperlysis was performed. Next, the probe DNA labeled with 32 P was heat-denatured and put into a bottle, followed by heating at 65 ° C. for a while.
  • hybridization solution 5 X SSPE, 50 X Denhaldt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 100 ⁇ g / ml salmon sperm) DNA
  • the nylon membrane was immersed in 50 ml of 2 XSSC-0.1% (w / v) SDS and heated at 65 ° C for 15 minutes. After repeating the above washing operation twice, the membrane was immersed in 50 ml of 0.2 ⁇ SSC-0.1% (w / v) SDS, and heated at 65 ° C. for 15 minutes. After washing, the nickel film was exposed to X-ray film at ⁇ 80 ° C. and developed.
  • Treatment with the restriction enzyme BamHI described above yields a DNA fragment of approximately 25.5 Kb from the wild-type FUT8 allele.
  • a DNA fragment of about 20.0 Kb is generated from the allele that has undergone homologous recombination with the targeting vector by the same restriction enzyme treatment.
  • the puromycin resistance gene about 1.5 Kb is removed from the homologous allele, a DNA fragment of about 18.5 Kb is generated by the same treatment.
  • FIG. 12 shows the results of the genomic Southern of the above-mentioned 1st. AFUT8 2-46-1, 1st. AFUT82 2-46 and 5-03 strains. 1st.
  • AFUT8 2-46-1 is the name of 2-46-1, and was filed on September 26, 2001 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Patent Organism Depositary 1 (Higashi 1, Tsukuba, Ibaraki, Japan). Deposited as FERM BP-7755 at Chome No. 1 Central No. 6).
  • the 1st. AFUT8 2-46-1 strain in which one copy of the FUT8 allele obtained in Section 3 of the present example was torn, was transformed with a 10% fetal dialysis serum (Life) at a density of 3 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • IMDM medium Le Technologies
  • a total of 60 ml each was seeded on two T182 flasks for adhesion cell culture (Greiner). After culturing for 3 days, the supernatant was removed and replaced with a total of 60 ml of EXCELL301 medium (manufactured by JRH Biosciences).
  • a 0.8 cm diameter column is filled with Prosep-A HighCapacity (manufactured by bioPROCESSING) to a thickness of 2 cm, 10 ml of 0.1 mol / 1 citrate buffer (pH 3.0) and 10 ml of lmol / 1 glycine / NaOH-0.15 mol
  • the carrier was washed by washing with 10 ml of / l NaCl buffer (pH 8.6) sequentially.
  • 100 ml of each of the above culture supernatants was passed through the column, and washed with 50 ml of 1 mol / 1 glycine / NaOH-0.15 mol / l NaCl buffer (pH 8.6).
  • ADCC activity was measured using the CCR4-positive cell line CCR4 / EL-4 described in W001 / 6475.
  • RPMI1640-FBS 10% fetal serum
  • the pieces were suspended in RPMI1640- FBS (10) 500, by culturing 90 minutes by the addition of Na 2 51 Cr0 4 3. 7MBq 37 ° C, it was radiolabeled cells. After centrifugation at 1200 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, and the labeled cells were suspended in 5 ml of RPMI1640-FBS (IO). After repeating this washing operation three times, the cell suspension was allowed to stand on ice for 30 minutes to spontaneously dissociate radioactive substances. After the above washing operation was repeated twice, the target cells were suspended in RPMI1640-FBS (10) 5ral to prepare 2.0 ⁇ 10 5 cells / ml of the target cell suspension.
  • RPMI1640-FBS 10 ml
  • an effector cell suspension of 2.5 ⁇ 10 6 cells / ral was prepared using RPMI1640-FBS (IO).
  • the target cell suspension was dispensed into each well of a 96-well U-shaped bottom plate (manufactured by Falcon) in an amount of 50 ⁇ l (1 ⁇ 10 4 cells / well). Subsequently, the effector-cell suspension was dispensed into each well at a ratio of 25 ⁇ l (2.5 ⁇ 10 5 cells / well) to give a ratio of effector-cell to target cell of 25: 1.
  • RPMI1640-FBS (10) the anti-CCR4 antibodies obtained in Section 4 of this Example The 0.
  • liig / ml, 1 / g / ml, 10 g / ml dilution series was prepared by adding 50 ⁇ 1 each Ueru of the diluted solvent solution, final concentration 0.00 25 ⁇ / ⁇ 1, 0.025 ig / ml, 0.25 tg / ml and 2.5 / _tg / ml. After reacting under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. for 4 hours, the plate was centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes.
  • the value of the amount of spontaneously dissociated 51 Cr was determined by performing the above reaction in a system in which 150 ⁇ l of RPMI1640-FBS (10) was added instead of the effector cell suspension and the antibody solution. Further, by performing the above reaction in a system to which 100 ⁇ l of 1N hydrochloric acid and 50 ⁇ l of RPMI1640-FBS (10) were added instead of the effector cell suspension and antibody solution, the value of total dissociated 51 Cr was calculated. I asked. Using these values, the ADCC activity was determined by the formula (I) described in Example 2 (3).
  • FIG. 13 shows ADCC activities of various anti-CCR4 antibodies.
  • One copy of the FUT8 allele The antibody composition obtained from the 1st. AFUT8 2-46-1 strain that had been torn was significantly higher in ADCC than the antibody composition produced by the CH0 cell strain 5-03 before the gene disruption. Showed activity. No change was observed in the antigen binding activity of these antibody compositions. From the above results, it has been clarified that by disrupting the FUT8 allele in the host cell, the ADCC activity of the produced antibody composition can be increased.
  • Example 4 Acquisition of highly drug-resistant strain from CH0 cells in which one copy of FUT8 gene has been disrupted
  • the concentration of the drug for positive selection used to select the target vector-inserted strain in cells in which one of the genomic genes obtained by homologous recombination obtained by the homologous recombination method using the target vector was selected was increased about 10-fold. It is generally known that by culturing in a medium and obtaining a strain highly resistant to the drug, a strain in which both aryls are broken can be obtained (manipulating 'the' mouse 'embryo) .A'lab Laury-Ma-Yuanore, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), Production of Mutant Mice Using ES Cells).
  • a FUT8 2-46 1 ⁇ 10 8 cells were suspended in IMDM medium (Life Technologies) supplemented with 10% fetal dialysis serum (Life Technologies), and 10 cm dishes for adherent cell culture (Falcon After seeding on 20 sheets, the cells were cultured for 24 hours under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. After culturing, the supernatant was removed, 150 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 puromycin (SIGMA Co.) and 10% ⁇ shea dialyzed fetal serum (Life Technologie, Inc.) was added and the IMDM culture place a (Life Technologies Inc.) by 10ml Dispensed. The culture was performed for 12 days while repeating this medium exchange operation every 3 to 4 days.
  • each clone was inoculated, 150 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 Puromycin ( SIGMA Co.) and 10% ⁇ shea dialyzed fetal serum (Life Technologie (Life Technologies) supplemented with IMDM medium (Life Technologies) for 1 week. After the culture, each clone on the above plate was treated with trypsin, and mixed with twice the amount of the freezing medium [20% DMSO, 40% fetal serum, 40% IMDM].
  • Replica plates consist of 15 ig / ml puromycin (Sigma) and 10% fetal dialysis serum.
  • the cells were cultured for 1 week in IMDM medium (Ufe Technologies) supplemented with (Life Technologies). (2) Diagnosis of homologous recombination by genome Southern blot
  • the hybridization was performed as follows. First, the above nylon membrane is sealed in a bottle with a bottle, and the hybridization solution [5 X SSPE, 50 X Denhaldt's Liquid, 0.5 ° /. (w / v) 15 ml of SDS, 100 ⁇ g / ml salmon sperm DNA] was added, and prehybridization was performed at 65 ° C. for 3 hours. Next, the 32 P-labeled probe DNA was heat-denatured and put into a bottle, and heated at 65 ° C. for one Bj &.
  • the membrane was immersed in 50 ml of 2 ⁇ SSC—0.1 l ° / o (w / v) SDS and heated at 65 ° C. for 15 minutes. After repeating the above washing operation twice, the membrane was immersed in 50 ml of 0.2 X SSC-0. L ° / o (w / v) SDS, and heated at 65 ° C for 15 minutes. After washing, the nylon film was exposed to X-ray film at ⁇ 80 ° C. and developed.
  • a CH0 / DG44 cell line was constructed in which the genomic region containing the translation initiation codons of both FUT8 alleles was deleted.
  • plasmid pK0FUT8Puro 1 O wg is dissolved in 50 ⁇ l of NEBuf fer4 (New England Biolabs), digested with 37 units of restriction enzyme 1 ⁇ 2 £ 1 (New England Biolabs) and digested at 37 ° C for 2 hours. The reaction was performed.
  • Ascl-Ascl fragment (about 1.6 Kb) derived from plasmid pKOSelectNeo (about 1.6 Kb) 1.0 ⁇ 1, Ascl-Ascl fragment (about 10.1 Kb) derived from plasmid pK0FUT8Puro 1.0 ⁇ 1, sterile water 3.0 1
  • Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 5.0 ⁇ 1 was mixed and reacted at 16 ° C. for 30 minutes to perform a binding reaction.
  • E. coli DH5 a strain was transformed using the reaction solution, each plasmid DNA according to a known method from the obtained ampicillin-resistant clones were isolated. This plasmid is hereinafter referred to as pK0FUT8Neo.
  • the Chinese hamster FUT8 genome constructed in section 1 of this Example was used for Chinese hamster ovary-derived CH0 / DG44 cells lacking the dihydrofolate reductase gene (dhfr) [Somatic Cell and Moleculer Genetics, 12, 555 (1986)].
  • the region targeting vector pKOFUTSNeo was introduced.
  • the reaction solution was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, and the recovered linearized plasmid was used as a 1 ⁇ 8 / ⁇ 1 aqueous solution.
  • the CH0 / DG44 cells K-PBS buffer [137mmol / l KC1, 2. 7mmol / l NaCl, 8. lmmol / 1 Na 2 HP04, 1. 5ramol / l KH 2 P0 4, 4. 0mmol / l MgCl 2 ] to 8 ⁇ 10 7 cells / ml. After the cell suspension 200 / xl of (1.
  • IMDM medium manufactured by Invitrogen
  • 600 ⁇ g / ml G418 manufactured by Nacalai Tesque
  • 1-fold concentration of HT supplement manufactured by Invitroge
  • 10% fetal calf serum manufactured by Invitrogen
  • genomic DNA of each clone is prepared according to a known method [Analytical Biochemistry, 201, 331 (1992)], and use TE-RNase buffer (pH 8. 0) [I0mmol / 1 Tris-HC1, lramol / 1 EDTA, 200 ⁇ g / ml RNase A] Dissolved in 30 ⁇ .
  • a primer (SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15) that binds to the sequence beyond the targeting vector homologous region in the FUT8 genomic region obtained in the reference example and a primer (SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: Using 16), the following polymerase chain reaction (PCR) was performed.
  • reaction solution of 25 ⁇ 1 containing 10 11 each of the genomic DNA solution prepared above [DNA polymerase ExTaq (Takara Shuzo), ExTaq buffer (Takara Shuzo), 0.2 mmol / l dNTPs, 0.5 / x mol / l
  • the above gene-specific primer forward primer is SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15, lipper primer is SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16
  • PCR was performed under the conditions that a cycle consisting of a reaction consisting of 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes was defined as one cycle.
  • IMDM medium Invitrogen
  • 600 ig / ml G418 Nacalai Tesque
  • 1x HT supplement Invitrogen
  • 10% fetal calf serum Invitrogen
  • Genomic DNA of each clone was prepared from the plate according to a known method [Nucleic Acids Research, 3, 2303, (1976)], and TE-RNase buffer (pH 8.0) [10 mmol / l Tris-HC1, lramol / 1 EDTA ⁇ 200 ⁇ g / ml RNase A] 1501 was dissolved overnight.
  • the genomic DNA is transferred to a nylon membrane according to a known method [Procedures of the 'National' Kir 'of the Science (Pro Natl. Acad. Sci. USA), 76, 3683, (1979). Transcribed. After the transfer was completed, a heat treatment was performed on the Ni-nickel film at 80 ° C for 2 hours.
  • a probe used for Southern blot was prepared as follows. First, the following primers (SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10) were used to bind to the part of the FUT8 genomic region obtained in Reference Example that exceeded the targeting vector homologous region. PCR was performed.
  • the reaction solution [DNA polymerase ExTaq (Takara Shuzo), ExTaq buffer (Takara Shuzo), 0.2-arm ol / 20 ⁇ containing the plasmid P FUT8fgE2-4 Ong obtained in Reference Example (2) l dNTPs, 0.5 / mol / l Prepare the above gene-specific primers (SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10)], heat at 94 ° C for 1 minute, and then heat at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C The PCR was performed under 25 cycles of 30 seconds at 74 ° C. for 1 minute. After PCR, the reaction solution was subjected to 1.75% (w / v) agarose gel electrophoresis to purify a probe DNA fragment of about 230 bp. For the obtained probe DNA solution 51,
  • [A - 32 P] dCTP 1. 75MBq and Megaprime DNA Labeling system, and radiolabeled using dCTP (Amersham Pharmacia Biotech Inc.).
  • the hybridization was performed as follows. First, the above nylon membrane was sealed in a bottle with a bottle, and the hybridization solution [5X SSPE, 50X Denhaldt's solution, 0.5 ° /. (w / v) 15 ml of SDS, 100 ⁇ g / ml salmon sperm DNA] was added, and prehybridization was performed at 65 ° C. for 3 hours. Next, the 32 P-labeled probe DNA was heat-denatured and put into a bottle, which was then heated at 65 ° C. for a while.
  • the membrane was immersed in 50 ml of 2 ⁇ SSC—0.1% (w / v) SDS and heated at 65 ° C. for 15 minutes. After repeating the above washing operation twice, the membrane was immersed in 50 ml of 0.2 ⁇ SSC-0. 1% (w / v) SDS, and heated at 65 ° C. for 15 minutes. After washing, the nylon film was exposed to an X-ray film at -80 ° C and developed.
  • Example 3 The Chinese nomster FUT8 genomic region targeting vector pK0FUT8Puro constructed in Example 3, Item 1 was introduced into the FUT8 minockout clone 50-10-104 obtained in Example 2, Item 2.
  • the gene transfer of plasmid pK0FUT8Puro into 50-10-104 was carried out according to the electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] according to the following procedure.
  • the plasmid pK0FUT8Puro U0 ⁇ g was dissolved in 2.4 ml of NEBuffer for Sal I (manufactured by New England Biolabs) containing 100 / zg / ml BSA (manufactured by New England Biolabs), and 800 units of the restriction enzyme Sail ( (New England Biolabs) and a digestion reaction at 37 ° C. for 5 hours for linearization.
  • the reaction solution was subjected to a phenol / mouth opening form extraction treatment and ethanol precipitation, and the collected linearized plasmid was used as a 1 ⁇ g / 1 aqueous solution.
  • 50 - 10 104 K-PBS buffer [137mraol / l KC1, 2. 7mraol / l NaCl, 8. lmraol / 1 Na 2 HP04, 1. 5mmol / l KH 2 P0 4, 4. 0mraol / l Suspended in MgClJ to 8 ⁇ 10 7 cells / ml. After the cell suspension 200 il of (1.
  • Diagnosis of homologous recombination was performed on the drug-resistant clones obtained in this section (1) by genomic Southern plot according to the following procedure.
  • the culture supernatant was removed from the 10 cm dish in which the puromycin-resistant clone appeared, and 7 ml of phosphate buffer was injected, and then transferred under a stereoscopic microscope. Next, use a pipette man (GILS0N) to remove the colonies and suck them into a round bottom 96-well plate.
  • a pipette man GILS0N
  • each clone on the plate was trypsinized and seeded on a flat-bottomed 24-well plate for adherent cells (Greiner).
  • IMDM medium Invitrogen
  • SIGMA lS ⁇ g / ml puromycin
  • 1x HT supplement Invitrogen
  • 10% fetal fetal serum Invitrogen
  • genomic DNA of each clone was prepared according to a known method [Nucleic Acids Research, 3, 2303, (1976)], and TE-RNase buffer (pH 8.0) [10 mmol / l 1 Tris-HC1, lmmol / 1 EDTA, 200 ⁇ g / ml RNase A] was dissolved in 150 ⁇ l.
  • genomic DNA is transferred to a nylon membrane according to a known method [Procedures' ob '' the 'National' Academy 'ob' Science (Pro Natl. Acad. Sci. USA), 76, 3683, (1979). did. After the transfer was completed, a heat treatment was performed on the Ni-nickel film at 80 ° C for 2 hours.
  • a probe used for Southern blot was prepared as follows. First, the following PCR was performed using primers (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) that bind to the sequence of the FUT8 genomic region beyond the targeting vector homologous region.
  • a reaction solution of 20 ⁇ 1 containing the plasmid pFUT8fgE2-4 Ong obtained in Reference Example (2) [DNA polymerase ExTaq (Takara Shuzo), ExTaq buffer (Takara Shuzo), 0.2 bandol ol / l dNTPs, 0.5 ⁇ 1 / 1
  • PCR was performed under the conditions of 25 cycles, in which a reaction consisting of 1 minute at 74 ° C. for 1 second was performed.
  • the reaction solution was subjected to 1.75% (w / v) agarose gel electrophoresis to purify a probe DNA fragment of about 230 bp.
  • 5 ⁇ l of the obtained probe DNA solution was radiolabeled using [Hi- 32 P] dCTP (1.75 MBq of Megaprime DNA Labeling system, dCTP manufactured by Amershara Pharmacia Biotech). The high predication is performed as follows.
  • the above nylon membrane was sealed in a bottle with a bottle, and a hybridization solution [5 X SSPE, 50 X Denhaldt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 100 tg / ml salmon sperm DNA] 15 ml , And prehybridization was performed at 65 ° C for 3 hours.
  • the probe DNA labeled with 32 P was heat-denatured and put into a bottle, and heated at ⁇ 65 ° C.
  • the membrane was immersed in 50 ml of 2 ⁇ SSC—0.1% (w / v) SDS and heated at 65 ° C. for 15 minutes. After the above washing operation was repeated twice, the membrane was immersed in 50 ml of 0.2 ⁇ SSC-0. L% (w / v) SDS, and heated at 65 ° C. for 15 minutes. After washing, apply nylon membrane to X-ray film -80. Exposure was carried out with C and developed.
  • the cells suspension was 200 1 (1.
  • Arbitrary clones were collected from the colonies obtained by introducing the gene into WK704 by the following procedure. First, the culture supernatant was removed from a 10 cm dish, 7 ml of phosphate buffer was injected, and then transferred under a stereoscopic microscope. Next, using a pipetteman (GILS0N), the colonies were picked up and sucked, and collected into a round-bottom 96-well plate (Falcon). After trypsinization, each clone was seeded on a flat-bottomed 96-well plate for adherent cells (manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.). The cells were cultured for one week using an IMDM medium (manufactured by Invitrogen) supplemented with.
  • IMDM medium manufactured by Invitrogen
  • each clone on the above plate was treated with trypsin, and mixed with twice the amount of the freezing medium [20% DMSO, 40% fetal serum, 40% IMDM]. Half of this was seeded on a flat-bottom 96-well plate for adherent cells (Iwaki Glass) to make a replica plate, and the other half was frozen and stored as a master plate.
  • the replica plate was diluted with 600 / g / ml G418 (Nacalai Tester), 15 ⁇ g / ml puromycin (SIGMA), 10% fetal serum (Invitrogen) and 1x HT supplement ( The cells were cultured for 7 days using IMDM medium (Invitrogen) supplemented with Invitrogen. Positive clones in which the drug resistance genes on both alleles sandwiched between the ⁇ sequences have been removed by the expression of Cre recombinase die in the presence of G418 and puromycin. Positive clones were found by this negative selection method.
  • a 96-well plate containing the above positive clones was selected and allowed to stand for 10 minutes at 5% CO 2 and 37 ° C. After standing, cells from the wells corresponding to the above clones were transferred to a flat-bottom 24-well plate for adherent cells (Greiner Seeds). After culturing for 1 week in IMDM medium (Invitrogen) supplemented with 10% fetal serum (Invitrogen) and 1-fold HT supplement (Invitrogen), a flat bottom 6-well plate for adherent cells ( Greiner).
  • Genomic DNA of each clone was prepared from the plate according to a known method [Nucleic Acids Research, 3, 2303, (1976)], and TE-RNase buffer (pH 8.0) [10 mmol / l Tris-HC1, lmmol / 1 EDTA, 200 ⁇ g / ml RNase A] was dissolved in 150 ⁇ l.
  • the genomic DNA is transferred to a nylon membrane according to a known method [Procedin's' ob '' the 'Nashinanore' academy 'ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 76, 3683, (1979). Was transcribed. After the transfer was completed, the thin film was heat-treated at 80 ° C for 2 hours.
  • a probe used for the Southern plot was prepared as follows. First, the following PCR was performed using primers (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) that bind to the sequence of the FUT8 genomic region beyond the targeting vector homologous region.
  • the reaction solution was subjected to 1.75% (w / v) agarose gel electrophoresis to purify a probe DNA fragment of about 230 bp. 5 ⁇ l of the obtained probe DNA solution was radiolabeled using [ ⁇ - 32 P] dCTP 1.75 MBq and Megaprime DNA Labeling system, dCTP (manufactured by Amersnam Pharmacia Biotech).
  • the hybridization was performed as follows. First, the above nylon membrane was sealed in a bottle, and a hybridization solution [5 X SSPE, 50 X Denhaldt, s solution, 0.5% (w / v) SDS, 100 ⁇ g / ml salmon sperm DNA] Add 15 ml and press at 65 ° C for 3 hours. Re-hyperidization was performed. Next, the probe DNA labeled with 32 P was heat-denatured and put into a bottle, and heated at ⁇ 65 ° C.
  • the membrane was immersed in 50 ml of 2 ⁇ SSC—0.1% (W / V) SDS and heated at 65 ° C. for 15 minutes. After repeating the above washing operation twice, the membrane was immersed in 50 ml of 0.2 X SSC-0.1% (W / V) SDS and heated at 65 ° C for 15 minutes. After washing, the nylon film was exposed to an X-ray film at -80 ° C and developed.
  • the Nhel treatment with the restriction enzyme described above generates a DNA fragment of approximately 8.0 Kb from the wild-type FUT8 allele.
  • a DNA fragment of about 9.5 Kb was generated from the allele that had undergone homologous recombination with the targeting vector by the same restriction enzyme treatment.
  • the neomycin resistance gene about 1.6 Kb
  • the pure bitemycin resistance gene about 1.5 Kb
  • the genomic DNA of the tested positive clone 4-5-C3 (4 (3) positive clone in Example 5) was homologous recombination region-specific with the drug-resistant gene removed.
  • a cDNA encoding the amino acid sequence of the VL of the anti-CD20 mouse monoclonal antibody 2B8 described in W094 / 11026 was constructed by PCR as follows.
  • the 5'-end and 3'-end of the nucleotide sequence of VL described in W094 / 11026, the binding nucleotide sequence of the primer for amplification during PCR reaction (restriction enzyme recognition sequence for cloning into a humanized antibody expression vector) ).
  • six synthetic DNAs of SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23, and 24 were prepared (consigned to GENSET) in the alternate order of the antisense strand.
  • Each oligonucleotide was adjusted to a final concentration of 0.1 / M with 50 reaction mixtures [PCR Buffer # 1 with K0D DNA Polymerase (Toyobo), 0.2raM dNTPs, IraM Gnesium, 0.5 ⁇ M13 primer M4 (Takara Shuzo), 0.5 / M M13 primer RV (Takara Shuzo)] and DNA thermal cycler GeneAmp PGR System 9600
  • a cDNA encoding the amino acid sequence of VH of the anti-CD20 mouse monoclonal antibody 2B8 described in W094 / 11026 was constructed by PCR using the following method.
  • the 5'-end and 3'-end of the nucleotide sequence of VH described in TO94 / 11026, the binding base sequence of the amplification primer during the PCR reaction (the restriction enzyme recognition sequence for cloning into a human antibody expression vector is also included). Included). Divide the designed base sequence into a total of 6 base sequences of about 100 bases from the 5 'end side (adjacent base sequences should have an overlapping sequence of about 20 bases at their ends), Actually, six synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 25, 26, 27, 28, 29, and 30 were prepared (consigned to GENSET) in the alternate order of the antisense strand.
  • Escherichia coli DH5a strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed using the recombinant plasmid DNA solution thus obtained.
  • Each plasmid DNA was prepared from the clone of the transformant, and reacted using BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0 (manufactured by Applied Biosystems) according to the attached instructions, followed by base sequencing using the DNA sequencer ABI PRISM 377 of the company. The sequence was analyzed. Thus, the plasmid pBS-2B8H shown in FIG. 20 having the desired nucleotide sequence was obtained.
  • reaction mixture containing lng of the above plasmid pBS-2B8H [LA PCR Buffer II (Takara Shuzo), 2.5 units of TaKaRa LA Taq, 0.4 mM dNTPs, 2.5 mM magnesium chloride, 50 nM T3 BcaBEST Sequencing primer (Takara Shuzo Co., Ltd.) and 50 nM of the above primer for mutation introduction (SEQ ID NO: 31, GENSET Co.) were prepared, and DNA thermal cycler was performed using GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer). A cycle of 30 seconds at 55 ° C, 2 minutes at 55 ° C, and 1 minute 30 seconds at 72 ° C was performed 25 times. After agarose gel electrophoresis of the reaction solution 30, the QIAquick Gel Extraction Kit
  • the reaction mixture 30 was agarose gel electric After the electrophoresis, a PCR product of about 0.63 kb was recovered using a QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) and used as a 30 ⁇ L aqueous solution. Subsequently, 0.45 kb of the PCR product obtained above and 0.63 kb of the PCR product were each divided into 0.5 and 47.5 ⁇ of the reaction solution [LA PCR Buffer II (Takara Shuzo), 0.4 mM dNTPs.
  • An expression vector PKANTEX2B8P for a CD20 human chimeric antibody (hereinafter referred to as an anti-CD20 chimeric antibody) was constructed as follows.
  • the plasmid pBS-2B8L obtained in this section (1) is reacted at 55 ° C for 1 hour with 10 units of restriction enzyme WI (manufactured by New England Biolabs), and then an additional 10 units of restriction enzyme ⁇ RI (Takara Shuzo) at 37 ° C for 1 hour.
  • the reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and a BsiWI-EcoRI fragment of about 0.41 kb was recovered.
  • 2 ⁇ g of the humanized antibody expression vector pKANTEX93 was reacted for 1 hour at 55 ° C.
  • the resulting plasmid pBS in the item (2) - After reacting for 1 hour at 37 ° C for using 2 mu ⁇ the 10 units of a restriction of 2B8Hm enzyme ⁇ I (Takara Shuzo), further 10 The reaction was carried out at 37 ° C. for 1 hour using enzyme l (Takara Shuzo). The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and an Apal-Notl fragment of about 0.45 kb was recovered.
  • the Apal-Notl fragment derived from the plasmid pBS_2B8Hm and the Apal-Notl fragment derived from the plasmid PKANTEX2B8-L were obtained using Solution I of DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.). It was linked according to the book. Escherichia coli DH5a strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed using the recombinant plasmid DNA solution thus obtained, and each plasmid DNA was prepared from the clone of the transformed strain.
  • Example 5 The anti-CD20 antibody expression vector pKANTEX2B8P obtained in the first section of this example was introduced into the double knockout clone WK704 of the FUT8 gene prepared in the third section. Gene transfer of plasmid PKANTEX2B8P into WK704 is performed by electroporation.
  • the WK704-2B8P strain is the name of the WK704-2B8P strain, and was set up on March 20, 2003 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Central 6th, 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan). ) Has been deposited as FERM BP-8337.
  • Example 5 The anti-ganglioside GD3 chimeric antibody expression vector plasmid pKANTEX641 was introduced into the FUT8 gene double knockout clone WK704 prepared in Section 3 to prepare a stable anti-GD3 chimeric antibody expression strain.
  • PKANTEX641 was prepared using the anti-GD3 chimeric antibody expression vector plasmid pChi641LHGM4 described in TO00 / 61739 and the humanized antibody.
  • Working vector PKANTEX93 [(...
  • Example 5 The anti-CCR4 chimeric antibody expression vector pKANTEX2160 described in TO01 / 64754 was introduced into the FUT8 gene double knockout clone WK704 prepared in Section 3 to prepare a stable anti-CCR chimeric antibody expression strain.
  • the plasmid pKANTEX2B8P was introduced into WK704 by the following procedure according to the electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]. First, dissolve 15 g of plasmid pKANTEX2160 in 100 ⁇ l of NEBuffer 4 (New England Biolabs), add 40 units of restriction enzyme Aatll (New England Biolabs), and perform digestion reaction at 37 ° C for 2 hours. It was linear.
  • the reaction solution was subjected to phenol / chloroform extraction treatment and ethanol precipitation, and the recovered linearized plasmid was used as a lig / ⁇ ⁇ aqueous solution.
  • replace WK704 with K-PBS buffer
  • the anti-CD20 antibody-expressing strain WK704-2B8P obtained in Section 2 of this Example was transferred into IMDM medium (Invitrogen) supplemented with 10% fetal dialysis serum (Invitrogen) at 3 ⁇ 10 5 cells / ml. After suspension at a density of, a total of 300 ml was seeded on 10 T182 flasks (Greiner) for adherent cell culture. Similarly, the anti-GD3 antibody-expressing strain WK704-2871 obtained in the third section of the present example and the anti-CCR4 antibody expressing strain WK704-2760 obtained in the fourth section of the present example were seeded.
  • a 0.8 cm diameter column is filled with 0.5 ml of Mab Select (Araersham Pharmacia Biotech) and purified water 3.0 ml and 0.2 mol / l boric acid 0.15 mol / l NaCl buffer
  • ADCC activity was measured according to the following description.
  • RPMI1640-FCS 10-10 Cultured human B lymphocyte cell line Raji cells (JCRB9012) cultured in medium (RPI1640 medium containing 10% FCS (GIBC0 BRL)) were centrifuged and suspended to obtain RPMI1640-FCS ( 5) After washing with a medium (RPI1640 medium containing 5% of FCS (manufactured by GIBCO BRL)), the cells were adjusted to 2 ⁇ 10 5 cells / mL with RPMI1640-FCS (5) medium to obtain a target cell solution.
  • the plate was centrifuged, and the lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant was measured using a CytoTox96 NoN-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega).
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the amount of spontaneously free LDH in target cells was determined by performing the same operation as above using only the medium instead of the effector cell solution and the antibody solution, and measuring the LDH activity of the supernatant.
  • the absorbance data of the spontaneous release of the effector cells was obtained by performing the same operation as above using only the medium instead of the target cell solution and the antibody solution.
  • the total amount of free LDH due to destruction of all target cells was determined by using a medium instead of the antibody solution and the effecta-one-cell solution, adding the 9% Triton X-100 solution 45 minutes before the end of the reaction, and performing the same procedure as above. It was determined by measuring the LDH activity of the supernatant. Using these values, ADCC activity was determined by the following equation (II).
  • ADCC activity (%) X 100 (II)
  • FIG. 22 shows the ADCC activity of each anti-CD20 antibody.
  • the antibody obtained from the FUT8 gene double knockout clone WK704-2B8P showed higher ADCC activity than commercial Rituxan TM at any antibody concentration, and also had the highest cytotoxic activity value.
  • Rituxan TM is an anti-CD20 chimeric antibody produced using CH0 cells in which the FUT8 gene has not been disrupted as host cells.
  • the sugar chain analysis of the anti-CD20 antibody, anti-GD3 antibody and anti-CCR4 antibody produced by the FUT8 gene double knockout clone obtained in Example 6 was performed according to the method described in Example 2. (4). Monosaccharide composition analysis was performed on the sugar chain composition of these antibodies according to a known method [Journal of Liquid Chromatography, 6, 1577, (1983)]. As a result, no fucose-containing sugar chain structure was confirmed in any of the antibodies obtained from the FUT8 gene double knockout clone WK704.
  • the reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis to purify about 2 Kb of the specific amplified fragment. 4 ⁇ l of this DNA fragment was prepared using the T0P0 TA cloning Kit (Invitrogen).
  • the plasmid PCR2.1 was introduced according to the instruction manual, and the reaction mixture was used to transform Escherichia coli DH5 strain. Plasmid DNA was isolated from each of the obtained kanamycin-resistant colonies from eight clones in which cDNA was integrated according to a known method.
  • the nucleotide sequence of the cDNA inserted into each plasmid was determined using the DNA Sequencer 377 (Parkin Elmer) and the BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Parkin Elmer). According to the attached manual. By this method, it was confirmed that all the inserted cDNAs encode a sequence including the full length of 0RF of FUT8 in CH0 cells. Among these, a plasmid DNA was selected which did not contain any base reading errors due to PCR in the sequence.
  • the present plasmid CHfFUT 8 - called pCR2 1 and..
  • the determined nucleotide sequence of the CH0 cell FUT8 cDNA is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • CH0 cell FUT80RF full-length cDNA fragment obtained in this section (1) was obtained according to a known genomic screening method described in, for example, Irizu, 'In' Morekiura Ibiology, A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989).
  • genomic clone is digested with various restriction enzymes, and Southern hybridization is performed using an AfaI-Sau3AI fragment (about 280 bp) containing the initiation codon of CH0 cell FUT8 cDNA as a probe. Among them, a fragment (about 2.5 Kb) and a Sac-to-Sacl fragment (about 6.5 Kb) were selected and inserted into pBluescriptll KS (+) (Strategene).
  • the nucleotide sequence of each genomic fragment obtained was determined using DNA Sequencer-377 (Parkin Elmer) and BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Parkin Elmer), and the method was in accordance with the attached manual. According to this method, the Xbal-Xbal fragment has a sequence of about 2.5 Kb of the upstream intron containing exon 2 of FUT8 in CH0 cells, and the Sacl-Sacl fragment has a sequence of about 6.5 Kb of the downstream intron containing exon 2 of FUT8 in CH0 cells. It was confirmed that each encoded.
  • pFUT8f g E2- 4 plasmids containing plasmid P FUT8fgE2- 2, Sacl-Sacl fragment containing the Xbal-Xbal fragment.
  • the determined nucleotide sequence (approximately 9.0 Kb) of the genomic region including exon 2 of FUT8 in CH0 cells is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the present invention has been designed to reduce or eliminate the activity of an enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ - linked to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain.
  • Cell whose genome is modified, method for producing antibody composition using the cell, transgenic non-human animal or plant produced using the cell, antibody composition produced by the method, and antibody A medicament containing the composition can be provided. Sequence listing free text
  • SEQ ID NO: 30 Description of artificial sequence Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 31 Description of artificial sequence: Synthetic DNA

Description

• 明 細 書 ゲノムが改変された細胞 技術分野
本発明は、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1 位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親株細胞よ りも低下または欠失するように、 ゲノムが改変された細胞および該細胞を用いた 抗体分子の製造方法に関する。 背景技術
抗体 IgG分子の Fc領域には、 2個所の N-グリコシド型の糖鎖結合部位が存在し ており、 血清中の IgG では、 通常、 この部位に、 シアル酸やバイセクティングの N-ァセチルダルコサミンの付加の程度が少ない複数本の枝を持つコンプレックス 型糖鎖が結合している。 このコンプレックス型糖鎖の非還元末端でのガラクトー スの付加おょぴ還元末端の N-ァセチルダルコサミンへのフコースの付加に関して は多様性があることが知られている [バイオケミストリー （Biochemistry) , 36, 130， 1997] o
このような糖鎖の構造は、 糖鎖遺伝子、 すなわち、 糖鎖を合成する糖転移酵素 と糖鎖を分解する糖分解酵素の遺伝子によって規定されていると考えられている。 以下に、 N-ダリコシド結合糖鎖の生合成に関して述べる。
糖蛋白質は、 小胞体 （以下、 E Rと表記する） 内腔で糖鎖の修飾を受ける。 N- グリコシド結合糖鎖の生合成過程では、 比較的大きな糖鎖が、 E R内腔で伸長し つつあるポリペプチド鎖に転移される。 この際、 糖鎖はまず、 ドリコールリン酸
(以下、 P- Dol とも表記する） と呼ばれる ーィソプレン単位を 20個程度含む長 鎖の脂質担体のリン酸基に順次付カ卩される。 すなわち、 ドリコーノレリン酸に N-ァ セチル -ダルコサミン （以下、 GlcNA とも表記する） が転移され GlcNAc - P- P_Dol となり、 続いてもう 1個 GlcNAcが転移され GlcNAc - GlcNAc - P - P - Dolとなる。 次い で、 マンノース （以下、 Man とも表記する） 力 S 5個転移され （Man) 5 - (GlcNAc) 2 - P_P- Dol に、 さらに、 Manが 4個、 グルコース （以下、 Glc とも表記する） 力 S 3 個転移される。 このようにして、 コアオリゴ糖と呼ばれる糖鎖の前駆体 （Glc) 3 -
(Man) 9- (GlcNAc) 2- P- P-Dolができる。 この 14個の糖からなる糖鎖の前駆体は ァスパラギン一 X—セリンまたはァスパラギン一 X—スレオニン配列を持ったポ リペプチドへ E R內腔でひとかたまりのまま転移される。 この際、 コアオリゴ糖 に結合していたドリコールピロリン酸 （P- P- Dol) は遊離するが、 ピロホスファタ ーゼ'の分解を受けて再ぴドリコールリン酸となり再利用される。 糖鎖のトリミン グは、 糖鎖がポリペプチドに結合すると直ちに開始される。 すなわち、 3個の Glc と 1ないし 2個の Manが E R上で除去され、 この除去には ο; 1、 2ダルコシダーゼ I、 ひ 1、 3—ダルコシダーゼ IIおよぴひ 1、 2マンノシダーゼが関与することが知 られている。 E R上でトリミングを受けた糖蛋白質はゴルジ体へ輸送され様々な 修飾を受ける。 ゴルジ体シス部には、 マンノースリン酸を付加する Ν-ァセチルダ ノレコサミンホスホトランスフェラーゼ、 Ν-ァセチノレグノレコサミン 1一ホスホジェ ステル α— Ν-ァセチルグルコサミニダーゼおよび α—マンノシダーゼ I が存在し、 Man残基を 5 個にまで減少させる。 ゴルジ体メディア部には、 コンプレックス型 の N -ダリコシド結合糖鎖の最初の外側の GlcNAc を付加する N-ァセチルダルコサ ミン転移酵素 I (GnTI) 、 2個の Man を除去する α—マンノシダーゼ II、 外側か ら 2個目の GlcNAcを付加する N-ァセチルダルコサミン転移酵素 II (GnTII) 、 還 元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースを付カ卩するひ 1, 6-フコシルトランス フェラーゼが存在する。 ゴルジ体トランス部にはガラク トースを付加するガラク トース転移酵素、 N-ァセチルノイラミン酸などのシアル酸を付加するシアル酸転 移酵素が存在する。 このような各種酵素の作用を受けて N-グリコシド結合糖鎖が 作られることが知られている。
抗体の糖鎖に関しては、 抗体の N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダ ルコサミンへのフコースの付加修飾によって、 抗体の抗体依存性細胞障害活性
(以下、 ADCC 活性と表記する） が大きく変化することが報告されている
(W000/61739) 。 これらの報告は、 ヒ ト IgGlサブクラスの抗体のエフヱクタ一機 能に糖鎖の構造が極めて重要な役割を果たしていることを示している。
一般的に、 医薬への応用が考えられているヒ ト化抗体の多くは、 遺伝子組換え 技術を用いて作製され、 動物細胞、 例えばチャイニーズハムスター卵巣組織由来 C H O細胞などを宿主細胞として用いて製造されているが、 上述したように、 抗 体のエフェクター機能には糖鎖構造が極めて重要な役割を担っていること、 宿主 細胞によって発現された糖蛋白質の糖鎖構造に違レ、が観察されることから、 より 高いエフェクター機能を有する抗体を作製することが可能な宿主細胞の開発が望 まれている。 また、 糖鎖の修飾に関わる酵素遺伝子を導入することによって、 生産される糖 蛋白質の糖鎖構造を改変することも試みられており、 その具体的な例としては、
1) ラットの ]3—ガラクトシド (¾ 2、 6—シァリルトランスフェラーゼを C H O細胞 に導入することで糖鎖の非還元末端にシアル酸が多く付加された蛋白質の製造が 可能であること [ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル'ケミストリーひ. Biol. Chem. )， 261, 13848, 1989]、 2) ヒ トの j8—ガラク トシド 2— αフコシルトラン スフヱラーゼをマウス L細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にフコース （以 下、 Fuc とも表記する） が付カ卩された H抗原 （Fuc α 1 - 2Gal 0 1 -） の発現が可能で あること [サイエンス（Science) , 252， 1668， 1991]、 3) β 1、 4—Ν-ァセチルグル コサミン転移酵素 III (GnTIII) を導入した C H O細胞を用いて抗体を生産する ことで N -グリコシド結合糖鎖のバイセクティングに位置する N -ァセチルダルコサ ミンの付加の割合が高い抗体の生産が可能であること [ダリコバイオロジー (Glycobiology) , 5， 813 (1995) ： W099/54342] が報告されている。 GnTIII を導 入した C H O細胞を用いて抗体を発現させた場合には、 親株で発現させた抗体と 比べて 16倍高い A D C C活性が得られることが示されている。 しかしながら、 GnTIII あるいは /3 1， 4一 N-ァセチルダルコサミン転移酵素 V (GnTV) の過剰発現 は C H O細胞に対して毒性を示すと報告されているため、 抗体医薬の生産には適 切ではない。
糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子の活性が変化した突然変異体を宿主細胞として 用いることで、 生産される糖鎖構造が変化した糖蛋白質の生産例も報告されてお り、 その具体的な例としては、 N-ァセチルダルコサミン転移酵素 I (GnTI) の活 性が欠損している C H O細胞変異株を用いてハイマンノース型糖鎖構造を有する 抗体を生産した報告を挙げることができる [ジャーナル'ォブ 'ィムノロジー（J. Immunol. ) , 160, 3393， 1998]。 また、 C M P—シアル酸トランスポーターや U D P—ガラクトーストランスポーターの欠損株を用いて、 糠鎖非還元末端側にシァ ル酸が付加していない糖鎖構造を有する抗体の発現や、 ガラクトースの付加のな レ、抗体の発現例が報告されているが、 医薬への応用に適したエフェクタ一作用が 向上した抗体の発現には成功していない [ジャーナル'ォブ ·ィムノ口ジー (J. Immunol. ) , 160, 3393, 1998]。 これら変異株は、 変異剤処理によりランダムに変 異が導入された結果の株として取得されており、 医薬品製造に用いる株としては 適切ではない。 一方、 宿主細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子を標的とし意図 的に標的遺伝子のみを破壊した細胞株を用いて糖蛋白質である抗体の生産を試み た報告はこれまでにない。
このように、 生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変するために、 宿主細胞の糖 鎖の修飾に関わる酵素の活性を調節する試みがなされているが、 実際には糖鎖の 修飾機構は多様かつ複雑であり、 力つ糖鎖が持つ生理的な役割の解明も十分とは 言い難いため試行錯誤を繰り返しているのが現状である。 特に、 抗体のエフヱク タ一機能は糖鎖構造により大きな影響を受けることが明らかになりつつあるが、 最適な糖鎖構造で修飾された抗体分子を生産しうる宿主細胞の取得には至ってい ない。 発明の開示
本発明は、 以下の （1) 〜 （43) に関する。
(1) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親株細胞よりも 低下または欠失するようにゲノムが改変された細胞。
(2) Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノック アウトされた、 （1) 記載の細胞。
(3) Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子 のすべてがノックァゥトされた（1)または（2)に記載の細胞。
(4) Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、 ひ 1， 6 -フコシノレトラ ンスフヱラーゼである、 （1)〜（3)のレ、ずれか 1項に記載の細胞。
(5) a l， 6-フコシルトランスフェラーゼが、 以下の (a)、 (b)、 （c)および（d) からなる群から選ばれる DNAがコードする蛋白質である、 （4)に記載の細胞。
(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA；
(c) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件 でハイブリダィズし、 かつ α 1， 6-フコシルトランスフエラーゼ活性を有する蛋白 質をコードする DNA； (d) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA とストリンジ ントな条件 でハイブリダイズし、 かつひ 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白 質をコードする DNA。
(6) ひ 1, 6-フコシルトランスフヱラーゼが、 以下の （a)、 （b)、 (c) (d)、 (e) および （f) からなる群から選ばれる蛋白質である、 （4)に記載の細胞。
(a) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号 5で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(c) 配列番号 4 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入おょぴ Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ《1， 6 -フコシ ルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(d) 配列番号 5 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入おょぴノまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ α 1，6 -フコシ ルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(e) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ α 1， 6 -フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(f) 配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつひ 1， 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
(7) N-グリコシド結合複合型糖鎮還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位が 結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である、 （1)〜 (6)のいずれか 1項に記載の細胞。
(8) 少なくとも、 以下の（a)、 （b)、 （c)および (d)からなる群から選ばれるレク チンの一つに耐性である、 （7)記載の細胞。
(a) レンズマメレクチン；
(b) ェンドウマメレクチン；
(c) ソラマメレクチン；
(d) ヒィロチャワンタケレクチン。
(9) 細胞が、 下記の （a；)〜（j) からなる群から選ばれる細胞である、 （1)〜（8) のいずれか 1項に記載の細胞。
(a) チャイニーズハムスター卵巣組織由来 CH0細胞；
(b) ラットミエロ一マ細胞株 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞；
(c) マウスミエ口一マ細胞株 NS0細胞；
(d) マウスミエ口一マ細胞株 SP2/0- Agl4細胞； (e) シリアンハムスタ一腎臓組織由来 BHK細胞；
(f) 抗体を生産するハイプリ ドーマ細胞；
(g) ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
(h) 胚性幹細胞；
(i) 受精卵細胞；
(j) 植物細胞。
(10) 抗体分子をコードする遺伝子を含む（1)〜（9)のいずれか 1項に記載の細 胞。
(11) 抗体分子が、 以下の（a)、 （b)、 （c)および (d)からなる群から選ばれる抗 体分子である、 （10に記載の細胞。
(a) ヒト抗体；
(b) ヒト化抗体；
(c) (a)または (b)の Fc領域を含む抗体断片；
(d) (a)または (b)の Fc領域を有する融合蛋白質。
(12) 抗体分子のクラスが IgGである、 （10) または（11)に記載の細胞。
(13) 親株細胞が生産する抗体組成物より、 抗体依存性細胞障害活性が高い抗 体組成物を生産する能力を有する、 α)〜α2)のいずれか 1項に記載の細胞。
(14) 抗体依存性細胞障害活性が高レ、抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァ セチルダルコサミンとフコースが結合していなレ、糖鎖の割合が、 親株細胞が生産 する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、 （13)に記載の細胞。
(15) フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N -ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に (¾結合していない糖鎖 である、 （14)に記載の細胞。
(16) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 20%以上である抗 体組成物である、 （13)〜（15)のいずれか 1項に記載の細胞。
(17) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 糖鎖還元末端の N-ァセチ ルグルコサミンとフコースが結合してレヽる糖鎖を有しない抗体組成物である、 (13)〜（16)のいずれか 1項に記載の細胞。 (18) (10)〜(： 17)のいずれか 1項に記載の細胞を用いること特徴とする、 抗体 組成物を製造する方法。
(19) (10)〜（18)のいずれか 1項に記載の細胞を培地に培養し、 培養物中に抗 体組成物を生成蓄積させ、 該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、 抗体 組成物を製造する方法。
(20) 抗体組成物が親株細胞が生産する抗体組成物よりも、 抗体依存性細胞障 害活性が高い抗体組成物である、 （18)または（19)に記載の方法。
(21) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、 親株細胞が生産 する抗体組成物より高いことを特徴とする、 （20)に記載の方法。
(22) フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N -ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に a結合していない糖鎖 である、 （21)に記載の方法。
(23) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 20%以上である抗 体組成物である、 （20)〜（22)のいずれか 1項に記載の方法。
(24) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 糖鎖還元末端の N-ァセチ ルダルコサミンとフコースが結合している糖鎖を有しない抗体組成物である、
(20)〜（23) V、ずれか 1項に記載の方法。
(25) (1)〜（9)のいずれかに記載の細胞を用いて作製された、 トランスジヱニ ック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
(26) トランスジエニック非ヒト動物が、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 ニヮトリ、 サルおよぴゥサギからなる群から選ばれる動物であ る、 （24)に記載のトランスジヱニック非ヒト動物、 またはその子孫。
(27) 抗体分子をコードする遺伝子を導入した（25)または（26)に記載のトラン スジエニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
(28) 抗体分子が、 以下の（a)、 （b)、 （c)および（d)からなる群から選ばれる抗 体分子である、 （27)に記載のトランスジヱニック非ヒト動物あるいは植物、 また はその子孫。
(a) ヒ ト抗体； (b) ヒト化抗体；
(c) (a)または (b)の Fc領域を含む抗体断片；
(d) (a)または (b)の Fc領域を有する融合蛋白質。
(29) 抗体分子のクラスが IgGである、 （27)または（28)に記載のトランスジェ ニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
(30) (27：)〜（29)のいずれか 1 項に記載のトランスジエニック非ヒト動物ある ヽは植物を飼育し、 飼育した動物あるいは植物から導入した抗体組成物を含む組 織あるいは体液を取得し、 該組織あるいは体液から抗体組成物を採取する工程を 含む、 抗体組成物を製造する方法。
(31) (26)〜（29)のいずれか 1 項に記載のトランスジエニック非ヒト動物ある いは植物、 またはその子孫の抗体生産細胞を取得し、 取得した抗体生産細胞を培 地に培養し、 培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、 該培養物から抗体組成物を 採取する工程を含む、 抗体組成物を製造する方法。
(32) 抗体組成物が、 ゲノムが改変されていない非ヒト動物あるいは植物、 ま たはその子孫から得られる抗体組成物よりも、 抗体依存性細胞障害活性が高い抗 体組成物である、 （30)または（31)に記載の方法。
(33) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、 ゲノムが改変さ れていない非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫から得られる抗体組成物よ り高いことを特徴とする、 （32)に記載の方法。
(34) フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N -ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位に α結合していない糖鎖 である、 （33)に記載の方法。
(35) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N -ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 20%以上である抗 体糸且成物である、 （32)〜（34)のいずれか 1項に記載の方法。
(36) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 糖鎖還元末端の N-ァセチ ルダルコサミンとフコースが結合している糖鎖を有しない抗体組成物である、 (32)〜（35)レ、ずれか 1項に記載の方法。 (37) N -グリコシド結合型糖鎖を Fc領域に有する抗体分子からなる抗体組成物 であって、 該抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全ダリコシド結合複合型 糠鎖のうち、 糠鎖還元末端の N-ァセチルダリコサミンにフコースが結合していな レ、糖鎖を有する抗体組成物。
(38) フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N-グリコシド結 合複合型糠鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に a結合していない糖鎖 である、 （37)記載の抗体組成物。
(39) (18)〜 (24)のいずれか 1 項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
(40) (27)〜（36)のいずれか 1 項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
(41) (37)〜（40)のいずれか 1 項に記載の記載の抗体組成物を有効成分として 含有する医薬。
(42) 医薬が、 腫瘍を伴う疾患、 アレルギーを伴う疾患、 炎症を伴う疾患、 自 己免疫疾患、 循環器疾患、 ウィルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に 対する診断薬、 予防薬または治療薬である、 （41)に記載の医薬。
(43) (41)または (42)に記載の医薬を製造するための、 （37)〜（40)のいずれか 1項に記載の抗体組成物の使用。 本発明の Ν -ダリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν -ァセチルダルコサミンの 6 位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親株細胞より も低下または欠失するようにゲノムが改変された細胞 （以下、 「本発明の細胞」 と表記する） は、 Ν-ダリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルグルコサミ ンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素 （以下、 「ひ 1， 6-フコース修飾酵素」 と表記する） の活性が親株細胞よりも低下または欠失す るようにゲノムが改変された細胞であれば、 ゲノムの改変の手段はいかなるもの であってもよい。
親株細胞とは、 ひ 1， 6 -フコース修飾酵素の活性が低下または欠失させるための 方法をゲノムに対して施す前の細胞をいう。 親株細胞としては、 特に限定はない 力 例えば、 以下の細胞があげられる。
NS0 細胞の親株細胞としては、 バイオ/テクノロジー（BI0/TECHN0L0GY)， 10, 169 (1992)、 バイオテクノロジー.バイオエンジニアリ ング (Biotechnol. Bioeng. ) , 73, 261， (2001)等の文献に記載されている NS0細胞があげられる。 ま た、 理化学研究所細胞開発銀行に登録されている NSO細胞株 （RCB0213) 、 あるい はこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
SP2/0 - Agl4 細胞の親株細胞としては、 ジャーナル'ォプ'ィムノロジー（J. Immunol. ) , 126, 317, (1981)、 ネイチヤー（Nature)， 276, 269， (1978) 、 ヒュ 一マン'アンチイボディズ'アンド'ノヽィプリ ドーマズ（Human Antibodies and Hybridomas) , 3, 129， (1992) 等の文献に記載されている SP2/0-Agl4細胞があげ られる。 また、 ATCCに登録されている SP2/0 - Agl4細胞 (ATCC CRL- 1581) あるい はこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株 (ATCC CRL- 1581. 1) などもあげら れる。
チャイニーズハムスター卵巣組織由来 CH0細胞の親株細胞としては、 Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968)、 Genetics, 55, 513 (1968)、 Chromosoma, 41, 129 (1973)、 Methods in Cell Science, 18, 115 (1996)、 Radiation Research, 148, 260 (1997)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)、 Proc. Natl. Acad. Sci. 60, 1275 (1968)、 Cell, 6, 121 (1975)、 Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (p883 - 900)等の文献に記載されている CH0細胞があげられる。 ま た、 ATCC に登録されている CH0-K1 株 （ATCC CCL-61) 、 DUXB11 株 （ATCC CRL - 9096) 、 Pro- 5株 （ATCC CRL-1781) や、 市販の CHO- S株 （Lif etechnologies社製 Cat#11619) 、 あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげら れる。
ラットミエローマ細胞株 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 細胞の親株細胞としては、 Y3/Agl. 2. 3 細胞 （ATCC CRL-1631) から樹立された株化細胞が包含される。 その 具体的な例としては、 J. Cell. Biol. 93, 576 (1982)、 Methods Enzymol. 73B， 1 (1981)等の文献に記載されている YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞があげられる。 また、 ATCCに登録されている YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞 （ATCC CRL- 1662) あ るいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
a 1， 6-フコース修飾酵素としては、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N- ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合する反応に関与する酵素 であれば 1、かなる酵素も包含される。 Ν -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν- ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合する反応に関与する酵素 としては、 該反応に影響を与える酵素も包含される。 W
CK I, 6 -フコース修飾酵素としては、 具体的には、 ひ 1， 6 -フコシルトランスフエ ラーゼゃ α— Lーフコシダーゼなどがあげられる。
また、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位が α結合する反応に影響を与える酵素としては、 上述のひ 1, 6- フコース修飾酵素の活性に影響を与えたり、 該酵素の基質となる物質の構造に影 響を与える酵素も包含される。
本発明において、 a l， 6-フコシルトランスフェラーゼとしては、 下記（a；)、 （b)、 (c)あるいは（d)の DNAがコードする蛋白質、 または下記（e)、 （f)、 （g) 、 (h) 、 (i) あるいは （j) の蛋白質などがあげられる。
(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA
(b) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA
(c) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件でハ イブリダィズし、 かつ α 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質を コードする DNA
(d) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件でノ、 イブリダィズし、 かつひ 1， 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質を コードする DNAまたは、
(e) 配列番号 4で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質
(f) 配列番号 5で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質
(g) 配列番号 4 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置 換、 揷入および または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ a 1, 6 -フコシル トランスフヱラーゼ活性を有する蛋白質
(h) 配列番号 5 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置 換、 揷入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつひ 1, 6 -フコシル トランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
(i) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配 列からなり、 かつ a 1， 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
(j) 配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配 列からなり、 かつ a 1， 6-フコシルトランスフェラーゼ活 1"生を有する蛋白質
本発明において、 ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする D N Aとは、 例えば配列番号 1または 2で表される塩基配列を有する D N Aなどの D N Aまた はその一部の断片をプローブとして、 コロニー ·ハイブリダィゼーシヨン法、 プ ラーク ·ハイプリダイゼーシヨン法あるいはサザンプロッ ト 'ハイブリダィゼー シヨン法等を用いることにより得られる D NAをいい、 具体的には、 コロニーあ るいはプラーク由来の D N Aを固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1. 0Mの 塩化ナトリウム存在下、 65°Cでハイプリダイゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍 濃度の S S C溶液 （1倍濃度の S S C溶液の組成は、 150mM塩化ナトリウム、 15 mMクェン酸ナトリウムよりなる） を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄する ことにより同定できる D N Aをあげることができる。 ハイプリダイゼーシヨンは、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, し old spring Harbor Laboratory Press, 1989 (以下、 モレキュラー 'クローニング第 2版と略 す) 、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987— 1997 (以下、 カレント'プロ トコールズ'イン'モレキュラー'バイオロジーと略 す) 、 DNA Cloning 1 : Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことが できる。 ハイブリダィズ可能な D N Aとして具体的には、 配列番号 1または 2で 表される塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性を有する D N A、 好ましくは 70%以上、 より好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上、 特に好ましく は 95%以上、 最も好ましくは 98%以上の相同性を有する D N Aをあげることがで きる。
本発明において、 配列番号 4または 5で表されるアミノ酸配列において 1以上 のァミノ酸が欠失、 置換、 揷入および Zまたは付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ α 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質とは、 モレキユラ 一 · クロ一ユング第 2 版、 力レント ·プロ トコーノレズ 'イン 'モレキュラー ·バ ィォロジ一、 Nucleic Acids Research, 10， 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci.， USA, 79, 6409 (1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13， 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特 異的変異導入法を用いて、 例えば、 配列番号 4または 5で表されるアミノ酸配列 を有する蛋白質をコードする D N Aに部位特異的変異を導入することにより取得 することができる蛋白質を意味する。 欠失、 置換、 揷入および Zまたは付加され るアミノ酸の数は 1 個以上でありその数は特に限定されないが、 上記の部位特異 的変異導入法等の周知の技術により、 欠失、 置換、 揷入もしくは付加できる程度 の数であり、 例えば、 1〜数十個、 好ましくは 1〜20個、 より好ましくは 1〜10個、 さらに好ましくは 1〜5個である。 また、 本発明において、 配列番号 4または 5で表されるアミノ酸配列と 80%以 上の相同性を有し、 かつひ 1, 6 -フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質 とは、 B L A S T 〔J. Mol. Biol. , 215， 403 (1990)〕 や F A S T A [Methods in Enzymology, 183， 63 (1990)〕 等の解析ソフトを用いて計算したときに、 配列 番号 4または 5に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくとも 80%以上、 好 ましくは 85%以上、 より好ましくは 90%以上、 さらに好ましくは 95%以上、 特 に好ましくは 97%以上、 最も好ましくは 99%以上である蛋白質であることを意味 する。
本発明において、 N -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコ サミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親 株細胞より低下または欠失するようにゲノムが改変されたとは、 該酵素の発現を 低下または欠失させるように該酵素の遺伝子の発現調節領域に変異を導入したり、 あるいは該酵素の機能を低下または欠失させるように該遺伝子のアミノ酸配列に 変異を導入することをいう。 変異を導入するとは、 ゲノム上の塩基配列に欠失、 置換、 挿入および/または付加といつた塩基配列の改変を行うことをいう。
ゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞とは、 ゲノム遺伝子の発現または機能 を完全に抑制することをいう。 ゲノム遺伝子がノックァゥトされた細胞の具体的 な例としては、 標的となる遺伝子のすべてまたは一部がゲノムから削除された細 胞があげられる。 このような細胞を取得する方法としては、 目的とするゲノムの 改変を行うことができれば、 いずれの手法でも用いることができるが、 遺伝子ェ 学的な手法が望ましい。 その具体的な手法としては、
( a ) a l, 6-フコース修飾酵素の遺伝子を標的した遺伝子破壌の手法；
( b ) a 1 , 6—フコース修飾酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入す る方法
(c) a 1, 6-フコース修飾酵素についての突然変異を導入する手法；
(d) a 1， 6-フコース修飾酵素の転写または翻訳を抑制する手法などがあげられる。 また、 N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位とフコ ースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性な細胞株を選択する 方法を用いることにより、 本発明の細胞を選択することができる。
レクチンに耐性な細胞とは、 レクチンを有効濃度与えたときにも、 生育が阻害 されない細胞をいう。 有効濃度とは、 親株細胞が正常に生育できない濃度以上で あり、 好ましくは親株細胞が正常に生育できない濃度と同濃度、 より好ましくは
2〜5倍、 さらに好ましくは 10倍、 最も好ましくは 20倍以上である。
本発明において、 生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、 細胞株に応じて 適宜定めればよいが、 通常 10 μ §/ηι1〜10. 0mg/ml、 好ましくは 0. 5〜2. Omg/ml で める。
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位とフコ ースの 1 位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、 該糖鎖構造を認 識できるレクチンであれば、 いずれのレクチンも包含される。 その具体的な例と しては、 レンズマメ レクチン L C A ( Lens Culinaris 由来の Lentil Agglutinin) 、 エン ドゥマメ レクチン P S A ( Pi sum sativum 由来の Pea Lectin) 、 ソラマメレクチン V F A (Vicia faba由来の Agglutinin) 、 ヒイロチ ャワンタケレクチン AA L (Aleuria aurantia由来の Lectin) などがあげられる。 本発明の細胞としては、 抗体分子を発現できる細胞であればいかなる細胞でも よいが、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞などがあげられ、 これらの細胞の 具体的な例としては、 後述の 3. に記載のものがあげられる。 動物細胞の具体例 としては、 チャイニーズハムスター卵巣糸且織由来の CH0 細胞、 ラットミエローマ 細胞株 Y B 2/3H L . P 2. G il. 16A g . 20 細胞、 マウスミエローマ細胞株 N S O 細胞、 マウスミエローマ細胞株 S P 2/0— A g l4 細胞、 シリアンハムスター 腎臓組織由来 B H K細胞、 抗体を生産するハイプリ ドーマ細胞、 ヒ ト白血病細胞 株ナマルバ細胞、 胚性幹細胞、 受精卵細胞などがあげられる。 好ましくは、 抗体 組成物の製造に用いられる、 上述のミエローマ細胞、 ハイブリ ドーマ細胞、 ヒ ト 化抗体おょぴヒ ト抗体を製造するための宿主細胞、 ヒ ト抗体を生産するヒ ト以外 のトランスジヱニック動物を製造するために用いる胚性幹細胞または受精卵細胞、 ならびにヒ ト化抗体およびヒ ト抗体を生産するトランスジヱニック植物を製造す るために用いる植物細胞などがあげられる。
本発明の細胞は、 親株細胞が生産する抗体組成物より、 高い ADCC活性を有する 抗体糸且成物を生産することができる。
また、 本発明の細胞は、 抗体組成物中に含まれる Fc 領域に結合する全 N-グリ コシド結合複合型糖鎖のうち、 糠鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンとフコー スが結合していない糖鎖の割合が、 親株細胞よりも高い抗体組成物を生産するこ とができる。 本発明は、 本発明の細胞を用いることを特徴とする抗体組成物の製造方法に関 する。
抗体組成物とは、 N-グリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する抗体分子から なる組成物をいう。
抗体は、 重鎖および軽鎖 （以下、 それぞれ 「H鎖」 および 「L鎖」 と表記する） の 2種類のポリぺプチド鎖がそれぞれ 2分子ずつ会合した 4量体である。 H鎖の N 末端側の約 4分の 1 と L鎖の N末端側の約 4分の 1 (それぞれ 100余アミノ酸） は可変領域 （以下、 V領域と表記する） と呼ばれ、 多様性に富み、 抗原との結合 に直接関与する。 V領域以外の部分の大半は定常領域 （以下、 C領域と表記する） と呼ばれる。 抗体分子は C領域の相同性により IgG、 IgM、 IgA、 IgD、 IgEの各ク ラスに分類される。
また IgGクラスは C領域の相同性により、 さらに IgGl~IgG4のサブクラスに分 類される。
H鎖は N末端側より VH、 CHI, CH2、 CH3の 4つのィムノグロプリンドメインに 分かれ、 CH1 と CH2 の間にはヒンジ領域と呼ばれる可動性の高いペプチド領域が あり、 CH1 と CH2 とが区切られる。 ヒンジ領域以降の CH2 と CH3からなる構造単 位は Fc領域と呼ばれ、 N-グリコシド結合型糖鎖が結合している。 また、 この領域 は、 Fc レセプター、 補体などが結合する領域である （免疫学イラストレイテッド 原書第 5版、 2000年 2月 10日発行、 南江堂版、 抗体工学入門、 1994年 1月 25日 初版、 地人書館） 。
抗体などの糖タンパク質の糖鎖は、 タンパク質部分との結合様式により、 ァス パラギンと結合する糖鎖 （N -グリコシド結合糖鎖） とセリン、 スレオニンなどと 結合する糖鎖 （0-グリコシル結合糖鎖） の 2種類に大別される。 N -グリコシド結 合糖鎖は、 以下の構造式 （I) に示す基本となる共通のコア構造を有する [生物化 学実験法 23—糖蛋白質糖鎖研究法 （学会出版センター） 高橋禮子編 （1989年） ] 。
β 1 ► 4GlcNAc (D
Figure imgf000016_0001
上記構造式 （I ) において、 ァスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、 反対側を非還元末端という。 N -グリコシド結合糖鎖としては、 上記構造式 ( I ) のコア構造を有するもので あればいかなるものでもよいが、 コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合 するハイマンノース型、 コア構造の非還元末端側にガラクトース- N -ァセチルダル コサミン （以下、 Gal- GlcNAc と表記する） の枝を並行して 1ないしは複数本有し、 更に Gal_GlcNAc の非還元末端側にシアル酸、 パイセクティングの N-ァセチルダ ルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型 （複合型） 、 コア構造の非還元 末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイプリッド型 などがあげられる。
抗体分子の Fc領域には、 N-グリコシド結合糖鎖が 1力所ずつ結合する領域を有 しているので、 抗体 1分子あたり 2本の糖鎖が結合している。 抗体分子に結合す る N -グルコシド結合糖鎖としては、 前記構造式 （I) で示されるコア構造を含む いかなる糖鎖も包含されるので、 抗体に結合する 2本の N -ダルコシド結合糖鎖に は多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。
したがって、 本発明において、 本発明の細胞を用いて製造される抗体組成物は、 本発明の効果が得られる範囲であれば、 単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構 成されていてもよいし、 複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されて いてもよい。 そのような本発明により得られる抗体組成物として、 好ましくは、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全ダリコシド結合複合型糠鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合 が、 ゲノムが改変されていない親株細胞が生産する抗体組成物よりも高い抗体組 成物があげられる。
また、 本発明において、 a l， 6-フコース修飾酵素の活性が欠失または低下する ようにゲノムが改変された、 トランスジエニック非ヒ ト動物あるいは植物、 また はその子孫を用いて製造した抗体組成物も、 本発明の効果が得られる範囲であれ ば、 単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、 複数の異な る糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。
そのような抗体組成物として、 好ましくは、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に 結合する全グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコ サミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、 ゲノムが改変されていない非 ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫 （以下、 親個体と称す） が生産する抗体 組成物よりも高い抗体組成物があげられる。 ' a 1， 6 -フコース修飾酵素の活性が欠失または低下するようにゲノムが改変され た、 トランスジエニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫は、 胚性幹細 胞、 受精卵細胞、 または植物細胞を用いて作製することができる。
抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N -ダリコシド結合複合型糖鎖の うち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖 の割合とは、 該組成物中に含まれる Fc領域に結合する全ての N-グリコシド結合 複合型糖鎖の合計数に対して、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコー スが結合していない糖鎖の数が占める割合をいう。
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが 結合していない糖鎖とは、 フコースが、 N -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンに α結合していない糖鎖をいう。 具体的には、 フコース の 1位が Ν-グリコシド結合複合型糖鎖の Ν-ァセチルグルコサミンの 6位に α結合 していない糖鎖があげられる。
本発明の抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-ダリコシド結合複合 型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合してい ない糖鎖の割合としては、 好ましくは 2 0 %以上、 より好ましくは 3 0 %以上、 さらに好ましくは 4 0 %以上、 特に好ましくは 5◦%以上、 最も好ましくは 1 0 0 %である抗体組成物があげられる。
親株細胞または親個体が生産する抗体組成物よりも ADCC活性が高い抗体組成物 としては、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合 型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合してい ない糖鎖の割合が、 親株細胞または親個体が生産する抗体組成物の該割合よりも 高いものがあげられる。 具体的には、 該割合が 2倍以上、 好ましくは 3倍以上、 より好ましくは 5倍以上、 特に好ましくは 10倍以上高い抗体組成物があげられ、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する N-グリコシド結合複合型糖鎖の全て が、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が結合して いない糖鎖である抗体組成物が最も好ましい。
上述の糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖の割合が 1 0 0 %である抗体組成物、 または抗体組成物中に含まれる Fc領域に 結合する N -ダルコシド結合複合型糖鎖の全てが、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダル コサミンの 6位にフコースの 1位が結合していない糖鎖である抗体組成物として は、 後述 5に記載の糖鎖分析において、 フコースが実質的には検出できない程度 である場合をいう。
本発明により得られる抗体組成物において、 Fc領域に結合する全 N-グリコシド 結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結 合していない糖鎖の割合が、 親株または親個体が生産する抗体組成物よりも高い 場合、 本発明により得られる抗体組成物は、 親株または親個体が生産する抗体分 子からなる抗体組成物より高い ADCC活性を有する。
ADCC活性とは、 生体内で、 腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、 抗体 Fc領域とエフェクター細胞表面上に存在する Fc レセプターとの結合を介し てエフェクター細胞を活性化し、 腫瘍細胞等を障害する活性をいう [モノクロ一 ナル · ァンティボディズ： プリンシプルズ · アンド · アプリケーシヨンズ (Monoclonal Antibodies : Principles and Applications) , Wiley-Liss, Inc. , Capter 2. 1 (1995) ] 。 エフェクター細胞としては、 キラー細胞、 ナチュラルキラ 一細胞、 活十生ィ匕されたマクロファージ等があげられる。
N -ダリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する抗体分子からなる組成物中に含 まれる、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖の割合は、 抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法 [生物化学 実験法 23—糖タンパク質糖鎖研究法 （学会出版センター） 高橋禮子編 （1989) ] を用い、 糖鎖を遊離させ、 遊離させた糠鎖を蛍光標識または同位元素標識し、 標 識した糖鎖をクロマトグラフィ一法にて分離することによつて決定することがで きる。 また、 遊離させた糖鎖を HPAED- PAD法 [ジャーナル ·ォブ.リキッド 'クロマ トグラフィー （J. Liq. Chromatogr. ) ， 6， 1577 (1983) ]によって分析すること によっても決定することができる。
また、 本発明の抗体としては、 腫瘍関連抗原を認識する抗体、 アレルギーある レ、は炎症に関連する抗原を認識する抗体、 循環器疾患に関連する抗原を認識する 抗体、 自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、 またはウィルスあるいは細 菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、 抗体のクラスは IgGが好ましい。
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、 抗 GD2 抗体 （Anticancer Res. , 13， 331-336, 1993) 、 抗 GD3 抗体 (Cancer Immunol. Immunother. , 36, 260-266, 1993) 、 抗 G M2 抗体 （Cancer Res. , 54， 1511-1516， 1994) 、 抗 HER2 抗体
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89， 4285-4289, 1992) 、 抗 CD52抗体 （Nature, 332, 323-327, 1988) 、 抗 MAGE抗体 （British J. Cancer, 83， 493 - 497， 2000) 、 抗 HMl. 24抗体 (Molecular Immunol. , 36, 387-395, 1999) 、 抗副甲状腺ホル モン関連蛋白 （PTHrP) 抗体 （Cancer, 88， 2909-2911, 2000) 、 抗 FGF8 抗体
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86， 9911-9915， 1989) 抗塩基性繊維芽細胞増殖 因子抗体、 抗 FGF8受容体抗体 (J. Biol. Chem. , 265, 16455-16463， 1990) 、 抗 塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、 抗インスリ ン様増殖因子抗体 （J. Neurosci. Res.， 40, 647-659， 1995) 、 抗ィンスリン様増殖因子受容体抗体 （J. Neurosci. Res. , 40, 647—659, 1995) 、 抗 PMSA抗体 (J. Urology, 160, 2396- 2401, 1998) 、 抗血管内皮細胞増殖因子抗体 (Cancer Res.， 57， 4593-4599， 1997) 、 抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体 (Oncogene, 19, 2138-2146， 2000) 、 抗 CA125抗体、 抗 17-1A抗体、 抗ィンテグリン α ν /3 3抗体、 抗 CD33抗体、 抗 CD22抗体、 抗 HLA抗体、 抗 HLA-DR抗体、 抗 CD20抗体、 抗 CD19抗体、 抗 EGF受 容体抗体 （ Immunology Today、 21 (8)、 403-410 ( 2000 ) )、 抗 CD10 抗体
(American Journal of Clinical Pathology, 113, 374—382， 2000)などがあげら れる。
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗インター ロイキン 6抗体 (Immunol. Rev. , 127, 5-24， 1992) 、 抗インターロイキン 6受 容体抗体 （Molecular Immunol. , 31， 371 - 381， 1994) 、 抗インターロイキン 5抗 体 (Immunol. Rev. , 127, 5-24, 1992) 、 抗インターロイキン 5受容体抗体、 抗 インターロイキン 4抗体 (Cytokine, 3， 562-567, 1991) 、 抗ィンターロイキン 4受容体抗体 （J. Immunol. Meth. , 217, 41-50， 1998) 、 抗腫瘍壌死因子抗体 (Hybridoma, 13, 183-190, 1994) 、 抗腫瘍壊死因子受容体抗体 （Molecular Pharmacol. , 58， 237-245, 2000 ) 、 抗 CCR 抗体 （Nature, 400, 776-780, 1999) 、 抗ケモカイン抗体 （J. Immunol. Meth. , 174, 249 - 257, 1994) 、 抗ケモ 力イン受容体抗体 （J. Exp. Med. , 186, 1373-1381, 1997) 、 抗 IgE抗体、 抗 CD23 抗体、 抗 CDlla 抗体 (Immunology Today、 21 (8)、 403-410 (2000) )、 抗 CRTH2抗体 （J Immunol. , 162， 1278-1286 (1999) )、 抗 CCR8抗体 （W099/25734)、 抗 CCR3抗体 (US6207155) などがあげられる。
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗 GpIIb/IIIa抗体 （J. Immunol. , 152， 2968-2976， 1994) 、 抗血小板由来増殖因子抗体 (Science, 253， 1129—1132， 1991) 、 抗血小板由来増殖因子受容体抗体 (J. Biol. Chem. , 272, 17400-17404, 1997) または抗血液凝固因子抗体 （Circulation, 101， 1158-1164, 2000) などが挙げられる。
自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗自己 DNA 抗体
(Immunol. Letters, 72， 61-68, 2000) などが挙げられる。
ウィルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗 g p l20 抗体 （Structure, 8， 385 - 395， 2000) 、 抗 CD4 抗体 （J. Rheumatology, 25, 2065-2076, 1998) 、 抗 CCR4抗体、 抗ベロ毒素抗体 (J. Clin. Microbiol. , 37, 396-399， 1999) 、 自己免疫疾患 （乾癬、 関節リウマチ、 クローン病、 潰瘍性大腸 炎、 全身性エリテマトーデス、 多発性硬化症など）、 抗 CDlla抗体、 抗 ICAM3抗体、 抗 CD80抗体、 抗 CD2抗体、 抗 CD3抗体、 抗 CD4抗体、 抗インテグリン α; 4 j3 7抗 体、 抗 CD40L 抗体、 抗 IL- 2 受容体抗体 （Immunology Today, 21 (8)、 403-410
(2000) ) などが挙げられる。
抗体分子としては、 抗体の Fc領域を含む分子であればいかなる分子も包含され る。 具体的には、 抗体、 抗体の断片、 Fc領域を含む融合タンパク質などがあげら れる。
抗体としては、 外来抗原刺激の結果、 免疫反応によって生体内に生産される蛋 白質で、 抗原と特異的に結合する活性を有するものであればいかなるものでもよ いが、 動物に抗原を免疫し、 免疫動物の脾臓細胞より作製したハイプリ ドーマ細 胞が分泌する抗体、 遺伝子組換え技術により作製された抗体、 すなわち、 抗体遺 伝子を揷入した抗体発現ベクターを、 宿主細胞へ導入することにより取得された 抗体などがあげられる。 具体的には、 ハイプリ ドーマが生産する抗体、 ヒ ト化抗 体、 ヒ ト抗体などをあげることができる。
ハイプリ ドーマは、 ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得された B細胞と、 マウス、 ラット等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、 所望 の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を生産する細胞をいう。
ヒト化抗体としては、 ヒト型キメラ抗体、 ヒト型 CDR移植抗体などがあげられ る。
ヒト型キメラ抗体は、 ヒト以外の動物の抗体 H鎖 V領域 （以下、 HVまたは VH とも称す） および抗体 L鎖 V領域 （以下、 LVまたは VLとも称す） とヒト抗体の H 鎖 C領域 （以下、 CHとも称す） およぴヒト抗体の L鎖 C領域 （以下、 CL とも称 す） とからなる抗体を意味する。 ヒト以外の動物としては、 マウス、 ラット、 ハ ムスター、 ゥサギ等、 ハイプリ ドーマを作製することが可能であれば、 いかなる ものも用いることができる。
ヒ ト型キメラ抗体は、 モノクローナル抗体を生産するハイプリ ドーマより、 VH および VLをコードする cDNAを取得し、 ヒト抗体 CHおよぴヒ ト抗体 CLをコード する遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗 体発現ベクターを構築し、 宿主細胞へ導入することにより発現させ、 製造するこ とができる。·
ヒト型キメラ抗体の CH としては、 ヒ トイムノグロブリン （以下、 hlg と表記す る） に属すればいかなるものでもよいが、 hlgG クラスのものが好適であり、 更に hlgG クラスに属する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3N hIgG4 といったサブクラスのいずれ も用いることができる。 また、 ヒト型キメラ抗体の CL としては、 hlgに属すれば いかなるものでもよく、 κクラスあるいは; Lクラスのものを用いることができる。 ヒト型 CDR移植抗体は、 ヒ ト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのァミノ 酸配列をヒ ト抗体の VHおよび VLの適切な位置に移植した抗体をいう。
ヒト型 CDR移植抗体は、 ヒ ト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDR配列を任 意のヒト抗体の VHおよび VLの CDR配列に移植した V領域をコードする cDNAを構 築し、 ヒト抗体の CHおよびヒト抗体の CLをコードする遺伝子を有する宿主細胞 用発現ベクターにそれぞれ揷入してヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築し、 該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒ ト型 CDR移植抗体を発現させ、 製造することができる。
ヒト型 CDR移植抗体の CHとしては、 hlgに属すればいかなるものでもよいが、 hlgGクラスのものが好適であり、 更に hlgGクラスに属する hIgGl、 hIgG2、 gG3、 hIgG といったサブクラスのいずれも用いることができる。 また、 ヒト型 CDR移 植抗体の CL としては、 hlgに属すればいかなるものでもよく、 κクラスあるいは えクラスのものを用いることができる。
ヒ ト抗体は、 元来、 ヒ ト体内に天然に存在する抗体をいうが、 最近の遺伝子ェ 学的、 細胞工学的、 発生工学的な技術の進歩により作製されたヒ ト抗体ファージ ライブラリーならびにヒ ト抗体生産トランスジエニック非ヒ ト動物あるいはヒ ト 抗体生産トランスジエニック植物から得られる抗体等も含まれる。
ヒ ト体内に存在する抗体は、 例えば、 ヒ ト末梢血リンパ球を単離し、 EB ウィル ス等を感染させ不死化、 クローユングすることにより、 該抗体を生産するリンパ 球を培養でき、 培養物中より該抗体を精製することができる。 ヒ ト抗体ファージライブラリ一は、 ヒ ト B細胞から調製した抗体遺伝子をファ ージ遺伝子に挿入することにより Fab、 一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面 に発現させたライブラリーである。 該ライブラリーより、 抗原を固定化した基質 に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現して いるファージを回収することができる。 該抗体断片は、 更に遺伝子工学的手法に より、 2本の完全な H鎖および 2本の完全な L鎖からなるヒト抗体分子へも変換 することができる。
ヒト抗体生産トランスジエニック非ヒト動物は、 ヒト抗体遺伝子が細胞内に組 込まれた非ヒト動物をいう。 具体的には、 マウス胚性幹細胞へヒト抗体遺伝子を 導入し、 該胚性幹細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、 発生させることによりヒ ト抗体生産トランスジヱニック動物を作製することができる。 また、 動物の受精 卵にヒト抗体遺伝子を導入し、 該受精卵を発生させることにヒ ト抗体生産トラン スジヱニック非ヒト動物を作製することもできる。 ヒト抗体生産トランスジェ- ック非ヒ ト動物からのヒト抗体の作製方法は、 通常のヒト以外の哺乳動物で行わ れているハイプリ ドーマ作製方法によりヒト抗体生産ハイプリ ドーマを得、 培養 することで培養物中にヒト抗体を生産蓄積させることができる。
トランスジエニック非ヒト動物としては、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 プタ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 ニヮトリ、 サルまたはゥサギ等があげられる。
また、 本発明において、 抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、 アレルギーある 、は炎症に関連する抗原を認識する抗体、 循環器疾患に関連する抗原を認識する 抗体、 自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、 またはウィルスあるいは細 菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、 抗体のクラスが IgGのヒト抗体が好ましい。
抗体の断片は、 上記抗体の少なくとも Fc領域の一部を含んだ断片をいう。 Fc 領域とは、 抗体の H鎖の C末端側の領域、 CH2領域および CH3領域を意味し、 天 然型およびその変異型を包含する。 少なくとも Fc領域の一部とは、 好ましくは CH2領域を含む断片、 より好ましくは CH2領域内に存在する 1番目のァスパラギ ン酸を含む領域をいう。 IgG クラスの Fc 領域は、 力パット （Kabat) らの EU Index [シーケンシズ ·ォブ ·プロテインズ ·ォブ 'ィムノロジカル ·インタレス 卜 (Sequences of Proteins of Immunological Interest^ , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ] のナ ンバリングで 226番目の Cysから C末端、 あるいは 230番目の Proから C末端ま でを意味する。 抗体の断片としては、 H鎖の単量体、 H鎖の 2量体などがあげられ る。
Fc領域の一部を有する融合蛋白質とは、 抗体の Fc領域の一部を含んだ抗体あ るいは抗体の断片と、 酵素、 サイト力インなどの蛋白質とを融合させた物質 （以 下、 Fc融合蛋白質と称す） を意味する。
以下、 本発明を詳細に説明する。
1. 本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、 以下に述べる手法により作製することができる。
(1) 酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壌の手法
本発明の細胞は、 α 1, 6-フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし、 遺伝子破壊の 方法を用いることにより作製することができる。 Ν -グリコシド結合複合型糖鎖還 元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する酵素とし ては、 具体的には a l， 6-フコシルトランスフェラーゼ、 a -L-フコシダーゼなどが あげられる。
遺伝子破壊の方法としては、 標的とする酵素の遺伝子を破壌することができる 方法であればいかなる方法も包含される。 その例としては、 相同組換え法、 RNA - DNA oligonucleotide (R D O) 法、 レトロウイ/レスを用いた方法、 トランスポゾ ンを用いた方法等があげられる。 以下これらを具体的に説明する。
( a ) 相同組換え法による本発明の抗体生産細胞の作製
本発明の細胞は、 ひ 1， 6-フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし、 染色体上の標 的遺伝子を相同糸且換え法を用い改変することによって作製することができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、 Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor laboratory Press (1994) (以下、 「マ二ピュレイティング'ザ'マウス'ェンブリオ ·ァ ·ラボラトリ一' マ-ユアノレ」と略す) 、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 バイオマニュアルシリーズ 8 ジーンターゲッ ティング， E S細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社 （1995) (以下、 「E S細胞 を用いた変異マウスの作製」と略す） 等に記載の染色体工学の手法を用い、 例えば 以下のように行うことができる。 a 1,6-フコース修飾酵素の c DNAを取得する。
取得した c DNAの塩基配列に基づき、 al，6 -フコース修飾酵素のゲノム DN Aを調製する。
該ゲノム DN Aの塩基配列にも基づき、 改変する標的遺伝子 (例えば、 al，6- フコース修飾酵素の構造遺伝子、 あるいはプロモーター遺伝子） を相同組換えす るためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、 標的遺伝子とターゲットべ クタ一の間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、 本発明の宿主細 胞を作製することができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする a 1，6-フコース修飾酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることが できる。 具体的には、 後述の 3. に記載の細胞があげられる。
a 1, 6-フコース修飾酵素の cDNAおよびゲノム DNAを取得する方法として は、 例えば、 以下に記載の方法があげられる。 c DNAの調製方法
各種宿主細胞から全 RN Aまたは mRN Aを調製する。
調製した全 RNAまたは mRNAから c DNAライブラリーを作製する。
a 1， 6-フコース修飾酵素の既知アミノ酸配列、 例えばヒ トのアミノ酸配列、 に 基づいて、 デジエネレイティブプライマーを作製し、 作製した c DNAライブラ リーを鎵型として P CR法にて、 a 1， 6-フコース修飾酵素をコードする遺伝子断 片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、 c DNAライブラリーをスクリー ユングし、 a 1， 6-フコース修飾酵素をコードする c DNAを取得することができ る。
各種宿主細胞の m R N Aは、 市販のもの（例えば Clontech社製）を用いてもよい し、 以下のごとく各種宿主細胞から調製してもよい。 各種宿主細胞から全 RN A を調製する方法としては、 チォシアン酸グァニジン一トリフルォロ酢酸セシウム 法 [メソッズ ·イン ·ェンザィモロジ一 (Methods in Enzymology) , 154, 3 (1987) ] 、 酸性チォシアン酸グァ-ジン ' フヱノール ' クロ口ホルム （AGP C) 法 [アナリティカル 'パイオケミストリー（Analytical Biochemistry), 162， 156 (1987); 実験医学、 9, 1937 (1991)] などがあげられる。 また、 全 RNAから p o l y (A) + RN Aとして mRNAを調製する方法とし ては、 オリゴ (dT) 固定化セルロースカラム法 (モレキュラー ·クローユング 第 2版） 等があげられる。
さらに、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen 社製） 、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製） などのキットを用いることにより mR N Aを調製することができる。
調製した各種宿主細胞 mRNAから c DNAライプラリーを作製する。 c DN Aライブラリ一作製法としては、 モレキュラー 'クローニング第 2 版、 カレン 卜 -プロ卜コールズ ·イン ·モレキュラー -ノ ィォロジ一、 A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989)等に記載された方法、 あるいは市販のキット、 例えば Superscript Plasmid System ior cDNA Synthesis and Plasmia C丄 oning (Life Technologies 社製） 、 ZAP- cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE社製） を用いる方法などがあげら れる。
c DNAライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、 大腸 菌 K12株中で自立複製できるものであれば、 ファージベクター、 プラスミ ドべク ター等いずれでも使用できる。 具体的には、 ZAP Express [STRATAGENE社製、 ス トラテジーズ（Strategies), 5， 58 (1992)] 、 pBluescript II SK (+) [ヌクレイ ック ' アシッ ド ' リサーチ（Nucleic Acids Research) , 17， 9494 (1989) ] 、 Lambda ZAP II (STRATAGENE社製） 、 ； LgtlO、 ^gtll [ディーェヌエー 'クロー ニ ング ' ァ · プラクティカノレ ' アプローチ（DNA cloning, A Practical Approach) , 1, 9 (1985)] 、 XTriplEx (Clontech社製） 、 ExCell (Pharmacia 社製） 、 pT7T318U (Pharmacia社製） 、 pcD2 [モレキュラー 'セルラー 'バイオ ロジー（Mol. Cell. Biol.), 3, 280 (1983)] および pUC18 [ジーン（Gene), 33， 103 (1985)] 等をあげることができる。
cDNA ライプラリーを作製するための宿主微生物としては、 微生物であればいず れでも用いることができるが、 好ましくは大腸菌が用いられる。 具体的には、 Escherichia coli XL1 - Blue MRF' [ STRATAGENE 社製、 ス ト ラテ ジーズ (Strategies), 5， 81 (1992) ] 、 Escherichia coli C600 [ジヱネテイ クス (Genetics), 39， 440 (1954) ] 、 Escherichia coli Y1088 [サイ エンス (Science), 222, 778 (1983)] 、 Escherichia coli Y1090 [サイエンス（Science), 222， 778 (1983) ] 、 Escherichia coli NM522 [ジヤーナノレ 'ォブ ·モレキユラ 一'バイオロジー（J. Mol. Biol.), 166， 1 (1983) ] 、 Escherichia coli K802 [ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオ口ジー（J. Mol. Biol.), 16, 118 (1966)] および Escherichia coli JM105 [ジーン（Gene), 38, 275 (1985)] 等が 用いられる。
この cDNAライプラリーを、 そのまま以降の解析に用いてもよいが、 不完全 長 c DNAの割合を下げ、 なるべく完全長 c DNAを効率よく取得するために、 菅野らが開発したオリゴキャップ法 [ジーン（Gene), 138, 171 (1994)； ジーン (Gene) , 200, 149 (1997)； 蛋白質核酸酵素， 41， 603 (1996); 実験医学， 11, 2491 (1993)； c DN Aクローニング（羊土社）（1996)； 遺伝子ライブラリーの作 製法（羊土社） (1994)] を用いて調製した cDNAライブラリーを以下の解析に用 いてもよい。
al， 6-フコース修飾酵素のアミノ酸配列に基づいて、 該アミノ酸配列をコード することが予測される塩基配列の 5'端および 3'端の塩基配列に特異的なデジエネ レイティブプライマーを作製し、 作製した cDNAライプラリーを錶型として P CR法 [ピーシーアール 'プロ トコールズ（PCR Protocols), Academic Press (1990)] を用いて DNAの増幅を行うことにより、 ひ 1， 6-フコース修飾酵素をコ 一ドする遺伝子断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片が α 1,6 -フコース修飾酵素をコードする DN Αであること は、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例えばサンガー （Sanger) らのジデォキ シ法 [プ口シーディンダス'ォブ 'ザ'ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)] あるいは AB I PR I S M377DNAシークェンサ一 （PE Biosystems社製） 等の塩基配列分析装置を用い て分析することにより、 確認することができる。
該遺伝子断片を DNAプローブとして、 各種宿主細胞に含まれる mRNAから 合成した c DNAあるいは c DNAライブラリ一対してコロニーハイブリダィゼ ーションゃプラークハイブリダイゼーション (モレキュラー ·クローニング第 2 版） を行うことにより、 al， 6 -フコース修飾酵素の DNAを取得することができ る。
また、 《1,6-フコース修飾酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用い たプライマーを用い、 各種宿主細胞に含まれる mRNAから合成した c DNAあ るいは c DN Aライブラリーを铸型として、 P CR法を用いてスクリーユングを 行うことにより、 al， 6 -フコース修飾酵素の DN Aを取得することもできる。 取得したひ 1， 6-フコース修飾酵素をコードする D Ν Αの塩基配列を末端から、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例えばサンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーデイングス'ォブ ·ザ ·ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)] あるいは AB I P R I SM377D N Aシークェンサ一 （PE Biosystems社製） 等の塩基配列分析装置を用いて分析 することにより、 該 DN Aの塩基配列を決定する。
決定した c DN Aの塩基配列をもとに、 B LAST等の相同性検索プログラム を用いて、 Ge nB a n k、 EMB Lおよび D D B Jなどの塩基配列データべ一 スを検索することにより、 データベース中の遺伝子の中で a 1,6-フコース修飾酵 素をコードしている遺伝子を決定することもできる。
上記の方法で得られるひ 1， 6 -フコース修飾酵素をコードしている遺伝子の塩基 配列としては、 例えば、 配列番号 1または 2に記載の塩基配列が挙げられる。 決定された DN Aの塩基配列に基づいて、 フォスフォアミダイト法を利用した パーキン ·エルマ一社製の DN A合成機 model 392等の D N A合成機で化学合成 することにより、 1， 6 -フコース修飾酵素の c DNAを取得することもできる。 α1， 6-フコース修飾酵素のゲノム DNAを調製する方法としては、 例えば、 以 下に記載の方法が挙げられる。 ゲノム DN Αの調製方法
ゲノム DNAを調製する方法としては、 モレキュラー ·クロー-ング第 2版や カレント ·プロ トコールズ 'イン 'モレキュラー ·バイオロジー等に記載された 公知の方法があげられる。 また、 ゲノム DNAライブラリースクリーニングシス テム （Genome Systems 社製） や Universal GenomeWalker™ Kits (CL0NTECH 社 製） などを用いることにより、 cκl，6-フコース修飾酵素のゲノムDNAを単離す ることもできる。
上記の方法で得られる α1， 6-フコース修飾酵素のゲノム DNAの塩基配列とし て、 例えば配列番号 3に記載の塩基配列があげられる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 ノ^ィ才 マニュアルシリーズ 8 ジーンターゲッティング， E S細胞を用いた変異マウスの 作製（羊土社）（19%)等に記載の方法にしたがって作製することができる。 ターゲ ットベクターは、 リプレースメント型、 インサーシヨン型いずれでも用いること ができる。
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、 後述の 3. に記載の各種細 胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、 例えば、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 ノヽづォマ -ュアルシリーズ 8 ジーンターゲッティング， E S細胞を用いた変異マウスの作 製（羊土社）（1995)等に記載のポジティブ選択、 プロモーター選択、 ネガティブ選 択、 ポリ A選択などの方法を用いることができる。 選別した細胞株の中から目的 とする相同組換え体を選択する方法としては、 ゲノム D N Aに対するサザンハイ プリダイゼーシヨン法 (モレキュラー ·クローニング第 2版） や P C R法 [ピー シーアール ·プロトコールズ（PCR Protocols) , Academic Press (1990) ] 等があ げられる。
また、 N -ダリコシド結合糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位とフコ ースの 1位が α結合する糖鎖修飾に係わる酵素活性の変化を指標として、 相同組 換え体を取得することもできる。 具体的な方法としては、 例えば、 以下に記載の 形質転換体を選択する方法が挙げられる。 形質転換体を選択する方法
a 1， 6 -フコース修飾酵素の活性が低下または欠失した細胞を選択する方法とし ては、 文献 if生化学実験講座 3—糖質 I，糖タンパク質 (東京化学同人）日本生化 学会編（1988) ] 、 文献 [細胞工学， 別冊， 実験プロトコールシリーズ，グライコバ ィォロジー実験プロトコール，糖タンパク質 ·糖脂質.プロテオグリカン (秀潤社)谷 口直之 .鈴木明美 '古川清 ·营原一幸監修 (1996) ] 、 モレキュラー.クローニン グ第 2版、 カレント 'プロ トコールズ'イン'モレキユラ一'バイオロジー等に記載 された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などがあげられる。 生化学的 な方法としては、 例えば、 酵素特異的な基質を用いて酵素活性を評価する方法が あげられる。 遺伝子工学的な方法としては、 例えば、 酵素遺伝子の m R N A量を 測定するノーザン解析や R T— P C R法等があげられる。
レクチン耐性細胞であることを確認する方法としては、 GDP -フコース合成酵素、 α 1， 6 -フコース修飾酵素または GDP-フコース輸送蛋白質の発現を確認する方法、 直接レクチンを加えた培地に細胞を培養する方法などがあげられる。 具体的には 細胞内の 《1， 6-フコース修飾酵素の一つである a 1, 6-フコシルトランスフェラー ゼの mRNAの発現量を測定し、 mRNAの発現が低下していればレクチン耐性の細胞 であるといえる。
また、 a 1, 6-フコース修飾酵素の活性が低下した結果生じる形質の変化を指標 に細胞を選択する方法としては、 例えば、 生産抗体分子の糠鎖構造を指標として 形質転換体を選択する方法や、 細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形 質転換体を選択する方法などが挙げられる。 生産抗体分子の糖鎖構造を指標とし て形質転換体を選択する方法としては、 後述の 5. に記載の方法が挙げられる。 細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法として は、 N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコース の 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法 を挙げることができる。 その具体的な例としては、 ソマテイク 'セル'アンド 'モレ キュラー 'ジエネテイクス (Somatic Cell ol. Genet. ) ， 12, 51 (1986)等に記 載のレクチンを用いた方法が挙げられる。
レクチンとしては、 N-ダリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミン の 6位とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいず れのレクチンでも用いることができるが、 レンズマメレクチン L C A (Lens Culinaris 由来の Lentil Agglutinin) 、 エンドゥマメレクチン P S A (Pi sum sativum 由来の Pea Lectin) 、 ソラマメレクチン V F A (Vicia faba 由来の Agglutinin) 、 ヒ ロチャワンタケレクテン A A L (Aleuria aurantia 由来の Lectin) 等が好ましい。
具体的には、 数 10 g /m 1〜： 10m g /m 1、 好ましくは 0. 5〜2· 0m g /m 1 の濃度の上述のレクチンを含む培地にで 1日〜2週間、 好ましくは 3日〜1週間培 養し、 生存している細胞を継代培養あるいはコロニーを採取後、 別の培養器に移 し、 さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることで、 本発明の宿主細 胞を選択することができる。
( b ) R D O方法による本発明の細胞の作製
' 本発明の細胞は、 《1， 6-フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし、 R D O法を用 い、 例えば、 以下のように作製することができる。
ひ 1, 6-フコース修飾酵素の c D NAあるいはゲノム D N Aを調製する。
調製した c D NAあるいはゲノム D NAの塩基配列を決定する。 決定した DNAの配列に基づき、 al， 6-フコース修飾酵素をコードする部分、 非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さの RDOのコンスト ラクトを設計し合成する。
合成した RDOを宿主細胞に導入し、 標的とした酵素、 すなわち α1，6-フコー ス修飾酵素に変異が生じた形質転換体を選択することにより、 本発明の細胞を作 製することができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする α 1,6-フコース修飾酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることが できる。 具体的には、 後述の 3. に記載の宿主細胞があげられる。
各種宿主細胞への R DOの導入には、 後述の 3. に記載の各種宿主細胞に適し た組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
αΐ, 6 -フコース修飾酵素の c DNAを調製する方法としては、 例えば、 上記 1 の （1) の （a) に記載の 「cDNAの調製方法」 などがあげられる。
al，6 -フコース修飾酵素のゲノム DNAを調製する方法としては、 例えば、 上 記 1の （1) の （a) に記載の 「ゲノム DN Aの調製方法」 などがあげられる。
DN Aの塩基配列は、 適当な制限酵素などで切断後、 pBluescript SK (-) (Stratagene社製） 等のプラスミドにクローニングし、 通常用いられる塩基配列 解析方法、 例えば、 サンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーデイング ス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.), 74, 5463 (1977)] 等の反応を行い、 塩基配列自動分析装置、 例 えば、 A. L. F. DNA シークェンサ一 （Pharmacia社製） 等を用いて解析すること で該 DNAの塩基配列を決定することができる。
RDOは、 常法または DN A合成機を用いることにより調製することができる。
RDOを宿主細胞に導入し、 標的とした酵素、 α1， 6-フコース修飾酵素の遺伝 子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、 モレキュラー 'クローニング第 2 版、 カレント 'プロトコールズ'イン'モレキュラー'バイオロジー等に記載された 染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
また、 上記 1の （1) の （a) に記載の、 α 1,6-フコース修飾酵素活性の変化を 指標とした 「形質転換体を選択する方法」 を用いることもできる。
RDOのコンストラク トは、 サイエンス（Science), 273, 1386, (1996)； ネィ チヤ一 · メ デイ シン（Nature Medicine), 4, 285, (1998)； へパ ト ロ ジー (Hepatology) , 25, 1462, (1997)； ジーン 'セラピー（Gene Therapy), 5, 1960， (1999)； ジーン ·セラピー（Gene Therapy), 5， I960, (1999); ジャーナル 'ォ ブ .モレキュラー 'メディシン（J. Mol. Med. ) , 75， 829, (1997)； プロシーディ ングス 'ォブ 'ザ 'ナショナノレ'アカデミー'ォブ 'サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96， 8774, (1999)； プロシーディンダス 'ォブ ·ザ'ナショナル'ァカデ ミー'ォプ'サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8768, (1999); ヌク レイツク 'アシッド ' リサーチ（Nuc. Acids. Res. ) , 27, 1323, (1999)； インべ スティゲーシヨン ·ォブ ' ダーマトロジー（Invest. Dematol. ), 111, 1172, (1998)； ネイチヤー . バイオテクノロジー（Nature Biotech.), 16, 1343, (1998)； ネイチヤー 'バイオテクノロジー（Nature Biotech.), 18， 43， （2000); ネイチヤー 'バイオテクノロジー（Nature Biotech. ), 18， 555， （2000)等の記載 に従って設計することができる。
(c) トランスポゾンを用いた方法による、 本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、 ネイチヤー 'ジエネテイク（Nature Genet.), 25, 35， (2000) 等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、 α 1,6-フコース修飾酵素の活性、 あるいは生産抗体分子または細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に突然変 異体を選択することで、 本発明の細胞を作製することができる。
トランスポゾンのシステムとは、 外来遺伝子をランダムに染色体上に揷入させ ることで突然変異を誘発させるシステムであり、 通常、 トランスポゾンに揷まれ た外来遺伝子を突然変異を誘発させるベクターとして用い、 この遺伝子を染色体 上にランダムに揷入させるためのトランスポゼースの発現べクタ一を同時に細胞 の中に導入する。
トランスポゼ一スは、 用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいか なるものも用いることができる。
外来遺伝子としては、 細胞の DNAに変異を誘起するものであればいかなる遺 伝子も用いることができる。
細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする α1，6_フ コース修飾酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述の 3. に記載の宿主細胞があげられる。
本発明の細胞を宿主細胞として抗体分子をコードする遺伝子を導入するには、 後述の 3. に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いる ことができる。 α 1, 6 -フコース修飾酵素の活性を指標として突然変異体を選択する方法として は、 例えば、 上記 1の （1) の （a ) に記載の、 a l，6-フコース修飾酵素活性の変 化を指標とした 「形質転換体を選択する方法」 が挙げられる。
( d ) ァンチセンス法又はリボザィム法による本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、 （¾ 1， 6—フコース修飾酵素をコードしている遺伝子を標的 とし、 細胞工学， 12, 239， (1993)、 バイオ Zテクノロジー（BI0/TECHN0L0GY) , 17, 1097, (1999)、 ヒユーマン ·モレキュラー · ジエネティタス（Hum. Mol. Genet. ) , 5, 1083， （1995)、 細胞工学， 1¾ 255， (1994) 、 プロシーディングス 'ォブ ·ザ' ナショナル'ァカデミ' ~ ·ォブ ·サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 96, 1886 (1999)等に記載されたアンチセンス法又はリボザィム法を用いて、 例えば、 以下のように作製することができる。
標的遺伝子の c D NAあるいはゲノム D NAを調製する。
調製した c D N Aあるいはゲノム D N Aの塩基配列を決定する。
決定した D N Aの配列に基づき、 標的遺伝子の翻訳領域の部分、 非翻訳領域の 部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボ ザィムのコンストラタトを設計する。
該アンチセンス遺伝子、 またはリボザィムを細胞内で発現させるために、 調製 した D N Aの断片、 または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に揷 入することにより、 組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することによ り形質転換体を得る。
標的遺伝子がコードする蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択すること により、 本発明の細胞を得ることができる。 また、 細胞膜上の糖タンパク質の糖 鎖構造または産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することに より、 本発明の細胞を得ることもできる。
本発明の細胞を作製するために用いられる宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞など、 標的とする遺伝子を有しているものであればいずれも 用いることができる。 具体的には、 後述の 3 . に記載の宿主細胞が挙げられる。 発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組み込みが可能で、 設計したアンチセンス遺伝子、 またはリボザィムを転写 できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。 具体的には、 後述 の 3 . に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、 後述の 3 . に記載の各種宿主細 胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
標的遺伝子の c D NA及ぴゲノム D N Aを取得する方法としては、 例えば、 上 記 1の （1 ) の （a ) に記載の 「c D N Aの調製方法」 及び 「ゲノム D N Aの調 製方法」 などがあげられる。
標的遺伝子がコードする蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法 としては、 上記 1の （1 ) の （a ) に記載の 「形質転換体を選択する方法」 があ げられる。
また、 標的遺伝子がコードする蛋白質の活性が低下した結果生じる形質の変化 を指標に細胞を選択する方法としては、 例えば、 産生抗体分子の糖鎖構造を指標 として形質転換体を選択する方法や、 細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標と して形質転換体を選択する方法などが挙げられる。 産生抗体分子の糖鎖構造を指 標として形質転換体を選択する方法としては、 後述の 5 . に記載の方法が挙げら れる。 細胞表面上の糠蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法 としては、 上述の、 N—グリコシド結合糖鎖還元末端の N—ァセチルダルコサミ ンの 6位とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性であ る株を選択する手法を挙げることができる。 その具体的な例としては、 ソマティ ク.セノレ.アンド.モレキュラー.ジエネテイクス (Somatic Cell Mol. Genet. ) ， 12, 51， （1986)等に記載のレクチンを用いた方法が挙げられる。
また、 発現ベクターを用いず、 標的遺伝子の塩基配列に基づいて設計したアン チセンスオリゴヌクレオチドまたはリポザィムを、 直接宿主細胞に導入すること で、 本発明の細胞を得ることもできる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザィムは、 常法または D N A合成 機を用いることにより調製することができる。 具体的には、 標的遺伝子の c D N Aおよびゲノム D N Aの塩基配列のうち、 連続した 5〜1 5 0塩基、 好ましくは 5〜6 0塩基、 より好ましくは 1 0〜4 0塩基に相当する配列を有するオリゴヌ クレオチドの配列情報に基づき、 該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当す るオリゴヌクレオチド (アンチセンスオリゴヌクレオチド) または該オリゴヌク レオチドの配列を含むリボザィムを合成することで調製することができる。 オリゴヌクレオチドとしては、 オリゴ R NAおよび該オリゴヌクレオチドの誘 導体 （以下、 オリゴヌクレオチド誘導体という） 等があげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステ ル結合がホスフォロチォエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 ォ リゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N 3 '— P 5 'ホスフォアミデート 結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリポース とリン酸ジエステル結合がぺプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘 導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C一 5プロピニルゥラシルで置換され たォリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C一 5チアゾ ールゥラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中の シトシンが C一 5プロピニルシトシンで置換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノキサジン修飾シトシン (phenoxazine- modified cytosine) で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチ ド中のリボースが 2 ' _ O—プロピルリボースで置換されたォリゴヌクレオチド誘 導体、 あるいはオリゴヌクレオチド中のリポースが 2 '—メ トキシエトキシリボー スで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる [細胞工学， 1^， 1463 (1997) ] 。
( e ) R NA i方法による本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子を標的とし、 R N A i (RNA interference) 法を用い、 例えば、 以下のように作製することができる。 R NA i法とは、 2本鎖の RNAを細胞中に導入して、 細胞中に存在する該 R Aの配列 に相同な mRNAを分解破壌し、 遺伝子発現を抑える方法をいう。
標的遺伝子の c D N Aを調製する。
調製した c D NAの塩基配列を決定する。
決定した D N Aの配列に基づき、 標的遺伝子の翻訳領域の部分ある ヽは非翻訳 領域の部分を含む適当な長さの R NA i遺伝子のコンストラクトを設計する。 該 R NA i遺伝子を細胞内で発現させるために、 調製した D NAの断片、 また は全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、 組換 えベクターを作製する。
該組換えベクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することによ り形質転換体を得る。 標的遺伝子がコードする蛋白質の活性、 あるいは産生抗体分子または細胞表面 上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、 本発明の細 胞を得ることができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的遺伝子を有 しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述の 3. に 記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組み込みが可能で、 設計した RNA i遺伝子を転写できる位置にプロモータ 一を含有しているものが用いられる。 具体的には、 ポリメラーゼ IIIにより転写が 行われるタイプの発現ベクターあるいは後述の 3. に記載の発現ベクターがあげ られる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、 後述の 3. に記載の各種宿主細胞に適し た組換えべクターの導入方法を用レ、ることができる。
標的遺伝子がコードする蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法、 あるいは、 細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択す る方法としては、 例えば、 前記 1の （1) の （a) に記載の方法が挙げられる。 また、 産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 後述の 5. に記載の方法が挙げられる。
標的遺伝子がコードする蛋白質の c DN Aを調製する方法としては、 例えば、 前記 1の （1) の （a) に記載された 「cDNAの調製方法」 などがあげられる。 また、 発現ベクターを用いず、 標的遺伝子の塩基配列に基づいて設計した RN A i遺伝子を、 直接宿主細胞に導入することで、 本発明の細胞を得ることもでき る。
RNA i遺伝子は、 常法または DNA合成機を用いることにより調製すること ができる。
R N A i遺伝子のコンス トラク トは、 [ネイチヤー（Nature), 391, 806， (1998)； プロシ一ディングス 'ォブ 'ザ'ナショナル'ァカデミ' ~·ォブ'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 15502, (1998); ネイチヤー（Nature), 395, 854, (1998)； プロシーディングス 'ォブ 'ザ'ナショナル'ァカデミ一'ォプ.サイエ ンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049， （1999); セル（Cell), 95, 1017， (1998)； プロシーディングス 'ォブ ·ザ.ナショナル ·アカデミー ·ォブ.サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 1451, (1999); プ口シーデイングス.ォブ . ザ'ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 95, 13959, (1998) ; ネイチヤー 'セル 'パイォォロジー（Nature Cell Biol. )， 2, 70, (2000) ]等の記載に従って設計することができる。
本発明の RNAi法に用いられる R Aとしては、 N -ダリコシド結合複合型糖鎖還元末 端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関 与する酵素蛋白質をコードする DNAに対応する RNAがあげられる。 好ましくは Ν -グ リコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位力 S α結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質が、 ひ 1， 6 -フコシルトランスフ エラーゼである DNAに対応する RNAがあげられる。
本発明の R N A i法で使用される RNA としては、 R NAおよびその相捕 R NA で構成され、 かつ a l， 6-フコシルトランスフェラーゼの m R NA量を減少させる ことが可能な 2本鎖 RNA であればいかなるものでもよいが、 RNA の長さとしては、 好ましくは 1 〜 3 0、 より好ましくは 5〜 2 9、 さらに好ましくは 1 0〜 2 9、 最も好ましくは 1 5〜 2 9の連続した RNAがあげられる。
( 2 ) ドミナントネガティブ体を導入する手法による、 本発明の細胞の作製 本発明の細胞は、 1， 6—フコース修飾酵素を標的とし、 該蛋白質のドミナ ントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。
ドミナントネガティブ体の具体的な例として、 細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコ ースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の例が挙げられる。
細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターは、 小胞体及びゴルジ体の膜上にお いてダイマーを形成して機能していることが知られている [ジャーナル ·ォブ ·バ ィォロジカル 'ケミストリー（J. Biol. Chem. ) , 275, 17718, 2000]。 また、 細 胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターの変異体を細胞内で強制発現させること により、 野生型トランスポーターとヘテロダイマーを形成し、 形成したヘテロダ イマ一は野生型ホモダイマーに対して阻害活性を示すことが報告されている [ジャ ーナル ·ォブ ·バイオロジカル 'ケミストリー（J. Biol. Chem. ) ， 275, 17718， 2000]。 従って、 細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターの変異体を作製し細胞 内に導入することで、 ドミナントネガティプ体として機能させることが可能であ る。 このような変異体の作製は、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレント
•プロトコールズ 'イン'モレキュラー 'バイオロジー等に記載された部位特異 的変異導入法を用いて行うことができる。 本発明の細胞は、 上述のように作製したひ 1， 6—フコース修飾酵素のドミナ ントネガティブ体遺伝子を用い、 モレキュラー 'クローユング第 2版、 カレント' プロトコールズ'イン'モレキユラ' ~·バイオロジー、 マニピュレーティング ·マウ ス ·ェンブリオ第 2版等に記載された遺伝子導入の方法に従って、 例えば、 以下 のように作製することができる。
a 1 , 6—フコース修飾酵素のドミナントネガティブ体遺伝子を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長 D N Aをもとにして、 必要に応 じて、 該タンパク質をコードする部分を含む適当な長さの D NA断片を調製する。 該 D NA断片、 または全長 D NAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流 に挿入することにより、 糸且換えベクターを作製する。
該組換えべクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することによ り、 形質転換体を得る。
ひ 1， 6—フコース修飾酵素の活性、 あるいは産生抗体分子または細胞膜上の 糖タンパク質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、 本発明の宿主細 胞を作製することができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする蛋白 質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述の 3 . に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組み込みが可能で、 目的とするドミナントネガティブ体をコードする D N A を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。 具体的には、 後述の 3 . に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、 後述の 3 . に記載の各種宿主細胞に適し た組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
標的蛋白質の活性を指標として突然変異体を選択する方法、 あるいは、 細胞膜 上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、 例えば、 前記 1の （1 ) に記載の方法が挙げられる。 また、 産生抗体分子の糖鎖 構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 後述の 4 . に記 載の方法が挙げられる。 (3) 酵素についての突然変異を導入する手法
本発明の細胞は、 1, 6-フコース修飾酵素の遺伝子について突然変異を導入し、 該酵素に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製 することができる。
N -ダリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が α結合する酵素としては、 具体的にはひ 1, 6 -フコシルトランスフヱ ラーゼ、 ひ- L-フコシダーゼなどがあげられる。
具体的には、 1) 突然変異誘発処理で親株細胞を処理した突然変異体あるいは自 然発生的に生じた突然変異体から、 α 1， 6-フコース修飾酵素活性の変化を指標と して所望の細胞株を選択する方法、 2) 突然変異誘発処理で親株細胞を処理した突 然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、 生産抗体分子の糖鎖構造 を指標として所望の細胞株を選択する方法、 3) 突然変異誘発処理で親株細胞を処 理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、 該細胞の細胞膜 上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などが挙 げられる。
突然変異誘発処理としては、 親株細胞の D N Aに点突然変異、 欠失あるいはフ レームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができ る。 具体的には、 ェチル二トロソゥレア、 ニトロソグァュジン、 ベンゾピレン、 アタリジン色素による処理、 放射線の照射などがあげられる。 また、 種々のアル キル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。 突然変異誘 発物質を細胞に作用させる方法としては、 例えば、 組織培養の技術第三版 （朝倉 書店） 日本組織培養学会編（1996)、 ネィチヤ一 ·ジヱネティクス (Nature Genet. ) , 24, 314, (2000)等に記載の方法を挙げることができる。
自然発生的に生じた突然変異体としては、 特別な突然変異誘発処理を施さない で、 通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる 突然変異体を挙げることができる。
α 1, 6 -フコース修飾酵素活性の変化を指標として所望の細胞株を選択する方法、 生産抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、 細胞膜上の 糖タンパク質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法としては、 例 えば、 上記 1の （1) の （a ) に記載の、 α 1, 6-フコース修飾酵素活性の変化を指 標とした 「形質転換体を選択する方法」 が挙げられる。 ( 4 ) GDP -フコース輸送蛋白質の転写または翻訳を抑制する手法
本発明の宿主細胞は、 α ΐ , 6—フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし、 アン チセンス RNA/DNA技術 [バイォサイエンスとィンダストリー， 50, 322 (1992)、 化 学 ， ， 681 (1991) 、 Biotechnology, 9, 358 (1992) 、 Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992)、 Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992)、 細胞 工学， l^, 1463 (1997) ] 、 ト リ プル · ヘ リ ッ ク ス技術 [Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992) ] 等を用い、 標的とする遺伝子の転写または翻訳 を抑制することで作製することができる。
2. 本発明の、 トランスジエニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫の作 製
本発明の、 抗体分子の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性が制御されるようにゲノ ム遺伝子が改変されたトランスジエニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら 子孫は、 α 1, 6-フコース修飾酵素の遺伝子を標的として、 1. に記載の手法を用い て作製した胚性幹細胞、 受精卵細胞、 または植物細胞より、 公知の方法を用い作 製することができる。
Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が α結合する酵素としては、 具体的には a 1, 6-フコシルトランスフエ ラーゼ、 a _L_フコシダーゼなどがあげられる。
具体的な方法について、 以下に記す。
トランスジェユック非ヒト動物の場合、 目的とする非ヒト動物、 例えばゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 プタ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 ニヮトリ、 サル、 ゥサギ等の胚性 幹細胞に、 1. に記載の手法を用いることにより、 a l， 6-フコース修飾酵素の活性 が制御された本発明の胚性幹細胞を作製することができる。
具体例としては、 染色体上の a l， 6-フコース修飾酵素をコードする遺伝子を公 知の相同組換えの手法 [例えば、 Nature, 326， 6110， 295 (1987)、 Cell, 51, 3, 503 (1987)等] により不活化または任意の配列と置換した変異クローンなどがあ げられる。 作製した胚性幹細胞 （例えば、 該変異クローン） を用い、 動物の受精 卵の胚盤胞（blastocyst)への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により、 性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を調製することができる。 こ のキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、 全身の細胞で a 1， 6 -フコース修飾 酵素の活性が低下したトランスジェエック非ヒト動物を得ることができる。 標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 E S糸田月包 を用いた変異マウスの作製等に記載の方法にしたがって作製することができる。 ターゲットベクターは、 リプレースメント型、 インサーシヨン型、 ジーントラッ プ型いずれでも用いることができる。
胚性幹細胞へのターゲットベクターの導入方法としては、 動物細胞に DNA を導 入する方法であればいずれも用いることができ、 例えば、 エレク ト口ポレーショ ン法 [サイ トテクノロジー （Cytotechnology)， 3, 133 (1990) ] 、 リン酸カルシ ゥム法 (特開平 2-227075)、 リボフヱクシヨン法 [プロシーディンダス 'ォブ 'ザ' ナショナル'ァカデミ ォブ'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 84, 7413 (1987) ] 、 インジェクション法 (マニピュレーティング 'マウス 'ェンプリ ォ第 2版） 、 パーティクルガン （遺伝子銃） を用いる方法 （日本特許第 2606856、 日本特許第 2517813)、 DEAE-デキストラン法 [バイオマニュアルシリーズ4一遺伝 子導入と発現 ·解析法 （羊土社） 横田崇 ·新井賢一編（1994) ] 、 ウィルスベクタ 一法 （マニピユレ一ティング 'マウス 'ェンブリオ第 2 版） 等をあげることがで きる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、 例えば、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 E S糸田胞 を用いた変異マウスの作製等に記載のポジティブ選択、 プロモーター選択、 ネガ ティブ選択、 ポリ A選択などの方法を用いることができる。 具体的には、 hprt遺 伝子を含むターゲットベクターの場合は、 hprt 遺伝子を欠損した胚性幹細胞に導 入後、 胚性幹細胞をァミノプテリン、 ヒポキサンチンおょぴチミジンを含む培地 で培養し、 アミノブテリン耐性の株を選別することにより、 hprt 遺伝子を含む相 同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。 ネオマイシン耐性 遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、 ベクターを導入した胚性幹細胞を G418を含む培地で培養し、 G418耐性の株を選別することにより、 ネオマイシン耐 性遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティプ選択を行なうことができる。 DT遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、 ベクターを導入した胚性幹細胞を 培養し、 生育してきた株を選別する （相同組換え以外のランダムに染色体に挿入 された組換え体は、 DT遺伝子が染色体に組み込まれて発現するため、 DTの毒性に より生育できない） ことにより、 DT遺伝子を含まない相同組換え体を選別するネ ガティブ選択を行なうことができる。 選別した細胞株の中から目的とする相同組 換え体を選択する方法としては、 ゲノム DNA に対するサザンハイブリダィゼーシ ョン法 （モレキュラー ·クローニング第 2版） や PCR法 [ピーシーアール ·プロ トコ一ルス、 (PCR Protocols) , Academic Press (1990) ] 等があげられる。
胚性幹細胞を集合キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、 一般に 8 細胞期以前の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。 胚性幹細胞を注入キメ ラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、 一般に 8細胞期から胚盤胞の発生 段階の受精卵を用いることが好ましい。
雌マウスへ受精卵を移植する場合には、 精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させ ることにより、 受精能を誘起された偽妊娠雌マゥスに得られた受精卵を人工的に 移植および着床させる方法が好ましく、 偽妊娠雌マウスは自然交配によっても得 られる力 黄体形成ホルモン放出ホルモン （以下、 LHRH と略する） あるいはその 類縁体を投与後、 雄マウスと交配させることにより、 受精能を誘起された偽妊娠 雌マウスを得ることもできる。 LHRHの類縁体としては、 例えば [3, 5- Dil- Tyr5]- LHRH, [Gln8]_LHRH、 [D- Ala6]- LHRH、 des- GlylO_[D- His (Bzl) 6]- LHRH ethylamide 等があげられる。
また、 目的とする非ヒ ト動物、 例えばゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥマ、 マウ ス、 ラット、 ニヮトリ、 サル、 ゥサギ等の受精卵細胞に、 1. に記載の手法を用い ることにより、 ひ 1, 6-フコース修飾酵素の活性が低下した本発明の受精卵細胞を 作製することができる。
作製した受精卵細胞を、 マ二ピューレ一ティング'マウス'ェンブリオ第 2版等 に記載の胚移植の方法を用いて偽妊娠雌の卵管あるいは子宮に移植し出産させる ことで、 1， 6-フコース修飾酵素の活性が低下したトランスジエニック非ヒト動 物を作製することもできる。
トランスジヱニック植物の場合、 目的とする植物体力ルスまたは細胞に、 1. に 記載の手法を施すことで α 1， 6-フコース修飾酵素の活性が低下した本発明の植物 細胞からなる力ルスを作製することができる。
作製したカルスを、 公知の方法 [組織培養， 20 (1994)； 組織培養， 21 (1995)； トレンド.イン 'バイオテクノロジー（Trends in Biotechnology) , 15， 45 (1997) ] に準じてオーキシンおよびサイトカイニンを含む培地で培養することで再分化さ せ、 α 1, 6 -フコース修飾酵素の活性が低下したトランスジエニック植物を作製す ることができる。 3. 抗体組成物の製造方法
抗体組成物は、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレント'プロトコールズ' イン *モレやュフ■—ノ ィォロン一、 Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (以下、 アンチボディズと略す） 、 Monoclonal Antibodies : principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1996 (以 下、 モノクローナル 'アンチボディズと略す） 、 Antibody Engineering, A Practical Approacn, IRL Press at Oxford University Press, 1996 (以 T、 ァ ンチボディ 'エンジニアリングと略す） 等に記載された方法を用い、 例えば、 以 下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
抗体分子の c D NAを調製する。
調製した抗体分子の全長 c D N Aをもとにして、 必要に応じて、 該蛋白質をコ ードする部分を含む適当な長さの D N A断片を調製する。
該 D N A断片、 または全長 c D NAを適当な発現ベクターのプロモーターの下 流に揷入することにより、 組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することによ り、 抗体組成物を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞として、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 目的とする遺伝子 を発現できるものであればいずれも用いることができる。
抗体分子の Fc領域に結合する N-グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素を遺 伝子工学的な手法を用いて導入した、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等の 細胞を宿主細胞として用いることもできる。
抗体組成物の製造法に用いられる宿主細胞としては、 上記 1. で作製した、 本 発明の細胞をあげることができる。
発現ベクターとしては、 上記各種宿主細胞において自立複製可能ないしは染色 体中への組込が可能で、 目的とする抗体分子をコードする D N Aを転写できる位 置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
c D NAは、 上記 1. の （1) の （a ) に記載の 「c D N Aの調製方法」 に従い、 ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞より、 目的とする抗体分子に特異的なプ ローブプライマーを用いて調製することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 YEP13 (ATCC37115) 、 YEp24 (ATCC37051) 、 YCp50 (ATCC37419) 等をあげることができ る。 プロモーターとしては、 酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを 用いてもよく、 例えば、 へキソースキナーゼ等の解糠系の遺伝子のプロモーター、
PHO5 プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロ モーター、 gal 1 プロモーター、 gal 10 プロモーター、 ヒートショックタンパク 質プロモーター、 MFal プロモーター、 CUP 1 プロモーター等をあげることがで きる。
宿主細胞としては、 サッカロミセス属、 シゾサッカロミセス属、 クリュイべ口 ミセス属、 トリコスポロン属、 シュヮニォミセス属等に属する酵母、 例えば、 Saccharomyces cerevisiae^ schizosaccharomyces pomi3e、 Kluyveromyces lactis、 Trichosporon pullulans Schwanniomyces alluvius等をあげ、ること力 sできる。 組換えベクターの導入方法としては、 酵母に DN Aを導入する方法であればい ずれも用いることができ、 例えば、 エレク ト口ポレーシヨン法 [メソッズ 'ェン ザィモロジ一（Methods. Enzymol. ), 194, 182 (1990)] 、 スフエロプラスト法 [プ 口シーデイングス ·ォブ'ザ'ナショナル 'ァカデミ一'ォブ'サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 84， 1929 (1978)] 、 酢酸リチウム法 [ジャーナル .ォブ . パクテリォロジ一（J. Bacteriology), 153, 163 (1983)] 、 プロシーデイングス' ォブ'ザ'ナショナル'アカデミー'ォブ'サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 75, 1929 (1978)] に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 pc DN AI、 p c DM8 (フナコシ社より市販） 、 pAGE107 [特開平 3-22979 ;サイトテク ノロジー（Cytotechnology), 3, 133， (1990) ] 、 pAS3 - 3 [特開平 2-227075] 、 PCDM8 [ネイチヤー（Nature), 329, 840, (1987)] 、 pcDNAI/Amp (Invitrogen 社 製） 、 pREP4 (Invitrogen社製） 、 pAGE103 [ジャーナル ·ォブ ·バイオケミスト リー（J. Biochemistry), 101, 1307 (1987)] 、 pAGE210 等をあげることができる。 プロモーターとしては、 動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いる ことができ、 例えば、 サイトメガロウィルス （CMV) の IE (immediate early) 遺 伝子のプロモーター、 SV40 の初期プロモーター、 レトロゥイノレスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒートショックプロモーター、 SRaプロモー ター等をあげることができる。 また、 ヒ ト CMVの I E遺伝子のェンハンサーを プロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、 ヒ トの細胞であるナマルバ (Naraalwa) 細胞、 サルの細胞で ある COS細胞、 チャイニーズ 'ハムスターの細胞である CH0細胞、 HBT5637 (特開 昭 63 - 299) 、 ラットミエローマ細胞、 マウスミエローマ細胞、 シリアンハムスタ 一腎臓由来細胞、 胚性幹細胞、 受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、 動物細胞に D N Aを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、 例えば、 エレクトロポレーシヨン法 [サイ トテク ノロジー（Cytotechnology) , 3， 133 (1990) ] 、 リン酸カルシウム法 [特開平 2- 227075] 、 リボフヱクシヨン法 [プロシーディングス'ォプ'ザ 'ナショナル 'ァ力 デミ一 'ォブ 'サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 84， 7413 (1987) ] 、 インジェクション法 [Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) (以下、 マニピ ユレ一ティング 'マウス 'ェンプリオ第 2版と略す） ]、 パーティクルガン （遺伝 子銃） を用いる方法 [日本特許第 2606856、 日本特許第2517813] 、 D E A E—デ キストラン法 レ ィォマニュアルシリーズ 4一遺伝子導入と発現 '解析法 （羊土 社） 横田崇 ·新井賢一編（1994) ] 、 ウィルスベクター法 [マニピユレ一ティング ' マウス ·ェンブリオ第 2版]等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、 例えばカレント ·プロ トコール ス · づ ン · モレ = ュフー · / ィォロン一、 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman ana Company, New York (1992)、 ノヽィォ/ァ クノロジー（Bio/Technology)， 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、 タン パク質を発現することができる。
して昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、 さらに組換えウィルスを昆 虫細胞に感染させ、 タンパク質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、 例えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacIII (ともに Invitorogen社製） 等をあげることができる。
パキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスである アウ トグラファ 'カリフオノレニ力 ·ヌクレアー ' ポリへドロシス · ウイノレス (Autographa californica nuclear polynedrosis virusノ等を用レヽること力飞、、きる。 昆虫細胞としては、 Spodopterafrugiperda の卵巣細胞である Sf9、 Sf21 [カレ ント · プロ トコーノレズ ' イン · モレキュラー · バイオ口ジー Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992) ] 、 Trichoplusia ni の卵巣細胞である High 5 (Invitrogen社製） 等を用いることができる。 組換えウィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べクタ 一と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法
(特開平 2-227075) 、 リボフヱクシヨン法 [プロシーデイングス'ォブ 'ザ 'ナシ ョナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 84, 7413 (1987) ] 等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 T iプラスミド、 タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、 植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを 用いてもよく、 例えば、 カリフラワーモザイクウィルス （CaMV) の 35S プロモー ター、 ィネアクチン 1プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、 タバコ、 ジャガイモ、 トマト、 ニンジン、 ダイズ、 アブラ ナ、 アルフアルファ、 イネ、 コムギ、 ォォムギ等の植物細胞をあげることができ る。
組換えベクターの導入方法としては、 植物細胞に D N Aを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、 例えば、 ァグロバタテリゥム （Agrobacterium) を 用いる方法 [特開昭 59-140885、 特開昭 60-70080、 W094/00977] 、 エレクトロポ レーシヨン法 [特開昭 60-251887] 、 パーティクルガン （遺伝子銃） を用いる方 法 [日本特許第 2606856、 日本特許第 2517813] 等をあげることができる。
抗体遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 モレキュラー 'クローニン グ第 2版に記載されている方法等に準じて、 分泌生産、 Fc領域と他のタンパク質 との融合タンパク質発現等を行うことができる。
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞または植 物細胞等により発現させた場合には、 導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が 付加された抗体分子を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、 培養物中に抗体分子を 生成蓄積させ、 該培養物から採取することにより、 抗体組成物を製造することが できる。 形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主細胞の培養に用いられる通常 の方法に従って行うことができる。
酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 該生物が資化 し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行え る培地であれば天然培地、 合成培地のいずれを用いてもよい。 炭素源としては、 該生物が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラク トース、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン加水分 解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノール などのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸ァ ンモユウム、 リン酸アンモェゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩、 その他の含窒素'化合物、 ならびに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンス チープリカー、 カゼイン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵 菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネ シゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マン癌、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、 通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。 培 養温度は 15〜40°Cがよく、 培養時間は、 通常 16時間〜 7日間である。 培養中の p Hは 3. 0〜9. 0に保持する。 p Hの調製は、 無機または有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用いて行う。
また、 培養中必要に応じて、 アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を 培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプ口モーターを用いた組換えべクターで形質転換 した微生物を培養するときには、 必要に応じてィンデューサーを培地に添加して もよい。 例えば、 lac プロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生 物を培養するときにはイソプロピル一 ]3— D—チォガラタトピラノシド等を、 trp プロモーターを用いた組換えべクターで形質転換した微生物を培養するときには インドールァクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般 に使用されている RPMI1640培地 [ザ ·ジャーナル ·ォプ ·ザ ·アメリカン'メデ イ カノレ ' ァ ソ シェイ シ ヨ ン （The Journal of the American Medical Association) , 199, 519 (1967) ] 、 Eagleの MEM培地 [サイエンス（Science)， 122， 501 (1952) ] 、 ダルベッコ改変 MEM培地邊 [ヴユウロロジー（Virology)， 8， 396 (1959) ] 、 199 培地 [プロシーディング ·ォブ ·ザ · ソサイエティ 'フォア ' ザ · ノ ィォロジカル · メディスン (Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 73, 1 (1950) ] 、 Whitten培地 [発生工学実験マ二ユア ル-トランスジエニック ·マウスの作り方 （講談社） 勝木元也編 （1987) ]またはこ れら培地に牛胎児血淸等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、 通常 p H6〜8、 30〜40°C、 5%C02存在下等の条件下で 1〜7 日間行う。 フエドパッチ培養、 ホロファイバー培養などの培養法を用いて 1 日〜数ケ月培養 を行うこともできる。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地に 添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般 に使用されている TNM- FH培地 （Pharmingen社製） 、 Sf- 900 II SFM培地 （Life Technologies社製） 、 ExCell400、 ExCell405 (いずれも JRH Biosciences社製） 、 Grace' s Insect Medium [ネイチヤー（Nature) , 195, 788 (1962) ] 等を用いるこ とができる。
培養は、 通常 p H6〜7、 25〜30°C等の条件下で、 1〜5日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加しても よい。
植物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体は、 細胞として、 または植物の 細胞や器官に分化させて培養することができる。 該形質転換体を培養する培地と しては、 一般に使用されているムラシゲ ·アンド · スターグ (MS)培地、 ホワイト (White)培地、 またはこれら培地にオーキシン、 サイトカイニン等、 植物ホルモン を添力 Bした培地等を用いることができる。
培養は、 通常 p H5〜9、 20〜40°Cの条件下で 3〜60日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ハイグロマイシン等の抗生物質を 培地に添加してもよい。
上記のとおり、 抗体分子をコードする D N Aを組み込んだ組換え体ベクターを 保有する酵母、 動物細胞、 あるいは植物細胞由来の形質転換体を、 通常の培養方 法に従って培養し、 抗体組成物を生成蓄積させ、 該培養物より抗体組成物を採取 することにより、 抗体組成物を製造することができる。
抗体組成物の生産方法としては、 宿主細胞内に生産させる方法、 宿主細胞外に 分泌させる方法、 あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、 使用する宿 主細胞や、 生産させる抗体分子の構造を変えることにより、 該方法を選択するこ とができる。 抗体組成物が宿主細胞内あるレ、は宿主細胞外膜上に生産される場合、 ポールソ ンらの方法 [ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル 'ケミストリー（J. Biol. Chem. ) , 264, 17619 (1989) ] 、 ロウらの方法 [プロシーディングス'ォブ'ザ 'ナ ショナル'アカデミー'ォプ 'サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 86， 8227 (1989) ; ジーン ·デベロップメント（Genes Develop. ) , 4, 1288 (1990) ] 、 または特開平 05-336963、 特開平 06-823021 等に記載の方法を準用することによ り、 該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、 遺伝子組換えの手法を用いて、 発現ベクターに、 抗体分子をコード する D N A、 および抗体分子の発現に適切なシグナルぺプチドをコードする D N Aを揷入し、 該発現ベクターを宿主細胞へ導入した後に抗体分子を発現させるこ とにより、 目的とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。 また、 特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、 ジヒドロ葉酸還元酵素 遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、 遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、 遺 伝子が導入された動物個体 （トランスジェニック非ヒ ト動物） または植物個体 (トランスジヱニック植物） を造成し、 これらの個体を用いて抗体組成物を製造 することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、 通常の方法に従って、 飼育ま たは栽培し、 抗体組成物を生成蓄積させ、 該動物個体または植物個体より該抗体 組成物を採取することにより、 該抗体組成物を製造することができる。
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、 例えば公知の方法 [ァ メリカン 'ジャーナノレ ·オフ ·クリ二力ノレ ·ニュートリション (American Journal of Clinical Nutrition) , 63， 639S (1996)； アメ リカン ·ジャーナル ·ォブ ·ク リニ力,レ 'ニュートリション (American Journal of Clinical Nutrition) , 63， 627S (1996) ; バイオ/テクノロジー（Bio/Technology) , 9， 830 (1991) ] に準じ て遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産する方法があ げられる。
動物個体の場合は、 例えば、 抗体分子をコードする D NAを導入したトランス ジ ニック非ヒト動物を飼育し、 抗体組成物を該動物中に生成 ·蓄積させ、 該動 物中より抗体組成物を採取することにより、 抗体組成物を製造することができる。 該動物中の生成 '蓄積場所としては、 例えば、 該動物のミルク （特開昭 63- 309192) 、 卵等をあげることができる。 この際に用いられるプロモーターとして は、 動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、 例えば、 乳 腺細胞特異的なプロモーターであるひカゼインプロモーター、 カゼインプロモ 一ター、 j8ラクトグロプリンプロモーター、 ホエー酸性プロテインプロモーター 等が好適に用いられる。
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、 例えば抗体分子をコー ドする D N Aを導入したトランスジヱニック植物を公知の方法 [組織培養， 20 (1994)； 組織培養， 21 (1995)； トレンド 'イン 'バイオテクノロジー（Trends in Biotechnology) , 15， 45 (1997) ] に準じて栽培し、 抗体組成物を該植物中に生 成 -蓄積させ、 該植物中より該抗体組成物を採取することにより、 抗体組成物を 生産する方法があげられる。
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成 物は、 例えば抗体組成物が、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養終了後、 細胞を遠心分離により回収し、 水系緩衝液にけん濁後、 超音波破碎機、 フレンチ プレス、 マントンガウリンホモゲナイザー、 ダイノミル等により細胞を破碎し、 無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清か ら、 通常の酵素の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル （DEAE) —セファロース、 DIAI0N HPA-75 (三菱化学 （株） 製） 等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー 法、 S_Sepharose FF (Pharmacia社製） 等のレジンを用いた陽イオン交換クロマ トグラフィ一法、 プチルセファロース、 フエニノレセファロース等のレジンを用い た疎水性クロマトグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二ティーク ロマトグラフィ一法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電気泳動 法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 抗体組成物の精製標品を得ること ができる。
また、 抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に細胞を 回収後破砕し、 遠心分離を行うことにより、 沈殿画分として抗体組成物の不溶体 を回収する。 回収した抗体組成物の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。 該 可溶化液を希釈または透析することにより、 該抗体組成物を正常な立体構造に戻 した後、 上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることがで さる。
抗体 la成物が細胞外に分泌された場合には、 培養上清に該抗体組成物を回収す ることができる。 即ち、 該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理す ることにより可溶性画分を取得し、 該可溶性画分から、 上記と同様の単離精製法 を用いることにより、 抗体組成物の精製標品を得ることができる。
このようにして取得される抗体組成物として、 例えば、 抗体、 抗体の断片、 抗 体の Fc領域を有する融合タンパク質などを挙げることができる。
以下に、 抗体組成物の取得のより具体的な例として、 ヒ ト化抗体の組成物およ び Fc融合蛋白質の製造方法について記すが、 他の抗体組成物を上述の方法および 当該方法に準じて取得することもできる。
A. ヒ ト化抗体の組成物の製造
(1) ヒ ト化抗体発現用ベクターの構築
ヒ ト化抗体発現用ベクターとは、 ヒ ト抗体の H鎖および L鎖 C領域をコードす る遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、 動物細胞用発現べクタ 一にヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子をそれぞれクローニングするこ とにより構築することができる。
ヒ ト抗体の C領域としては、 任意のヒ ト抗体の CHおよび CLであることができ、 例えば、 ヒ ト抗体の H鎖の IgGlサブクラスの C領域 （以下、 hC y l と表記する） およびヒ ト抗体の L鎖の κクラスの C領域 （以下、 hC Kと表記する） 等があげら れる。
ヒ ト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子としてはェキソンとイントロンか ら成る染色体 DNAを用いることができ、 また、 cDNAを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、 ヒト抗体の C領域をコードする遺伝子を組 込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 PAGE107 [サイトテクノロジー（Cytotechnology) , 3， 133 (1990) ] 、 pAGE103 [ジ ヤーナル .ォブ .パイオケミストリー（j. Biochem. ) , 101， 1307 (1987) ] 、 PHSG274 [ジーン（Gene) , 27, 223 (1984) ] 、 pKCR [プロシーディングス .ォプ . ザ ' ナショナル ' アカデミー · ォブ · サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 78， 1527 (1981) ] 、 pSGl β d2-4 [サイ ト テ ク ノ ロ ジー (Cytotechnology) , 4， 173 (1990) ] 等があげられる。 動物細胞用発現ベクターに 用いるプロモーターとェンハンサ一としては、 SV40 の初期プロモーターとェンハ ンサー [ジャーナル ' ォブ 'パイオケミス ト リ ー（J. Biochem. ) , 101, 1307 (1987) ] 、 モロニ一マウス白血病ウィルスの LTR レ ィォケミカル 'アンド ·バ ィオフイジ力ノレ ' リサーチ ' コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun. ) , 149, 960 (1987) ] 、 免疫グロブリン H鎖のプロモーター [セ3ル（Cell) , 41, 479 (1985) ] とェンハンサー [セル（Cell) , 33, 717 (1983) ] 等があげられ る 0
ヒト化抗体発現用ベクターは、 抗体 H鎖おょぴ L鎖が别々のベクター上に存在 するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ （以下、 タンデム型と表 記する） のどちらでも用いることができるが、 ヒ ト化抗体発現ベクターの構築の 容易さ、 動物細胞への導入の容易さ、 動物細胞内での抗体 H鎖および L鎖の発現 量のパランスが均衡する等の点からタンデム型のヒ ト化抗体発現用ベクターの方 が好ましい [ジャーナノレ'ォプ'ィムノロジカノレ'メソッズ（J. Immunol. Methods) , 167, 271 (1994) ] 。
構築したヒ ト化抗体発現用ベクターは、 ヒ ト型キメラ抗体おょぴヒト型 CDR移 植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
(2) ヒト以外の動物の抗体の V領域をコードする cDNAの取得
ヒト以外の動物の抗体、 例えば、 マウス抗体の VHおよび VLをコードする cDNA は以下のようにして取得することができる。
目的のマウス抗体を生産するハイプリ ドーマ細胞より mRNA を抽出し、 cDNA を 合成する。 合成した cDNAをファージ或いはプラスミ ド等のベクターにクローニン グして cDNAライブラリーを作製する。 該ライブラリーより、 既存のマウス抗体の C領域部分或いは V領域部分をプローブとして用い、 VHをコードする cDNAを有す る組換えファージ或いは組換えプラスミ ドおよび VLをコードする cDNAを有する 組換えファージ或いは組換えプラスミ ドをそれぞれ単離する。 組換えファージ或 いは組換えプラスミ ド上の目的のマウス抗体の VHおよび VLの全塩基配列を決定 し、 塩基配列より VHおよび VLの全ァミノ酸配列を推定する。
ヒ ト以外の動物としては、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ゥサギ等、 ハイプリ ドーマ細胞を作製することが可能であれば、 いかなるものも用いることができる。 ハイプリ ドーマ細胞から全 RNA を調製する方法としては、 チォシアン酸グァ- ジン一トリフルォロ酢酸セシウム法 [メソッズ 'ィン 'ェンザィモロジ一（Methods in Enzymol. ) , 154, 3 (1987) ] 、 また全 RNAから mRNAを調製する方法としては、 オリゴ（dT)固定化セルロースカラム法 [モレキュラー · クローニング： ァ · ラボ フ 卜 リー · マニュゾノレ (Molecular Cloning: A Laooratory Manual) , Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989] 等があげられる。 また、 ハイプリ ドーマ細 胞から mRNA を調製するキッ トと しては、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen社製) 、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製) 等 があげられる。
cDNA の合成おょぴ cDNA ライプラリー作製法としては、 常法 [モレキュラー ' ク ローニング ： ァ · ラボラ ト リ ー · マ二ユアノレ (Molecular Cloning: A Laboratory Manual) , Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989； カレン 卜 ，プロ卜： πーノレズ ·イン ·モレキュラー ·ノ ィ才ロジ一 (Current Protocols in MolecularBiology), Supplement ト 34] 、 或レヽは市販のキット、 例えば、 Super Script™ Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL 社製） や ZAP- cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製） を用いる方法などがあげら れる。
cDNA ライブラリーの作製の際、 ハイプリ ドーマ細胞から抽出した mRNA を錶型 として合成した cDNAを組み込むベクターは、 該 cDNAを組み込めるベクターであ ればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 ZAP Express [ストラテジー ズ（Strategies), 5， 58 (1992) ] 、 pBluescript II SK (+) [ヌクレイック · ァシ ッズ . リ サーチ（Nucleic Acids Research) , 17， 9494 (1989) ] 、 λ zap II (Stratagene社製） 、 Lgtl0、 ^gtll [ディーェヌエー ·クロー-ング： ァ 'プ ラタティカノレ · アプローチ (DNA Cloning: A Practical Approach) , I, 49 (1985)] 、 Lambda BlueMid (Clontech社製） 、 ExCell、 pT7T3 18U (Pharmacia 社製） 、 pcD2 [モレキュラー ' アンド ' セルラー 'バイオロジー（Mol. Cell. Biol.), 3, 280 (1983)] および pUC18 [ジーン（Gene), 33， 103 (1985)] 等が用 いられる。
ファージ或いはプラスミ ドベクターにより構築される cDNAライブラリーを導入 する大腸菌としては該 cDNAライブラリーを導入、 発現おょぴ維持できるものであ ればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 XL1- Blue MRF' [ストラテジ ーズ（Strategies), 5, 81 (1992) ] 、 C600 [ジェネティックス（Genetics), 39, 440 (1954)] 、 Y1088、 Y1090 [サイエンス（Science), 222, 778 (1983)] 、 丽 522 [ジャーナル 'ォブ .モレキュラー 'バイオロジー（J. Mol. Biol.), 166, 1 (1983) ] 、 K802 [ジャーナル 'ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー（J. Mol. Biol.), 16, 118 (1966)] および JM105 [ジーン（Gene), 38， 275 (1985)] 等が 用いられる。 cDNA ライブラリーからのヒト以外の動物の抗体の VHおよび VL をコードする cDNA クローンの選択法としては、 アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用 いたコロニー ·ハイブリダィゼーション法或いはプラーク ·ハイブリダィゼーシ ヨン法 [モレキュラー · クローニング ： ァ · ラボラ トリー · マ-ユアノレ (Molecular Cloning : A Laboratory Manual) , Cold Spring Harbor Lab. Press NewYork, 1989] により選択することができる。 また、 プライマーを調製し、 mRNA から合成した cDNA或いは cDNA ライブラリーを錶型として、 Polymerase Chain Reaction [以下、 PCR 法と表記する ；モレキュラー ·クローニング：ァ · ラボラ トリ 1 ~ · マニュ /ノレ (Molecular Cloning: A Laboratory Manual) , Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989； カレント ·プロ トコーノレズ 'イン .モレキ ュフ' ~ ·ノ ィォロン一 (Current Protocols in Molecular Biology; , Supplement 1-34] により VHおよび VLをコードする cDNAを調製することもできる。
上記方法によ り選択された cDNA を、 適当な制限酵素などで切断後、 pBluescript SK (-） (Stratagene 社製） 等のプラスミ ドにクローニングし、 通常 用いられる塩基配列解析方法、 例えば、 サンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーディングス ·ォプ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. , U. S. A. ) , 74, 5463 (1977) ] 等の反応を行い、 塩基配 列自動分析装置、 例えば、 A. L. F. DNA シークェンサ一 （Pharmacia社製） 等を 用いて解析することで該 cDNAの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列から VHおよび VLの全アミノ酸配列を推定し、 既知の抗体の VHおよび VL の全アミノ酸配列 [シーケンシズ'ォブ'プロテインズ'ォプ'ィムノ ロン力ノレ *ィンタレスト (Sequences or Proteins of Immunologicallnterest) , US Dept. Health and Human Services, 1991 ] と比較することにより、 取得した cDNAが分泌シグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完全なァミノ酸配列をコー ドしているかを確認することができる。
(3) ヒト以外の動物の抗体の V領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完全なアミノ酸配列に関しては、 既知の抗体の VHおよび VLの全ァミノ酸配列 [シーケンシズ'ォブ'プロティンズ. オフ ' ムノロンカスレ 'インタレス ト (Sequences of Proteins of Immunological Interest) , US Dept. Health and Human Services, 1991] と比較することにより、 分泌シグナル配列の長さおよび N末端アミノ酸配列を推定でき、 更にはそれらが 属するサブグループを知ることができる。 また、 VHおよび VLの各 CDRのァミノ 酸配列についても、 既知の抗体の VHおよび VLのァミノ酸配列 [シーケンシズ 'ォ ブ 'プロテインズ'ォブ'ィムノロジカル 'インタレスト（Sequences of Proteins of Immunological Interest) , US Dept. Health and Human Services, 1991] と比較 することによって見出すことができる。
(4) ヒ ト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項 3の （1) に記載のヒ ト化抗体発現用ベクターのヒ ト抗体の CHおよび CLを コードする遺伝子の上流に、 ヒ ト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNA をクローニングし、 ヒ ト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。 例えば、 ヒ ト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを、 ヒ ト以外の 動物の抗体の VHおよび VLの 3'末端側の塩基配列とヒ ト抗体の CHおよび CLの 5， 末端側の塩基配列とから成り、 力つ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合 成 DNAとそれぞれ連結し、 それぞれを本項 3の （1) に記載のヒ ト化抗体発現用べ クタ一のヒ ト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形 で発現するようにクローユングし、 ヒ ト型キメラ抗体発現ベクターを構築するこ とができる。
(5) ヒ ト型 CDR移植抗体の V領域をコードする cDNAの構築
ヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは、 以下のようにして構 築することができる。 まず、 目的のヒ ト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDR を移植するヒ ト抗体の VHおよび VLのフレームワーク （以下、 FRと表記する） の ァミノ酸配列を選択する。 ヒ ト抗体の VHおよび VLの FRのァミノ酸配列としては、 ヒ ト抗体由来のものであれば、 いかなるものでも用いることができる。 例えば、 Protein Data Bank等のデータベースに登録されているヒ ト抗体の VHおよび VL の FRのァミノ酸配列、 ヒ ト抗体の VHおよび VLの FRの各サブグループの共通ァ ミノ酸配列 [シーケンシズ 'ォブ 'プロテインズ 'ォブ ·ィムノロジカル 'インタレス 卜 (Sequences of Proteins of Immunological Interest) , US Dept. Health and Human Services, 1991] 等があげられるが、 その中でも、 十分な活性を有するヒ ト型 CDR移植抗体を作製するためには、 目的のヒ ト以外の動物の抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性 （少なくとも 60%以上） を有する ァミノ酸配列を選択することが望ましい。 次に、 選択したヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列に目的のヒト以外 の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのァミノ酸配列を移植し、 ヒト型 CDR移植抗 体の VHおよび VLのァミノ酸配列を設計する。 設計したァミノ酸配列を抗体の遺 伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度 [シーケンシズ'ォブ'プロテインズ' ォプ *ィムノロン力ノレ ' ンタレスト (Sequences of Proteins of Immunological Interest) , US Dept. Health and Human Services, 1991] を考慮して DNA配列に 変換し、 ヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLのァミノ酸配列をコードする DNA配 列を設計する。 設計した DNA配列に基づき、 100塩基前後の長さから成る数本の 合成 DNAを合成し、 それらを用いて PCR法を行う。 この場合、 PCRでの反応効率 および合成可能な DNAの長さから、 H鎖、 L鎖とも 6本の合成 DNAを設計すること が好ましい。
また、 両端に位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入す ることで、 本項 3の （1) で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクロー二 ングすることができる。 PCR後、 増幅産物を pBluescript SK (-) (Stratagene社 製） 等のプラスミドにクローニングし、 本項 3の （2) に記載の方法により、 塩基 配列を決定し、 所望のヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLのァミノ酸配列をコー ドする DNA配列を有するプラスミドを取得する。
(6) ヒト型 CDR移植抗体の V領域のァミノ酸配列の改変
ヒト型 CDR移植抗体は、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRの みをヒト抗体の VHおよび VLの FRに移植しただけでは、 その抗原結合活性は元の ヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている [バイオ/テク ノロジー（BI0/TECHN0L0GY)， 9, 266 (1991) ] 。 この原因としては、 元のヒ ト以外 の動物の抗体の H鎖および L鎖 V領域では、 CDRのみならず、 FRのいくつかのァ ミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、 それらァミノ 酸残基が CDRの移植に伴い、 ヒト抗体の VHおよび VLの FRの異なるァミノ酸残基 へと変化してしまうことが考えられている。 この問題を解決するため、 ヒ ト型 CDR移植抗体では、 ヒト抗体の VHおよび VLの FRのァミノ酸配列の中で、 直接抗 原との結合に関与しているアミノ酸残基や CDRのアミノ酸残基と相互作用したり、 抗体の立体構造を維持し、 間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を 同定し、 それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、 低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている レ ィォ /テクノ口ジー
(BI0/TECHN0L0GY) , 9， 266 (1991) ] 。
ヒト型 CDR移植抗体の作製において、 該抗体と抗原との結合活性に関わる FRの アミノ酸残基を如何に効率よく同定することが、 最も重要な点である。 抗体と抗 原との結合活性に関わる FR のアミノ酸を同定する方法としては、 X線結晶解析 [ジャーナル'ォブ'モレキュラー 'バイオロジー （J. Mol. Biol. ) , 112, 535 (1977) ] 或いはコンピューターモデリング [プロテイン 'エンジニアリング (Protein Engineering) , 7, 1501 (1994) ] 等の抗体の立体構造の構築および解析 方法があげられる。 これら抗体の立体構造の情報は、 ヒト型 CDR移植抗体の作製 に多くの有益な情報をもたらした。 しかしながら、 あらゆる抗体に適応可能なヒ ト型 CDR移植抗体の作製法は未だ確立されていない。 したがって、 現状ではそれ ぞれの抗体について数種の改変体を作製し、 それぞれの抗原結合活性との相関を 検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体の VHおよび VLの FRのァミノ酸残基の改変は、 改変用合成 DNAを用い て本項 3の （5) に記載の PCR法により行うことができる。 PCR後の増幅産物につ いて本項 3の (2) に記載の方法により、 塩基配列を決定し、 目的の改変が施され たことを確認する。
(7) ヒト型 CDR移植抗体発現ベクターの構築
本項 3の （1) に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLを コードする遺伝子の上流に、 本項 3の （5) および （6) で構築したヒト型 CDR移 植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAをクローニングし、 ヒト型 CDR移植抗体 発現ベクターを構築することができる。 例えば、 本項 3 の （5) および （6) でヒ ト型 CDR移植抗体の VHおよび VLを構築する際に用いる合成 DNAのうち、 両端に 位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、 本項 3の （1) に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコード する遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、 ヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築することができる。 (8) ヒト化抗体の安定的生産
本項 3 の （4) および （7) に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞 に導入することによりヒ ト型キメラ抗体およびヒ ト型 C D R移植抗体 （以下、 併 せてヒト化抗体と称す） を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒ ト化抗体発現ベクターの導入法としては、 エレクトロポレーシ ヨン法 [特開平 2 - 257891 ; サイ トテクノ ロジー（Cytotechnology) , 3 ，133 (1990) ] 等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、' ヒ ト化抗体を生産させ ることができる動物細胞であれば、 いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、 マウスミエローマ細胞である NS0 細胞、 SP2/0 細胞、 チヤィニー ズハムスター卵巣細胞 CHO/dhfr-細胞、 CH0/DG44細胞、 ラットミエローマ YB2/0 細胞、 IR983F細胞、 シリアンハムスター腎臓由来である B HK細胞、 ヒ トミエロ 一マ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、 好ましくは、 チャイニーズハ ムスター卵巣細胞である CH0/DG44細胞、 ラットミエローマ YB2/0細胞、 1. に記 載の細胞等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、 ヒ ト化抗体を安定に生産する形質転換株は、 特開平 2-257891 に開示されている方法に従い、 G418 sulfate (以下、 G418 と表 記する ； SIGMA社製） 等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。 動 物細胞培養用培地としては、 RPMI1640培地 （日水製薬社製） 、 GIT培地 （日本製 薬社製） 、 EX- CELL302 培地 （JRH 社製） 、 IMDM 培地 （GIBCO BRL 社製） 、 Hybridoma - SFM培地 （GIBCO BRL社製） 、 またはこれら培地に牛胎児血清 （以下、 FBS と表記する） 等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。 得ら れた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積さ せることができる。 培養上清中のヒト化抗体の生産量および抗原結合活性は酵素 免疫抗体法 [以下、 ELISA 法と表記する ；アンティボディズ，' Chapter 14、 モノ クローナル ·アンティボディズ] 等により測定できる。 また、 形質転換株は、 特 開平 2-257891 に開示されている方法に従い、 DHFR遺伝子増幅系等を利用してヒ ト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、 形質転換株の培養上清よりプロテイン A カラムを用いて精製す ることができる [アンティポディズ Chapter 8、 モノクローナル 'アンティボディ ズ] 。 また、 その他に通常、 タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用する ことができる。 例えば、 ゲル濾過、 ィオン交換ク口マトグラフィ一および限外濾 過等を組み合わせて行い、 精製することができる。 精製したヒト化抗体の H鎖、 L 鎖或いは抗体分子全体の分子量は、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 [以下、 SDS - PAGE と表記する ；ネイチヤー（Nature) , 227, 680 (1970) ] やウェスタンブ ロッテイング法 [アンティボディズ：ァ'ラボラトリ^ マニュアル， Chapter 12、 モノクローナル.アンティボディズ] 等で測定することができる。
B. Fc融合蛋白質の製造
(1) Fc融合蛋白質発現用ベクターの構築
Fc融合蛋白質発現用ベクターとは、 ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質と をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、 動物細胞用 発現ベクターにヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子をク ローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体の Fc領域としては、 CH2と CH3領域を含む領域のほか、 ヒンジ領域、 CH1 の一部が含まれるものも包含される。 また CH2または CH3 の少なくとも 1つ のアミノ酸が欠失、 置換、 付加または揷入され、 実質的に Fe y受容体への結合活 性を有するものであればいかなるものでもよい。
ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子としてはェキソン とイントロンから成る染色体 DNAを用いることができ、 また、 cDNAを用いること もできる。 それら遺伝子と Fc領域を連結する方法としては、 各遺伝子配列を鏡型 として、 PCR法 (レキユラ一'クローニング第 2版；カレント 'プロトコールズ 'ィ ン 'モレキュラ^ バイオロジー， Supplement 1-34) を行うことがあげられる。 動物細胞用発現べクタ一としては、 ヒト抗体の C領域をコードする遺伝子を組 込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 PAGE107 [サイトテクノロジー (Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ]、 pAGE103 [ジ ヤーナル . ォブ 'バイオケミス トリー （J. Biochem. ) , 101, 1307 (1987) ]、 PHSG274 [ジーン (Gene) , 27, 223 (1984) ]、 pKCR [プロシーディンダス ·ォブ · ザ .ナショナノレ ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 78, 1527 (1981) ] 、 pSGl j3 d2_4 [ サ イ ト テ ク ノ ロ ジー (Cytotechnology) , 4, 173 (1990) ] 等があげられる。 動物細胞用発現ベクターに 用いるプロモーターとェンハンサ一としては、 SV40 の初期プロモーターとェンハ ンサー [ジャーナル 'ォブ 'パイオケミス トリー （J. Biochem. ) , 101, 1307 (1987) ]、 モロ-一マウス白血病ウィルスの LTR レ ィォケミカル 'アンド ·バイ オフイジ力ノレ ' リサーチ ' コミュニケーショ ンズ (Biochem. Biophys. Res. Commun. ) , 149, 960 (1987) ]、 免疫グロブリン H鎖のプロモーター [セル （Cell) , 41, 479 (1985) ] とェンハンサー [セル （Cell) , 33, 717 (1983) ] 等があげられ る。
(2) ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする DNAの取得
ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする DNAは以下のようにして 取得することができる。
目的の Fc と融合させる蛋白質を発現している細胞や組織より mRNAを抽出し、 cDNA を合成する。 合成した cDNA をファージ或いはプラスミド等のベクターにク ローニングして cDNAライブラリーを作製する。 該ライブラリーより、 目的の蛋白 質の遺伝子配列部分をプローブとして用い、 目的の蛋白質をコードする cDNAを有 する糸且換えファージ或いは組換えプラスミドを単離する。 組換えファージ或いは 組換えプラスミ ド上の目的の蛋白質の全塩基配列を決定し、 塩基配列より全アミ ノ酸配列を推定する。
ヒ ト以外の動物としては、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ゥサギ等、 細胞や組 織を摘出することが可能であれば、 いかなるものも用いることができる。
細胞や組織から全 RNAを調製する方法としては、 チォシアン酸グァニジン-トリ フルォロ酢酸セシウム法 [メ ソッズ 'イン 'ェンザィモロジ一（Methods in Enzymol. ) , 154, 3 (1987) ] 、 また全 RNAから mRNAを調製する方法としては、 ォ リゴ（dT)固定ィヒセルロースカラム法 （モレキュラー 'クローニング第 2版） 等があ げられる。 また、 細胞や組織から mRNA を調製するキットとしては、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen 社製)、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharraac i a社製） 等があげられる。
cDNAの合成及ぴ cDNAライブラリ一作製法としては、 常法 （モレキュラー 'クロ 一二ング第 2版；カレント 'プロ トコールズ 'ィン 'モレキュラー 'バイオロジー， Supplement 1-34) , 或いは市販のキッ ト、 例えば、 Super Script™ Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL社製） や ZAP- cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製） を用いる方法などがあげられる。
cDNA ライブラリーの作製の際、 細胞や組織から抽出した mRNA を铸型として合 成した cDNAを組み込むベクターは、 該 cDNAを組み込めるベクターであればいか なるものでも用いることができる。 例えば、 ZAP Express [ストラテジーズ (Strategies) , 5, 58 (1992) ] 、 pBluescript II SK (+) [ヌクレイック ·ァシッ ズ . リ サーチ （Nucleic Acids Research) , 17, 9494 (1989) ] 、 λ zapll (Stratagene社製）、 L gtlO、 L gtll [ディーェヌエー ·クローニング：ァ 'プラ クティカノレ ·アプローチ (DNA Cloning: A Practical Approach) , I, 49 (1985) ]、 Lambda BlueMid (Clontech社製）、 ； L ExCell、 pT7T3 18U (Pharmacia社製）、 cD2 [モレキュラー 'アンド 'セルラー 'バイオロジー（Mol. Cell. Biol. ) , 3, 280 (1983) ] 及ぴ pUC18 [ジーン（Gene) , 33. 103 (1985) ] 等が用いられる。
ファージ或いはプラスミ ドベクターにより構築される cDNAライブラリーを導入 する大腸菌としては該 cDNAライブラリーを導入、 発現及び維持できるものであれ ばいかなるものでも用いることができる。 例えば、 XLl-Blue MRF， [ストラテジー ズ （Strategies) , 5, 81 (1992) ] 、 C600 [ジェネティックス （Genetics) , 39, 440 (1954) ] 、 Y1088、 Y1090 [サイエンス （Science) , 222, 778 (1983) ] 、 匪 522 [ジャーナル.ォブ .モレキュラー♦バイオロジー （J. Mol. Biol. ) , 166, 1 (1983) ] 、 K802 [ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー (J. Mol. Biol. ) , 16, 118 (1966) ] 及び JM105 [ジーン (Gene) , 38, 275 (1985) ] 等が用 いられる。
cDNA ライブラリーからの目的の蛋白質をコードする cDNA クローンの選択法と しては、 アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー ·ハイプリ ダイゼーシヨン法或いはプラーク 'ハイプリダイゼーシヨン法 （モレキユラ一'ク ローニング第 2 版） により選択することができる。 また、 プライマーを調製し、 raRNAから合成した cDNA或いは cDNAライブラリーを铸型として、 PCR法により目 的の蛋白質をコードする cDNAを調製することもできる。
目的の蛋白質をヒ ト抗体の Fc領域と融合させる方法としては、 PCR法があげら れる。 例えば、 目的の蛋白質の遺伝子配列の 5' 側と 3' 側に任意の合成オリゴ DNA (プライマー）を設定し、 PCR法を行い PCR産物を取得する。 同様に、 融合させ るヒト抗体の Fc領域の遺伝子配列に対しても任意のプライマーを設定し、 PCR産 物を得る。 このとき、 融合させる蛋白質の PCR産物の 3' 側と Fc領域の PCR産物 の 5' 側には同じ制限酵素部位もしくは同じ遺伝子配列が存在するようにプライ マーを設定する。 この連結部分周辺のアミノ酸改変が必要である場合には、 その 変異を導入したプライマーを用いることで変異を導入する。 得られた., 2 種類の PCR 断片を用いてさらに PCR を行うことで、 両遺伝子を連結する。 もしくは、 同 一の制限酵素処理をした後にライゲーシヨンすることでも連結することができる。 上記方法により連結された遺伝子配列を、 適当な制限酵素などで切断後、 pBluescript SK (-) (Stratagene社製） 等のプラスミ ドにクローニングし、 通常 用いられる塩基配列解析方法、 例えばサンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プ 口シーディングス ·ォブ 'ザ'ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 74, 5463 (1977) ] あるいは ABI PRISM 377DNA シー タエンサー （PE Biosystems社製） 等の塩基配列分析装置を用いて分析すること により、 該 DNAの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列から Fc融合蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、 目的のァミノ 酸配列と比較することにより、 取得した cDNAが分泌シグナル配列を含む Fc融合 蛋白質の完全なァミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
(3) Fc融合蛋白質の安定的生産
前記の （1) 項に記載の Fc融合蛋白質発現べクタ一を適当な動物細胞に導入す ることにより Fc融合蛋白質を安定に生産する形質転換株を得ることができる。 動物細胞への Fc融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、 エレクト口ポレー シヨン法 [特開平 2-257891 ; サイ トテクノロジー （Cytotechnology)， 3, 133 (1990) ] 等があげられる。
Fc融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、 Fc融合蛋白質を生産 させることができる動物細胞であれば、 いかなる細胞でも用いることができる。 具体的には、 マウスミエローマ細胞である NS0細胞、 SP2/0細胞、 チヤィニー ズハムスター卵巣細胞 CHO/dhfr-細胞、 CH0/DG44細胞、 ラットミエローマ YB2/0 細胞、 IR983F細胞、 シリアンハムスター腎臓由来である BHK細胞、 ヒトミエロー マ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、 好ましくは、 チャイニーズハム スタ一卵巣細胞である CH0/DG44細胞、 ラットミエローマ YB2/0細胞、 前記 1項に 記載の本発明の方法に用いられる宿主細胞等があげられる。
Fc融合蛋白質発現ベクターの導入後、 Fc S虫合蛋白質を安定に生産する形質転換 株は、 特開平 2-257891 に開示されている方法に従い、 G418等の薬剤を含む動物 細胞培養用培地により選択できる。 動物細胞培養用培地としては、 RPMI1640培地 (日水製薬社製）、 GIT培地 （日本製薬社製）、 EX-CELL302培地 （JRH社製）、 IMDM 培地 （GIBCO BRL社製）、 Hybridoma - SFM培地 （GIBCO BRL社製）、 またはこれら培 地に牛胎児血清等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。 得られ た形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に Fc融合蛋白質を生産蓄積さ せることができる。 培養上清中の Fc 融合蛋白質の生産量及び抗原結合活性は ELISA法等により測定できる。 また、 形質転換株は、 特開平 2- 257891に開示され ている方法に従い、 dhfr遺伝子増幅系等を利用して Fc融合蛋白質の生産量を上 昇させることができる。
Fc融合蛋白質は、 形質転換株の培養上清よりプロテイン Aカラムやプロティン Gカラムを用いて精製することができる （アンチボディズ， Chapter 8、 モノクロ 一ナル'アンティボディズ)。 また、 その他に通常、 タンパク質の精製で用いられ る精製方法を使用することができる。 例えば、 ゲル濾過、 イオン交換クロマトグ ラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、 精製することができる。 精製した Fc 融合蛋白質分子全体の分子量は、 SDS- PAGE [ネイチヤー （Nature) , 227, 680 (1970) ] やウェスタンブロッティング法 (アンチボディズ， Chapter 12、 モノク ローナル 'アンティボディズ） 等で測定することができる。 以上、 動物細胞を宿主とした抗体の製造方法を示したが、 上述したように、 酵 母、 昆虫細胞、 植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても製造するこ とができる。
既に、 抗体分子を発現する能力を有している細胞の場合には、 上記 1. に記載 の方法を用いて抗体生産細胞を調製した後に、 該細胞を培養し、 該培養物から目 的とする抗体組成物を精製することにより、 抗体組成物を製造することができる
4. 抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、 抗原との結合性あるいはエフェクタ一機能を測 定する方法としては、 モノクローナル ·アンチボディズ、 あるいはアンチボデ ィ ·エンジニアリング等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、 抗体組成物がヒト化抗体の場合、 抗原との結合活性、 抗原陽性培養細胞株に対する結合活性は ELISA法およぴ蛍光抗体法 [キャンサー' ィムノ 口ジー 'ィムノセラ ピー (Cancer Immunol. Iramunother. ) , 36, 373
(1993) ] 等により測定できる。 抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、 補 体依存性細胞障害活性 （以下、 CDC活性と表記する） 、 ADCC活性等を測定するこ とにより、 評価することができる [キャンサー'ィムノロジー ·ィムノセラピー
(Cancer Immunol. Iramunother. ) , 36, 373 (1993) ]。 また、 抗体組成物のヒトでの安全性、 治療効果は、 力-クイザル等のヒ トに比 較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
5. 抗体組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、 通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解 析に準じて行うことができる。 例えば、 IgG分子に結合している糖鎖はガラクト ース、 マンノース、 フコースなどの中性糖、 N-ァセチルダルコサミンなどのアミ ノ糖、 シアル酸などの酸性糖から構成されており、 糖組成分析およぴ二次元糖鎖 マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
(1) 中性糖 'ァミノ糖組成分析
抗体分子の糖鎖の組成分析は、 トリフルォロ酢酸等で、 糖鎖の酸加水分解を行 うことにより、 中性糖またはアミノ糖を遊離し、 その組成比を分析することがで きる。
具体的な方法として、 Dionex社製糖組成分析装置 （BioLC) を用いる方法が挙 げ り れ る 。 BioLC は HPAEC-PAD ( high performance anioN - exchange chromatography— pulsed amperometric detection) 法 [ンャ 1 ~ナノレ ·ォブ · リキ ッド ' クロマトグラフィー （J. Liq. Chromatogr. ) ， 6， 1577 (1983) ] によって糖 組成を分析する装置である。
また、 2 -ァミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができ る。 具体的には、 公知の方法 [ァグリカルチュラル ·アンド ·バイオロジカル · ケミストリー (Agruc. Biol. Chem. )， 55 (1)， 283-284 (1991) ] に従つて酸加水分解 した試料を 2 -ァミノピリジル化で蛍光ラベル化し、 HPLC分析して組成比を算出す ることができる。
(2) 糖鎖構造解析
抗体分子の糖鎖の構造解析は、 2 次元糖鎖マップ法 [アナリティカル ·バイオ ケミストリー (Anal. Biochem. ) ， 171, 73 (1988)、 生物化学実験法 23—糖蛋白質 糖鎖研究法 （学会出版センター） 高橋禮子編 （1989年） ] により行うことができ る。 2次元糖鎖マップ法は、 例えば、 X軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持 時間または溶出位置を、 Y軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間 W または溶出位置を、 それぞれプロットし、 既知糖鎖のそれらの結果と比較するこ とにより、 糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、 抗体をヒドラジン分解して、 抗体から糖鎖を遊離し、 2 -アミノピ リジン （以下、 PA と略記する） による糠鎖の蛍光標識 [ジャーナル'ォプ 'パイ オケミストリー （J. Biochem. ) , 95， 197 (1984) ] を行った後、 ゲルろ過により 糖鎖を過剰の PA化試薬などと分離し、 逆相クロマトグラフィーを行う。 次いで、 分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。 これらの結果 をもとに、 2次元糖鎖マップ上にプロットし、 糖鎖スタンダード （TaKaRa社製） 、 文献 [アナリティカル 'バイオケミス トリー （Anal. Biochem. ) ， 171, 73 (1988) ] とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖の MALDI-T0F - MSなどの質量分析を行い、 2次元糖鎖マップ法によ り推定される構造を確認することができる。
6. 本発明により得られる抗体組成物の利用
本発明により得られる抗体組成物は高い ADCC活性を有する。 高い ADCC活性を 有する抗体は、 癌、 炎症疾患、 自己免疫疾患、 アレルギーなどの免疫疾患、 循環 器疾患、 またはウィルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防およぴ 治療において有用である。
癌、 すなわち悪性腫瘍では癌細胞が増殖している。 通常の抗癌剤は癌細胞の増 殖を抑制することを特徴とする。 し力 し、 高い ADCC活性を有する抗体は、 殺細胞 効果により癌細胞を障害することにより癌を治療することができるため、 通常の 抗癌剤よりも治療薬として有効である。 特に癌の治療薬において、 現状では抗体 医薬単独の抗腫瘍効果は不充分な場合が多く化学療法との併用療法が行われてい るが [サイエンス（Science) , 280, 1197, 1998] 、 本発明により得られる抗体組 成物単独でのより強い抗腫瘍効果が認められれば、 化学療法に対する依存度が低 くなり、 副作用の低減にもつながる。
炎症疾患、 自己免疫疾患、 アレルギーなどの免疫疾患において、 それら疾患に おける生体内反応は、 免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起される ため、 高い ADCC活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することにより、 ァレ ルギー反応を抑えることができる。
循環器疾患としては、 動脈硬化などがあげられる。 動脈硬化は、 現在バルーン カテーテルによる治療を行うが、 治療後の再狭窄での動脈細胞の増殖を高い ADCC 活性を有する抗体を用いて抑えることより、 循環器疾患を予防および治療するこ とができる。
ウィルスまたは細菌に感染した細胞の増殖を、 高い ADCC活性を有する抗体を用 いて抑えることにより、 ウィルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患を予防 およぴ治療することができる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体、 アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識 する抗体、 循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、 自己免疫疾患に関連する 抗原を認識する抗体、 またはウィルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識す る抗体の具体例を以下に述べる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、 抗 GD2 抗体 （Anticancer Res. , 13， 331-336, 1993) 、 抗 GD3 抗体 (Cancer Immunol. Imraunother. , 36, 260-266， 1993) 、 抗 G M2 抗体 （Cancer Res.， 54， 1511-1516， 1994) 、 抗 HER2 抗体
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289， 1992) 、 抗 CD52抗体 （Nature, 332, 323-327, 1988) 、 抗 MAGE抗体 （British J. Cancer, 83, 493-497， 2000) 、 抗 HM1. 24抗体 (Molecular Immunol. , 36， 387-395, 1999) 、 抗副甲状腺ホル モン関連蛋白 （PTHrP) 抗体 (Cancer, 88, 2909 - 2911， 2000) 、 抗 FGF8 抗体
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9911-9915, 1989) 抗塩基性繊維芽細胞増殖 因子抗体、 抗 FGF8受容体抗体 (J. Biol. Chem.， 265, 16455-16463, 1990) 、 抗 塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、 抗インスリン様増殖因子抗体 （J. Neurosci. Res. , 40, 647-659， 1995) 、 抗ィンスリン様増殖因子受容体抗体 (J. Neurosci. Res.， 40, 647-659, 1995) 、 抗 PMSA抗体 （J. Urology, 160， 2396- 2401, 1998) 、 抗血管内皮細胞増殖因子抗体 （Cancer Res.， 57, 4593-4599， 1997) 、 抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体 (Oncogene, 19, 2138-2146， 2000) 、 抗 CA125抗体、 抗 17- 1A抗体、 抗インテグリン o; v j3 3抗体、 抗 CD33抗体、 抗 CD22抗体、 抗 HLA抗体、 抗 HLA- DR抗体、 抗 CD20抗体、 抗 CD19抗体、 抗 EGF受 容体抗体 （Immunology Today、 21 (8)、 403-410 ( 2000 ) ) 抗 CD10 抗体
(American Journal of Clinical Pathology, 113, 374-382, 2000)などがあげら れる。
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗インター ロイキン 6抗体 (Immunol. Rev. , 127, 5 - 24， 1992) 、 抗インタ二ロイキン 6受 容体抗体 （Molecular Immunol. , 31， 371-381， 1994) 、 抗インターロイキン 5抗 体 （Immunol. Rev. , 127, 5-24， 1992) 、 抗インターロイキン 5受容体抗体、 抗 インターロイキン 4抗体 （Cytokine, 3, 562-567， 1991) 、 抗インターロイキン 4 受容体抗体 （J. Immunol. Meth. , 217， 41-50, 1998) 、 抗腫瘍壊死因子抗体 (Hybridoma, 13, 183 - 190， 1994) 、 抗腫瘍壌死因子受容体抗体 （Molecular Pharmacol. , 58, 237-245, 2000 ) 、 抗 CCR4 抗体 ( Nature, 400， 776 - 780，
1999) 、 抗ケモカイン抗体 （J. Immunol. Meth. , 174, 249-257, 1994) 、 抗ケモ 力イン受容体抗体 （J. Exp. Med. , 186， 1373-1381, 1997) 、 抗 IgE 抗体、 抗 CD23 抗体、 抗 CDlla 抗体 (Immunology Today、 21 (8)、 403-410 (2000) )、 抗 CRTH2抗体 (J Immunol. , 162, 1278-1286 (1999) )、 抗 CCR8抗体 （W099/25734)、 抗 CCR3抗体 (US6207155) などがあげられる。
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗 GpIIb/IIIa抗体 （J. Immunol. , 152, 2968-2976, 1994) 、 抗血小板由来増殖因子抗体 （Science, 253, 1129-1132， 1991) 、 抗血小板由来増殖因子受容体抗体 (J. Biol. Chem. , 272, 17400-17404, 1997) または抗血液凝固因子抗体 （Circulation, 101, 1158-1164,
2000) などが挙げられる。
自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗自己 DNA 抗体
(Immunol. Letters, 72, 61-68， 2000) などが挙げられる。
ウィルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗 g p l20 抗体 (Structure, 8， 385—395, 2000) 、 抗 CD4 抗体 (J. Rheumatology, 25, 2065-2076, 1998) 、 抗 CCR4抗体、 抗ベロ毒素抗体 (J. Clin. Microbiol. , 37， 396-399, 1999) 、 自己免疫疾患 （乾癬、 関節リウマチ、 クローン病、 潰瘍性大腸 炎、 全身性エリテマトーデス、 多発性硬化症など）、 抗 CDlla抗体、 抗 ICAM3抗体、 抗 CD80抗体、 抗 CD2抗体、 抗 CD3抗体、 抗 CD4抗体、 抗インテグリン α 4 ]3 7抗 体、 抗 CD40L 抗体、 抗 IL- 2 受容体抗体 （Immunology Today, 21 (8)、 403-410
(2000) ) などが挙げられる。
上記抗体は、 A T C C (The American Type Culture Collection) 、 理化学研 究所細胞開発銀行、 工業技術院生命工業技術研究所等の公的な機関、 あるいは大 日本製薬株式会社、 R&D SYSTEMS社、 PharMingen社、 コスモバイオ社、 フナコシ 株式会社等の民間試薬販売会社から入手することができる。
本発明により得られる抗体組成物を含有する医薬は、 治療薬として単独で投与 することも可能ではあるが、 通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上 の担体と一緒に混合し、 製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法によ り製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。 投与経路は、 治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口投 与、 または口腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内および静脈内等の非経口投与 をあげることができ、 抗体製剤の場合、 望ましくは静脈内投与をあげることがで さる。
投与形態としては、 噴霧剤、 カプセル剤、 錠剤、 顆粒剤、 シロップ剤、 乳剤、 座剤、 注射剤、 軟膏、 テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果 糖等の糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコール等のグリコール類、 ごま油、 ォリーブ油、 大豆油等の油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル類等の 防腐剤、 ストロベリーフレーバー、 ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤と して用いて製造できる。
カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等は、 乳糖、 プドウ糖、 ショ糖、 マンュトー ル等の賦形剤、 デンプン、 アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、 ステアリン酸マグ ネシゥム、 タルク等の滑沢剤、 ポリビュルアルコール、 ヒ ドロキシプロピルセル ロース、 ゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の界面活性剤、 グリセリン等の 可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。
注射剤は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液、 あるいは両者の混合物からなる担体等を用 いて調製される。 または、 抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、 これに塩化ナ トリゥムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤は力力ォ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、 噴霧剤は該抗体組成物そのもの、 ないしは受容者の口腔および気道粘膜 を刺激せず、 かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる 担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、 グリセリン等が例示される。 該抗体組成物および 用いる担体の性質により、 エアロゾル、 ドライパウダー等の製剤が可能である。 また、 これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加す ることもできる。
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年齢、 体重等により異なるが、 通常成人 1日当たり 10 /i g/kg〜20mg/kgである。 また、 抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、 イン ビトロ実験としては、 CDC活性測定法、 ADCC活性測定法等があげられ、 インビポ 実験としては、 マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられ る。
CDC活性、 ADCC活性、 抗腫瘍実験は、 文献 [キャンサー ·ィムノロジー .ィム ノセラピー（Cancer Immunology Immunotherapy) , 36， 373 (1993) ；キャンサー - リサーチ（Cancer Research) , 54, 1511 (1994) ] 等記載の方法に従って行うこと ができる。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、 実施例は本発明の単な る例示を示すものにすぎず、 本発明の範囲を限定するものではない。 図面の簡単な説明
第 1図は、 ラットミエローマ YB2/0細胞 KM2760#58- 35- 16株おょぴ 1-15株が生 産する抗 CCR4キメラ抗体の CCR4/EL- 4細胞に対する ADCC活性を示した図である。 縦軸に細胞障害活性、 横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。 口が KM2760#58-35- 16株 生産抗 CCR4キメラ抗体 KM2760- 1、 △が抗 CCR4キメラ抗体 1 - 15株生産 KM2760-2 の活性をそれぞれ示す。
第 2図は、 mfFUT8 - 6、 pAGE249導入株によって生産した抗 CCR4キメラ抗体から 調製した PA化糖鎖を、 それぞれ逆相 HPLCで分析して得た溶離図を示したもので ある。 第 2A図に mfFUT8-6株によって生産した抗体から調製した PA化糖鎖、 第 2B図に PAGE249導入株によって生産した抗体から調製した PA化糖鎖の溶離図を それぞれ示す。 縦軸に相対蛍光強度、 横軸に溶出時間をそれぞれ示す。
第 3図は、 RT-PCR法を用いた各宿主細胞株における FUT8および ァクチン転 写産物量の定量結果を示した写真である。 ΚΜ2760- 1 生産株である ΚΜ2760#58-35- 16株、 ΚΜ2760- 2 生産株である 1 - 15 株、 および親株であるラットミエローマ ΥΒ2/0細胞から調製した cDNAを鎵型とし、 FU8特異的プライマーセット （配列番 号 13 および 14) あるいは ]3 -ァクチン特異的プライマー （配列番号 11 および 12) を用いて PCR反応を行い、 該反応液をァガロースゲル電気泳動に供した結果 を示す。
第 4図は、 プラスミド ploxPPuroの構築を示した図である。
第 5図は、 プラスミド PK0FUT8gE2- 1の構築を示した図である。
第 6図は、 プラスミド pK0FUT8gE2-2の構築を示した図である。 第 7図は、 プラスミド pscFUT8gE2- 3の構築を示した図である。
第 8図は、 プラスミド pK0FUT8gE2-3の構築を示した図である。
第 9図は、 プラスミド pK0FUT8gE2-4の構築を示した図である。
第 10図は、 プラスミド pK0FUT8gE2_5の構築を示した図である。
第 11図は、 プラスミド pK0FUT8Puroの構築を示した図である。
第 12 図は、 ひ 1， 6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子破壌 CH0細胞株である
1st. AFUT8 2-46-1株および 1st. AFUT8 2-46株のゲノムサザン解析結果を示し た写真である。
第 13図は、 α 1， 6-フコシルトランスフェラーゼ（FUT8) 遺伝子破壊 CH0細胞株 である lst. AFUT8 2-46株おょぴ 2-46-H10株のゲノムサザン解析結果を示した図 である。
第 14図は、 FUT8対立遺伝子破壌株より精製した抗 CCR4キメラ抗体の ADCC活 性を示した写真である。 縦軸に細胞障害活性、 横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。 ▲、 醒はそれぞれ、 抗 CCR4キメラ抗体生産 CH0細胞 5-03株由来の精製抗体、 お よび 1st. AFUT8 2-46-1株由来の精製抗体の活性をそれぞれ示す。
第 15図は、 プラスミド PK0FUT8Neoの構築を示した図である。
第 16図は、 CH0/DG44細胞の FUT8対立遺伝子を 1コピー破壊したクローンのゲ ノムサザン解析結果を示した写真である。
第 17図は、 CH0/DG44細胞の FUT8両対立遺伝子を破壊したクローンのゲノムサ ザン解析結果を示した写真である。
第 18図は、 CH0/DG44細胞の FUT8両対立遺伝子より薬剤耐性遺伝子を除去した クローンのゲノムサザン解析結果を示した写真である。
第 19図は、 プラスミド pBs-2B8Lの構築を示した図である。
第 20図は、 プラスミド pBs- 2B8Hおよびプラスミド pBs_2B8Hmの構築を示した 図である。
第 21図は、 プラスミド pKANTEX2B8Pの構築を示した図である。
第 22図は、 CH0/DG44細胞由来 FUT8遺伝子ダブルノックァゥト株より精製した 抗 CD20キメラ抗体のヒト Bリンパ球培養細胞株 Rajiに対する ADCC活性を示した 図である。 縦軸に細胞障害活性、 横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。
第 23図は、 プラスミド CHfFUT8- pCR2. 1の構築を示した図である。 発明を実施するための最良の形態
実施例 1. 抗 CCR4キメラ抗体の安定生産細胞の作製
W001/64754記載の抗 CCR4キメラ抗体のタンデム型発現ベクター pKANTEX2160を 用いて抗 CCR4キメラ抗体の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
(1) ラットミエローマ YB2/0細胞を用いた生産細胞の作製
10 μ gの抗 CCR4キメラ抗体発現べクター pKANTEX2160を 4 X 106細胞のラットミ エローマ YB2/0細胞 （ATCC CRL1662) へエレク トロポレーシヨン法 [サイ トテク ノロジー (Cytotechnology) , 3， 133 (1990) ] により導入後、 40mLの Hybridoma- SFM- FBS (5) [FBS (PAAラボラトリーズ社製） を 5%含む Hybridoma- SFM培地 （ィ ンビトロジヱン社製) ] に懸濁し、 96 ゥヱル培養用プレート （住友ベークライト 社製） に 200 !7ゥヱルずつ分注した。 5%C02インキュベーター内で 37°C、 24時 間培養した後、 G418を lmg/mLになるように添加して 1〜2週間培養した。 G418耐 性を示す形質転換株のコロニーが出現し、 増殖の認められたゥヱルより培養上清 を回収し、 上清中の抗 CCR4 キメラ抗体の抗原結合活性を実施例 2 (2) 項記載の ELISA法により測定した。
培養上清中に抗 CCR4キメラ抗体の生産が認められたゥエルの形質転換株につい ては、 DHFR遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、 G418 を lmg/mL、 DHFR の阻害剤である MTX (SIGMA社製） を δΟηΜ含む Hybridoma- SFM- FBS (5) 培地に 1〜2 X 105細胞/ ml になるように懸濁し、 24 ゥ： nルプレート (Greiner社製）に 1mlずつ分注した。 5%C02ィンキュベータ一内で 37°Cで 1〜2週 間培養して、 50nM MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。 形質転換株の増殖が認 められたゥエルの培養上清中の抗 CCR4 キメラ抗体の抗原結合活性を実施例 2 (2) 項記載の ELISA法により測定した。
培養上清中に抗 CCR4キメラ抗体の生産が認められたゥヱルの形質転換株につい ては、 上記と同様の方法により、 MTX濃度を上昇させ、 最終的に MTXを 200nMの 濃度で含む Hybridoma_SFM-FBS (5) 培地で増殖可能かつ、 抗 CCR4キメラ抗体を高 生産する形質転換株を得た。 得られた形質転換株について、 2 回の限界希釈法に よる単一細胞化 （クローン化） を行い、 得られたクローン化株を 腿 2760#58- 3δ - 16と名付けた。 尚、 W000/61739記載の a l，6 -フコシルトランスフェラーゼ （以下、
「FUT8」 と表記する） の遺伝子の転写物の定量法を用い、 該転写物が比較的低い 株を優良株として選択し用いた。 (2) CH0/DG44細胞を用いた生産細胞の作製
抗 CCR4 キメラ抗体発現ベクター pKANTEX2160 の 4 / g を 1. 6 X 106細胞の CH0/DG44 細胞 [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555 (1986) ]へエレ クトロポレーシヨン法 [サイトテクノロジー （Cytotechnology)， 3, 133 (1990) ] により導入後、 10ml の IMDM- dFBS (10) _HT (l) [dFBS (インビトロジェン社製） を 10%、 HT supplement (インビトロジェン社製） を 1倍濃度で含む IMDM培地 （ィ ンビトロジヱン社製) ] に懸濁し、 96 ゥヱル培養用プレート （岩城硝子社製） に 100 1/ゥエルずつ分注した。 5%C02インキュベーター内で 37°C、 24時間培養し た後、 IMDM- dFBS (10) (透析 FBSを 10%で含む IMDM培地） に培地交換し、 1〜2週 間培養した。 HT非依存的な増殖を示す形質転換株のコロニーが出現したため、 増 殖の認められたゥエルより培養上清を回収し、 上清中の抗 CCR4キメラ抗体の発現 量を実施例 2 (2) 記載の ELISA法により測定した。
培養上清中に抗 CCR4キメラ抗体の生産が認められたゥエルの形質転換株につい ては、 DHFR遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、 MTXを 50nM 含む IMDM- dFBS (10) 培地に 1〜2 X 105細胞/ mlになるように懸濁し、 24 ゥエルプ レート （岩城硝子社製） に 0. 5ml ずつ分注した。 5%C02インキュベーター内で 37°Cで 1〜2週間培養して、 50nM MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。 増殖が 認められたゥエルの形質転換株については、 上記と同様の方法により、 MTX濃度 を 200nMに上昇させ、 最終的に MTXを 200nMの濃度で含む IMDM- dFBS (10) 培地で 増殖可能かつ、 抗 CCR4キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。 得られた形質 転換株は 5 - 03株と名付けた。 実施例 2. FUT8遺伝子の発現が低下した抗体生産細胞が生産する抗体組成物と 親株細胞が生産する抗体組成物との比較
a 1， 6-フコース修飾酵素の活性が親株細胞より低下した抗体生産細胞が生産す る抗体組成物と、 親株細胞が生産する抗体組成物との ADCC活性の比較を行った。
(1) 抗体組成物の調製
1， 6-フコース修飾酵素の活性が親株より低下した抗体生産細胞が生産する抗 体組成物としては、 実施例 1 の（1)記載の FUT8 遺伝子の転写物量が低い KM2760#58-35- 16株の培養上清より精製した抗体組成物 KM2760-1を用いた。 親株細胞であるラットミエローマ YB2/0細胞 （ATCC CRL1662)が生産する抗体組 成物は、 以下のようにして調製した。
lO ^i gの抗 CCR4キメラ抗体発現ベクター pKANTEX2l60 (W001/64754記載） を 4 X 106細胞のラットミエロ一マ YB2/0細胞 （ATCC CRL1662) へェレクト口ポレーシ ヨン法 [サイトテクノロジー （Cytotechnology)， 3， 133 (1990) ] により導入後、 40mL の Hybridoma- SFM - FBS (5) [FBS (PAA ラボラ トリーズ社製） を 5 %含む Hybridoma-SFM培地 （ィンビトロジェン社製） ] に懸濁し、 96ゥエル培養用プレー ト （住友べ一クライト社製） に 200 I L/ゥエルずつ分注した。 5%C02インキュべ 一ター内で 37° (：、 24時間培養した後、 G418を lmg/mLになるように添加して 1〜2 週間培養した。 G418耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、 増殖の認められ たゥヱルより培養上清を回収し、 上清中の抗 CCR4キメラ抗体の抗原結合活性を本 項 （2) 記載の ELISA法により測定した。
培養上清中に抗 CCR4キメラ抗体の生産が認められたゥエルの形質転換株につい ては、 DHFR遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、 G418 を lmg/mL、 DHFR の阻害剤である MTX (SIGMA社製） を 50nM含む Hybridoma- SFM - FBS (5) 培地に 1〜2 X 105細胞/ ml になるように懸濁し、 24 ゥエルプレート (Greiner社製）に 1mlずつ分注した。 5%C02ィンキュベータ一内で 37°Cで 1〜2週 間培養して、 50nM MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。 形質転換株の増殖が認 められたゥエルの培養上清中の抗 CCR4 キメラ抗体の抗原結合活性を本項 （2) 記 載の ELISA法により測定した。
培養上清中に抗 CCR4キメラ抗体の生産が認められたゥヱルの形質転換株につい ては、 上記と同様の方法により、 ΜΤΧ濃度を上昇させ、 最終的に ΜΤΧを 200ηΜの 濃度で含む Hybridoma- SFM-FBS (5) 培地で増殖可能かつ、 抗 CCR4キメラ抗体を高 生産する形質転換株を得た。 得られた形質転換株を 1 - 15株と名付けた。 尚、 1 - 15 株に関しては限界希釈法による単一細胞化 （クローン化） を行わなかった。
取得した形質転換株 1-15が生産する抗 CCR4キメラ抗体の精製は以下のように 行った。
抗 CCR4 キメラ抗体を発現する形質転換株 1-15 を 200nM MTX、 Daigo' s GF21 (和光純薬製） を 5%の濃度で含む Hybridoma-SFM (インビトロジヱン社製） 培地 に 2 X 105細胞/ ml となる様に懸濁し、 スピナ一ボトル （岩城硝子社製） を用いて 37°Cの恒温室内で Fed- Batch攪拌培養した。 8-10 日間培養して回収した培養上清 より、 Prosep_A (ミリポア社製） カラムおよびゲルろ過法を用いて、 抗 CCR4キメ ラ抗体を精製した。 精製した抗 CCR4キメラ抗体を KM2760-2と名づけた。
(2) 抗体組成物の抗原結合活性
本実施例 （1) で得られた 2種類の抗体組成物について抗原結合活性を以下に示 す ELISA法により測定した。
抗 CCR4キメラ抗体が反応し得るヒト CCR4細胞外領域べプチドとして化合物 1 (配列番号 6) を選択した。 ELISA法による活性測定に用いるため、 以下の方法で BSA (Bovine Serum Albumin) (ナカライテスク社製） とのコンジュゲートを作製 し、 抗原として用いた。 すなわち、 10 mg の BSA を含む PBS溶液 900 mL に、 100ml の 25mg/mL SMCC [4- (N -マレイミ ドメチル） シク口へキサン -1-カルボキシ リックァシッド N-ヒドロキシサクシンィミドエステル] (シグマ社製)- DMS0溶液 を撹拌しながら滴下し、 30 分間ゆつくりと攪拌した。 25 mL PBS で平衡化した NAP-10カラムなどのゲルろ過カラムに反応液 ImLをアプライし、 1. 5mLの PBSで 溶出させた溶出液を BSA - SMCC溶液とした （A28。測定から BSA濃度を算出）。 次に、 0. 5 mgの化合物 1に 250mL PBSを加え、 次いで 250mL DMFを加えて完全に溶解さ せた後、 前述の BSA- SMCC溶液 （BSA換算 1. 25mg) を撹拌しながら添加して 3時間 ゆっくり攪拌した。 反応液を PBSに対して 4°C、 一晚透析し、 最終濃度 0. 05%とな るようにアジ化ナトリウムを添加して、 0. 22 瞧フィルターでろ過した後 BSA -化 合物 1溶液とした。
96穴の EIA用プレート （グライナ一社製） に、 上述のように調製したコンジュ ゲートを 0. 05 Ai g/mL、 50 1/ゥヱルで分注し、 4°Cでー晚放置して吸着させた。 PBSで洗浄後、 1%BSA- PBSを lOO /z L/ゥエルで加え、 室温で 1時間反応させて残存 する活性基をブロックした。 各ゥヱルを 0. 05 %Tween20 を含む PBS (以下、 TweeN-PBS と表記する） で洗浄後、 形質転換株の培養上清を 50 L/ゥヱルで加え、 室温で 1 時間反応させた。 反応後、 各ゥエルを TweeN- PBS で洗浄後、 1%BSA- PBS で 6000 倍に希釈したペルォキシダーゼ標識ャギ抗ヒ ト IgG ( T/ ) 抗体溶液 (American Qualex社製） を二次抗体溶液として、 それぞれ 50 μ L/ゥヱルで加え、 室温で 1時間反応させた。 反応後、 Tween - PBSで洗浄後、 ABTS基質液を 50 μ ΐ ゥ ヱルで加えて発色させ、 20分後に 5%SDS溶液を 50 μ !7ゥヱル加えて反応を停止 した。 その後 415nmの吸光度を測定した。 その結果、 精製した KM2760-1および KM2760-2の CCR4部分べプチドに対する結 合活性を上記記載の ELISAにより測定した結果、 同等の結合活性を示した。
(3) 抗体組成物の ADCC活性
精製した KM2760- 1および KM2760-2の ADCC活性を以下の方法で測定した。
抗 CCR4キメラ抗体のヒト CCR4高発現細胞である CCR4/EL- 4細胞 （W001/64754) に対する ADCC活性は、 以下のようにして測定した。
(a) 標的細胞溶液の調製
W001/64754に記載のヒト CCR4を発現している CCR4/EL- 4細胞の 1. 5 X 106細胞 を調製し、 放射性物質である Na2 51Cr04を 5. 55MBq当量加えて 37°Cで 1時間 30分 間反応させ、 細胞を放射線標識した。 反応後、 培地を用いた懸濁および遠心分離 操作により 3回洗浄し、 培地に再懸濁し、 4°Cで 30分間氷中に放置して放射性物 質を自然解離させた。 遠心分離後、 培地を 15mLカロえ、 2 X 105細胞/ mLに調製し、 標的細胞溶液とした。
(b) ヒ トェフエクタ一細胞溶液の調製
健常人末梢血 60mLを採取し、 へパリンナトリゥム (清水製薬社製） を 0. 6mLを 加え穏やかに混ぜた。 これを Lymphoprep (AXIS SHIELD社製） を用いて使用説明 書に従い、 遠心分離 （800g、 20分間） して単核球層を分離した。 培地で 3回遠心 分離 （1400rpm、 5分間） して洗浄後、 培地を用いて 5 X 106細胞/ mLの濃度で再懸 濁し、 ヒ トエフヱクタ一細胞溶液とした。
(c) ADCC活性の測定
96 ゥヱル U字底プレート （Falcon社製） の各ゥヱルに上記 （1) で調製した標 的細胞溶液の 50 (1 X 104細胞/ゥエル） を分注した。 次いで上記 （2) で調製 したヒトエフェクター細胞溶液を 100 i L (5 X 105細胞/ゥエル、 ヒトェフエクタ 一細胞と標的細胞の比は 50 : 1 となる） 添加した。 さらに、 抗 CCR4キメラ抗体を 各最終濃度 0. 0001〜10 μ g/mLとなるように加え、 37°Cで 4時間反応させた。 反応 後、 プレートを遠心分離し、 上清中の51 Cr量を カウンタ一にて測定した。 自然 解離 51Cr量は、 ヒトエフェクター細胞溶液、 抗体溶液の代わりに培地のみを用い て上記と同様の操作を行い、 上清中の 51Cr量を測定することにより求めた。 全解 離 51Cr量は、 抗体溶液とヒトエフヱクタ一細胞溶液の代わりに lmol/Lの塩酸溶液 を添加し、 上記と同様の操作を行い、 上清中の 51Cr量を測定することにより求め た。 ADCC活性 (%) は下式 （I) により求めた。
(検体上清中の51 Cr量） 一 （自然遊離51 Cr量）
ADCC活性（％) = X 100 (I)
(全遊離51 Cr量） ― （自然遊離51 Cr量） 上記記載の方法により測定した結果、 KM2760- 1 と KM2760- 2 では有意に活性が 相違し、 KM2760-2の方が有意に低かった （第 1図） 。
(4) 抗体組成物の糖鎖解析
KM2760-1および KM2760- 2の糖鎖分析を以下の方法に従って行った。
KM2760-1 および KM2760-2 についてそれぞれヒドラジン分解を行い、 糖鎖を蛋 白質から切断した [メソッド 'ォブ ·ェンザィモロジ一 （Method of Enzymology) , 83， 263, 1982]。 減圧留去することによってヒドラジンを除去した後、 酢酸アン モユウム水溶液と無水酢酸加えて Ν-ァセチルイヒを行った。 凍結乾燥後、 2 -ァミノ ピリジンによる蛍光標識を行った [ジャーナル ·ォブ ·バイオケミストリー (J. Biochem. ) , 95, 197, 1984]。 蛍光標識した糖鎖群 （PA 化糖鎖群） を、 Surperdex Peptide HR 10/30 カラム （Pharmacia社製） を用いて過剰な試薬と分 離した。 糖鎖画分を遠心濃縮機にて乾固させ、 精製 PA化糖鎖群とした。 次に、 CLC-0DSカラム （Shimadzu社製） を用いて、 精製 PA化糖鎖群の逆相 HPLC分析を 行った （第 2図）。
緩衝液 Aとしてリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH3. 8) 、 緩衝液 Bとして 0. 5%1 -ブ タノールを含むリン酸ナトリウム緩衝液 （pH3. 8) を用い、 以下のグラジェントで 分析した。 時間 （分） 0 80 90 90. 1 120
緩衝液 B (%) 0 60 60 0 0 第 2図で示した（1)〜（8)のピークは、 それぞれ以下の構造を示す。 (1)
GlcNAcjSl-2 an«l
0 Man/81-4G1CNAC/8 l-4GlcNAc-PA
Glc Ac^l^ anffl7
(2)
Galj9 l-4GlcNAc β l-2Man al
Man 51一 4GlcNAc β 1一 4<3cNAc — PA
GlcNAc β 1 - 2Man
(3)
GlcNAc
Figure imgf000077_0001
ManjS l- GlcNA(¾g l-4GlcNAo-PA
Gal l-4GlcNAqg l-2Manof V
(4)
Gal β 1— 4GlcNAc β 1— 2Man L
\ Man β 1一 4C3cNAc β 1― 4<3cNAc — PA
Figure imgf000078_0001
(5)
GlcNAc β 1一 2Man a 1、 Fuc
V 6
¾ Man β 1一 43cNAc β 1一 GlcNAc - PA
GlcNAc β 1― 2 anノ
(6)
Gal β 1- 4C3cNAc β I一 2Man K Fuc a \
V 6 ,
¾ Man β 1― 4C3cNAc β 1一 4GlcNAc 一 PA
GlcNAc β 1一 2Man a l
(7)
GlcNAc β 1一 2Man 1 Fuc α
6
° Man β 1― 4G5。NAc β 1一 4 cNAc 一 PA
Oal β 1- cNAc β 1一 2Manノ
(8)
Gal β 1— 4GlcNAc β 1― 2 an of Fuc α
V 6
° Man β 1— 4GlcNAc β 1— 4GlcNAc—PA
Gal β 1— 4GlcNAc β 1— 2Man ofゾ 1
GlcNAc は N-ァセチルダルコサミン、 Gal はガラク トース、 Man はマンノース、 Fucはフコース、 PAはピリジルァミノ基を示す。
第 2図において、 eel,6-フコースを持たない糖鎖群の割合は、 （1)〜（8) のうち (1)〜（4)のピークが占める面積、 al，6-フコースが結合した糖鎖群の割合は、 （1) 〜（8)のうち （5)〜（8) のピークが占める面積から算出した。
ひ 1， 6-フコースを持たない糖鎖の割合に関して違いが観察され、 匿 760-2 の方 が有意に低かった。 (5) 抗体組成物を生産する細胞の FUT8遺伝子の発現量
親株細胞であるラッ トミエローマ YB2/0 細胞、 KM2760- 1 生産株である KM2760#58-35-16株、 および KM2760- 2生産株である 1-15株の FUT8および] 3 -ァ クチン遺伝子の転写物の量を、 W000/61739の実施例 8に記載の定量法にしたがつ て測定した結果を第 3図に示す。 1-15株の FUT8遺伝子の発現量は、 親株細胞で あるラットミエローマ YB2/0細胞と同等であつたが、 KM2760#58-35- 16株の発現 量はこれら株と比較して明らかに低かつた。
以上の結果より、 ct l， 6 -フコース修飾酵素の活性が親株細胞より低下した抗体 生産細胞は、 親株細胞が生産する抗体組成物より ADCC活性の高い抗体組成物を生 産することが可能であることが確認された。 実施例 3. FUT8遺伝子が破壊された CH0細胞の作製と該細胞を用いた抗体の生 産
CH0細胞 FUT8遺伝子のエタソン 2を含むゲノム領域を欠失した CH0細胞を作製 し、 該細胞が生産する抗体の ADCC活性を評価した。
1. チャイニーズハムスター FUT8遺伝子ェクソン 2 ターゲティングベクタープ ラスミ ド pK0FUT8Puroの構築
(1) プラスミ ド ploxPPuroの構築
以下の手順でプラスミド ploxPPuroを構築した （第 4図）。
プラスミド pKOSelectPuro (Lexicon社製） 1. 0 gを NEBuf f er 4 (New England Biolabs社製） 35 μ ΐ に溶解し、 20単位の制限酵素 ^I (New England Biolabs 社製） を加えて 37°Cで 2 時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8 % (w/v)ァガロースゲル電気泳動に供し、 ピューロマイシン耐' 1"生遺伝子発現ュニット を含む約 1. 5Kbの DNA断片を精製した。
一方、 特開平 11-314512に記載のプラスミド ploxP l. O w gを NEBuffer 4 (New England Biolabs社製） 35 μ 1 に溶解し、 20 単位の制限酵素 (New England Biolabs社製） を加えて 37°Cで 2 時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を
0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 2. 0Kbの DNA断片を精製した。 上記で得たプラスミド pKOSelectPuro由来の Ascl-Ascl断片 （約 1. 5Kb) 4. 5 μ
1、 プラスミド ploxP由来の Ascl-Ascl断片 （約 2. 0Kb) 0· 5 μ 1、 Ligation High (東洋紡社製） 5. 0 μ 1を混合し、 16°Cで 30分間反応させることにより結合反応を 行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換し、 得られたアンピシリン 耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミド DNA を単離した。 本プラス ミドを以下、 ploxPPuroと称す。
(2) プラスミ ド PK0FUT8gE2- 1の構築
参考例（2) で得たチャイニーズハムスター FUT8 のェクソン 2を含むゲノム領域 を有するプラスミ ド pFUT8fgE2- 2 を用いて、 以下の手順でプラスミ ド pK0FUT8gE2-lを構築した （第 5図）。
プラスミ ド pFUT8fgE2_2 2. O g を、 lOO g/ml BSA (New England Biolabs社 製） を含む NEBuffer 1 (New England Biolabs社製） 35 μ ΐ に溶解し、 制限酵素 Sacl (New England Biolabs社製） 20単位を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行つ た。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断片を回収した後、 lOO w g/ml BSA (New England Biolabs 社製） を含む NEBuffer 2 (New England Biolabs 社 製） 35 1に溶解し、 20単位の制限酵素 EcoRV (New England Biolabs社製） を加 えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロー スゲル電気泳動に供し、 約 1. 5Kbの DNA断片を精製した。
—方、 プラスミ ド LITMUS28 (New England Biolabs 社製） 1. 0 ^ g を、 100 g/ml BSA (New England Biolabs社製） を含む NEBuffer 1 (New England Biolabs 社製） 35 μ ΐに溶解し、 制限酵素 (New England Biolabs社製） 20単位を加 えて 37°Cで 2 時間消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA 断片を回収した後、 100 μ g/ml BSA (New England Biolabs 社製） を含む NEBuffer 2 (New England Biolabs 社製） 35 μ 1 に溶解し、 20 単位の制限酵素 EcoRV (New England Biolabs社製） を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消 化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 2. 8Kb の DNA 断片を精製した。
上記で得たプラスミド pFUT8fgE2- 2由来の EcoRV- Sacl断片 （約 1. 5Kb) 4. 5 μ 1、 プラスミド LITMUS28由来の EcoRV- Sacl断片 （約 2. 8Kb) 0. 5 μ 1、 Ligation High (東洋紡社製） 5. 0 1を混合し、 16°Cで 30分間反応させることにより結合反応を 行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換し、 得られたアンピシリン 耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミド DNA を単離した。 本プラス ミドを以下、 pK0FUT8gE2-lと称す。 (3) プラスミ ド pK0FUT8gE2_2の構築
本項 （2) で得たプラスミド pK0FUT8gE2- 1 を用いて、 以下の手順でプラスミド pK0FUT8gE2-2を構築した （第 6図）。
プラスミ ド pK0FUT8gE2-l 2. 0 // gを、 lOO ^ g/ml BSA (New England Biolabs社 製） を含む NEBuffer 2 (New England Biolabs社製） 30 μ ΐ に溶解し、 制限酵素 EcoRV (New England Biolabs社製） 20単位を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行 つた。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断片を回収した後、 lOO ^u g/ml BSA (New England Biolabs社製） を含む NEBuffer 1 (New England Biolabs 社 製） 30 i l に溶解し、 20単位の制限酵素 Kpnl (New England Biolabs社製） を加 えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロー スゲル電気泳動に供し、 約 1. 5Kbの DNA断片を精製した。
一方、 プラスミド ploxPPuro 1. を、 NEBuffer 4 (New England Biolabs社 製） 30 μ ΐに溶解し、 制限酵素 1^1 (New England Biolabs社製） 20単位を加え て 37°Cで 2時間消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA 断片を回収.した後、 lOO ^ g/ml BSA (New England Biolabs社製） を含む NEBuffer 1 (New England Biolabs社製） 30 μ 1 に溶解し、 20 単位の制限酵素
Figure imgf000081_0001
(New England Biolabs社製） を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 3. 5Kb の DNA断片を精 製した。
上記で得たプラスミド pK0FUT8gE2- 1由来の EcoRV-Kpnl断片 （約 1. 5Kb) 4. 0 μ 1、 プラスミド ploxPPuro 由来の Hpal-Kpnl 断片 （約 3. 5Kb) Ι. Ο μ 1 Ligation High (東洋紡社製） 5. 0 1 を混合し、 16°Cで 30分間反応させることにより結合 反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換し、 得られたアンピ シリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミド DNA を単離した。 本 プラスミドを以下、 pK0FUT8gE2 - 2と称す。
(4) プラスミ ド pscFUT8gE2- 3の構築
参考例（2) で得たチャイニーズハムスター FUT8のェクソン 2を含むゲノム領域 を有するプラスミ ド PFUT8fgE2- 4 を用いて、 以下の手順でプラスミ ド pscFUT8gE2-3を構築した （第 7図）。
プラスミド pFUT8fgE2- 4 2. O /^t gを NEBuffer 1 (New England Biolabs社製） 35 μ ΐ に溶解し、 20単位の制限酵素 (New England Biolabs社製） を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断 片を回収した後、 Blunting High (東洋紡社製） を用い、 添付の説明書に従って DNA末端の平滑ィ匕を行った。 フエノール/クロ口ホルム抽出処理およびエタノール 沈殿を行って DNA 断片を回収した後、 NEBuffer 2 (New England Biolabs社製） 35 / lに溶解し、 20単位の制限酵素 Hindlll (New England Biolabs社製） を加え て 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロース ゲル電気泳動に供し、 約 3. 5Kbの DNA断片を精製した。
一方、 プラスミド LITMUS39 (New England Biolabs社製） 1. 0 gを NEBuffer 2 (New England Biolabs 社製） 35 /x 1 に溶解し、 20 単位の制限酵素 EcoRV (New England Biolabs社製） および 20単位の制限酵素 Hindlll (New England Biolabs 社製） を加えて 37°Cで 2 時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 2. 8Kbの DNA断片を精製した。
上記で得たプラスミ ド pFUT8fgE2- 4 由来の Hpall - Hindlll 断片 （約 3. 5Kb) 4. 0 i l, プラスミド LITMUS39 由来の EcoRV-Hindlll 断片 （約 2. 8Kb) 1. 0 μ 1、 Ligation High (東洋紡社製） 5· 0 μ 1を混合し、 16°Cで 30分間反応させることに より結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換し、 得られ たアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミド DNA を単離 した。 本プラスミドを以下、 pscFUT8gE2-3と称す。
(5) プラスミ ド pK0FUT8gE2-3の構築
参考例 (2)で得たチャイニーズハムスタ一 FUT8のェクソン 2を含むゲノム領域 を有するプラスミ ド pFUT8fgE2- 4 を用いて、 以下の手順でプラスミ ド pK0FUT8gE2-3を構築した （第 8図）。
プラスミド pFUT8fgE2— 4 を NEBuffer for EcoRI (New England Biolabs 社製） 35 i lに溶解し、 20単位の制限酵素 EcoRI (New England Biolabs社製） お ょぴ 20単位の制限酵素 Hindlll (New England Biolabs社製） を加えて 37°Cで 2 時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳 動に供し、 約 1. 8Kbの DNA断片を精製した。
一方、 プラスミド pBluescriptll KS (+) (Strategene社製） 1. 0 μ gを NEBuffer for EcoRI (New England Biolabs 社製） 3δ μ 1 に溶解し、 20 単位の制限酵素 EcoRI (New England Biolabs 社製） および 20 単位の制限酵素幽(1111 (New England Biolabs社製） を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 3. 0Kbの DNA断片を精製 した。
上記で得たプラスミド pFUT8fgE2- 4由来の Hindlll-EcoRI断片 （約 1. 8Kb) 4. 0 μ 1、 プラスミド pBluescriptll KS (+)由来の Hindlll- EcoRI断片 （約 3. 0Kb) 1. 0 μ 1、 Ligation High (東洋紡社製） 5. 0 ^ 1 を混合し、 16°Cで 30分間反応させる ことにより結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換し、 得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミド DNA を単離した。 本プラスミドを以下、 PK0FUT8gE2 - 3と称す。
(6) プラスミド pK0FUT8gE2- 4の構築
本項 （4) および （5) で得たプラスミド pscFUT8gE2- 3および PK0FUT8gE2_3を 用いて、 以下の手順でプラスミド pK0FUT8gE2- 4を構築した （第 9図）。
プラスミド pscFUT8gE2- 3 1. 0 /i gを、 lOO g/ml BSA (New England Biolabs社 製） を含む NEBuffer for Sail (New England Biolabs社製） 35 1に溶解し、 制 限酵素 il (New England Biolabs社製） 20単位を加えて 37°Cで 2時間消化反応 を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA 断片を回収した後、 NEBuffer 2 (New England Biolabs 社製） 30 / 1 に溶解し、 20 単位の制限酵素 Hindi II (New England Biolabs社製） を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 3. 6Kb の DNA断片を精製した。
一方、 プラスミ ド pK0FUT8gE2- 3 1. 0 μ g を、 100 μ g/ml BSA (New England Biolabs社製） を含む NEBuffer for Sail (New England Biolabs社製） 35 μ ΐに 溶解し、 制限酵素 Sail (New England Biolabs社製） 20単位を加えて 37°Cで 2時 間消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断片を回収し た後、 NEBuffer 2 (New England Biolabs社製） 35 1 に溶解し、 20単位の制限 酵素 Hindlll (New England Biolabs社製） を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行 つた。 消化反応後、 PH8. 0の lmol/1 Tris-HCl緩衝液 35 / lおよび大腸菌 C15株 由来 Alkaline Phosphatase (宝酒造社製） 3. 5 μ 1 を添加し、 65°Cで 30分間反応 させることにより DNA末端の脱リン酸ィ匕を行った。 脱リン酸化処理後、 フエノー ル /クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、 回収した DNA断片を滅菌 水 10 に溶解した。 上記で得たプラスミド pscFUT8gE2- 3 由来の Sail- Hindi II 断片 （約 3. 1Kb) 4. 0 1、 プラスミド pK0FUT8gE2 3由来の Sail- Hindlll断片 （約 4. 8Kb) 1. 0 1、 Ligation High (東洋紡社製） 5· 0 μ 1を混合し、 16°Cで 30分間反応させることに より結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5ひ株を形質転換し、 得られ たアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミド DNA を単離 した。 本プラスミドを以下、 pK0FUT8gE2- 4と称す。
(7) プラスミド pK0FUT8gE2- 5の構築
本項 （3) および （6) で得たプラスミド pK0FUT8gE2- 2および pK0FUT8gE2- 4を 用いて、 以下の手順でプラスミド pK0FUT8gE2- 5を構築した （第 10図）。
プラスミド pK0FUT8gE2- 2 1. 0 z g を NEBuffer 4 (New England Biolabs社製） 30 ΐ に溶解し、 制限酵素 胆1 (New England Biolabs社製） 20単位を加えて 25°Cで 2時間消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断 片を回収した後、 NEBuffer 2 (New England Biolabs 社製） 30 1 に溶解し、 20 単位の制限酵素 BamHI (New England Biolabs社製） を加えて 37°Cで 2時間消ィ匕 反応を行った。 消化反応後、 PH8. 0の lmol/1 Tris-HCl緩衝液 30 1および大腸 菌 C15株由来 Alkal ine Phosphatase (宝酒造社製） 3. 0 μ ΐを添カ卩し、 65°Cで 1時 間反応させることにより DNA末端の脱リン酸化を行った。 脱リン酸化処理後、 フ ェノール /ク口口ホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、 回収した DNA断片 を滅菌水 10 μ ΐに溶解した。
一方、 プラスミド pK0FUT8gE2- 4 1. 0 ^ g を NEBu; fer 4 (New England Biolabs 社製） 30 β 1に溶解し、 制限酵素 (New England Biolabs社製） 20単位を加 えて 25°Cで 2 時間消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断片を回収した後、 NEBuffer 2 (New England Biolabs社製） 30 1に溶解し、 20単位の制限酵素 BamHI (New England Biolabs社製） を加えて 37°Cで 2時間消 化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供 し、 約 5. 2Kbの DNA断片を精製した。
上記で得たプラスミド pK0FUT8gE2- 2由来の Smal-BamHI断片 （約 5. 0Kb) 0. 5 μ 1、 プラスミ ド pK0FUT8gE2-4 由来の Smal - BamHI 断片 （約 5. 4Kb) 4. 5 μ 1、 Ligation High (東洋紡社製） 5. 0 1を混合し、 16°Cで 15時間反応させることに より結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換し、 得られ たアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミ ド DNA を単離 した。 本プラスミ ドを以下、 PK0FUT8gE2_5と称す。
(8) プラスミ ド pKOFUTSPuroの構築
本項 (7) で得たプラスミ ド PK0FUT8gE2_5 を用いて、 以下の手順でプラスミ ド pK0FUT8Puroを構築した （第 11図）。
プラスミ ド pKOSelectDT (Lexicon社製） 1. 0 /i g を NEBuffer 4 (New England Biolabs社製） 50 μ ΐ に溶解し、 制限酵素 ^ίΠ (New England Biolabs社製） 16 単位を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 ジフテリアトキシン発現ュ-ットを含む約 1. 2Kbの DNA断片を精製した。
一方、 プラスミ ド pK0FUT8gE2_5 1. O ^ g を NEBuffer 4 (New England Biolabs 社製） 50 μ ΐに溶解し、 制限酵素 Rsrll (New England Biolabs社製） 16単位を加 えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 PH8. 0の lmol/1 Tris-HCl緩 衝液 30 /i lおよび大腸菌 C15株由来 Alkaline Phosphatase (宝酒造社製） 3. 0 μ ΐ を添加し、 65°Cで 1 時間反応させることにより DNA末端の脱リン酸化を行った。 脱リン酸化処理後、 フエノール/クロ口ホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行 レ、、 回収した DNA断片を滅菌水 ΙΟ μ Ιに溶解した。
上記で得たプラスミ ド pKOSelectDT由来の RsrII-RsrII断片 （約 1. 2Kb) Ι. Ο μ 1、 プラスミ ド pK0FUT8gE2 - 5由来の Rsrll - Rsrll断片 (約 10. 4Kb) 1. 0 1、 滅菌 水 3. 0 μ 1、 Ligation High (東洋紡社製） 5. 0 1を混合し、 16°Cで 30分間反応さ せることにより結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5ひ株を形質転換 し、 得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミ ド DNAを単離した。 本プラスミ ドを以下、 PK0FUT8Puroと称す。
2. FUT8遺伝子ェクソン 2を含むゲノム領域が 1コピー破壊された CH0細胞の 作製
(1) ターゲティングベクターの導入
本実施例第 1項で構築したチャイニーズハムスター FUT8ゲノム領域ターゲティ ングベタタ一 pK0FUT8Puroを実施例 1の（2)で作製した 5- 03株へ導入した。
プラスミ ド pK0FUT8Puroの 5-03株への遺伝子導入はェレク トロポレーション法 [サイトテクノロジー （Cytotechnology)， 3， 133 (1990) ] に準じて以下の手順で 行った。 まず、 プラスミ ド pK0FUT8Puro 150 μ g を NEBuffer for Sail (New England Biolabs社製） 1. 8mlに溶解し、 600単位の制限酵素 §§JJ (New England Biolabs社製） を加えて 37°Cで 5時間消化反応を行うことにより線状ィヒした。 該 反応液に対しフエノール/クロロホルム抽出処理おょぴエタノール沈殿を行い、 回 収した線状化プラスミドを 水溶液とした。 一方、 5 - 03株を K- PBS緩衝 液 （137mraol/l KC1、 2. 7mmol/l NaCl、 8. lmmol/1 Na2HP0い 1. 5mmol/l KH2P04、 4. Ommol/1 MgCl2) に懸濁して 8 X 107個/ ml とした。 細胞懸濁液 200 1 (1. 6 X 106 個） を上記線状ィ匕プラスミド 4 μ 1 (4 §) と混和した後、 細胞 -DNA混和液の全量 を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2mm) (BI0-RAD社製） へ移し、 細胞融合装 置 Gene Pulser (BI0-RAD社製） を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250 μ Ρの条 件で遺伝子導入を行った。 同様にしてキュべット 30本分に対し遺伝子導入した後、 細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血清 （Life Technologies社製） および 1倍濃度の HT supplement (Life Technologies 社製） を添加した IMDM 培地 （Life Technologies社製） に懸濁し、 接着細胞培養用 10cmディッシュ （Falcon社製） 30枚へ播種した。 5%C02、 37°Cの条件下で 24時間培養した後、 培養上清を除去し、 15 μ g/mlPuromycin (SIGMA 社製） および 10 % ゥシ胎児透析血清 （Life Technologie社製） を添加した IMDM培地 （Life Technologies社製） を 10mlずつ 分注した。 この培地交換作業を 3〜4 日毎に繰り返しながら 10 日間の培養を行い、 ピュー口マイシン耐性株を取得した。
(2) ターゲティングベクター導入株の取得
本項 （1) で得たピューロマイシン耐性株より任意の 900個のコロニーを以下の 手順で採取した。
まず、 ピューロマイシン耐性株が出現した 10cmディッシュより培養上清を除 去し、 リン酸緩衝液 7ml を注入した後、 実体顕微鏡下に移した。 次にピペットマ ン （GILS0N社製） を用いてコロニーを搔き取って吸い込み、 丸底 96穴プレート (Falcon社製） へ採取した。 トリプシン処理を行った後、 接着細胞用平底 96穴プ レート （岩城硝子社製） へ各クローンを播種し、 15 /^ g/ml Puromycin (SIGMA社 製） および 10% ゥシ胎児透析血清 （Ufe Technologie社製） を添カ卩した IMDM培 地 （Life Technologies社製） を用いて 1週間培養した。 培養後、 上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、 2倍量の凍 結培地 （20% DMS0、 40% ゥシ胎児血清、 40% IMDM) と混和した。 このうち半量 を接着細胞用平底 96穴プレート （岩城硝子社製） へ播種してレプリカプレートと する一方、 残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。 レプリカプ レートは、 15 /i g/ml Puromycin (SIGMA社製） および 10% ゥシ胎児透析血清 (Life Technologie社製） を添加した IMDM培地 (Life Technologies社製） を用 いて 1週間培養することにより作製した。
(3) ゲノム PCRによる相同組換えの診断
本項 （2) で得た 900クローンに対し、 以下の手順でゲノム PCRによる相同組換 えの診断を行った。
まず、 本項 （2) で作製したレプリカプレートより公知の方法 [アナリティカ ノレ ' ノ ィオケミストリー （Analytical Biochemistry) , 201, 331 (1992) ] に従つ て各クローンのゲノム DNA を調製し、 各々 TE- RNase緩衝液 （pH8. 0) (10醒 ol/l Tris- HC1、 lramol/1 EDTA、 200 μ g/ml RNase A) 30 μ 1 にー晚溶解した。 また、 参 考例で得た FUT8ゲノム領域のうちターゲティングべクター相同領域を越えた部分 の配列に結合するプライマー （配列番号 15に示す） およびベクター内の ΙοχΡ配 列に結合するプライマー （配列番号 16に示す） を設計した。
DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製） を用いて、 上記で調製したゲノム DNA溶 液を各々 10 1 含む 25 /z l の反応液 [ExTaq buffer (宝酒造社製）、 0. 2匪 ol/l dNTPs、 0. 5 /i niol/l 上記遺伝子特異的プライマー （配列番号 15 および配列番号 16) ] を調製し、 ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) を行った。 PCR は、 94°Cで 3分間 の加熱の後、 94°Cで 1分間、 60°Cで 1分間、 72°Cで 2分間からなる反応を 1サイ クルとした 38サイクルの条件で行った。
PCR後、 反応液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 CH0細胞ゲノ ム領域とターゲテイングベクター相同領域との境界部を含む約 1. 7Kb の特異的増 幅が認められるものを陽性クローンとした。 本法により陽性を示す 1 クローンを 見出した。
(4) ゲノムサザンプロットによる相同組換えの診断
本項 （3) で陽性が確認された 1クローンに対し、 以下の手順でゲノムサザンブ ロットによる相同糸且換えの診断を行った。 本項 （2) で凍結保存したマスタープレートのうち、 本項 （3) で見出された陽 性クローンを含む 96穴プレートを選択し、 5%C02、 37°Cの条件下で 10分間静置 した。 静置後、 陽性クローンに該当するゥエルから細胞を接着細胞用平底 24穴プ レート （Greiner社製） へ播種した。 15 i g/ml ピューロマイシン（SIGMA社製） お ょぴ 10% ゥシ胎児透析血清 （L e Technologie 社製） を添加した IMDM培地 (Life Technologies社製） を用いて 1週間培養した後、 接着細胞用平底 6穴プレ ート （Greiner社製） へ播種した。 該プレートより公知の方法 [ヌクレイック · アシッド . リサーチ （Nucleic Acids Research) , 3, 2303 (1976) ] に従って各ク ローンのゲノム DNA を調製し、 各々 TE- RNase緩衝液 （ρΗδ. 0) (10mmol/l Tris- HC1、 1醒 ol/l EDTAヽ 200 μ §/ιη1 RNase A) 150 μ 1にー晚溶解した。
上記で調製したゲノム DNA 12 ;u g を NEBuffer 3 (New England Biolabs社製） 120 μ 1に溶解し、 25単位の制限酵素 Pstl (New England Biolabs社製） を加えて 37°Cで一晩消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断片 を回収した後、 TE緩衝液 (pH8. 0) (10ramol/l Tris - HC1、 1画 ol/l EDTA) 20 ^ 1に 溶解し、 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供した。 泳動後、 公知の方法 [プ口シーデイングス'ォブ 'ザ.ナショナル'アカデミー'オフ、、 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 76, 3683 (1979) ] に従い、 ナイロン膜へゲノム DNA を 転写した。 転写終了後、 ナイ口ン膜に対し 80°Cで 2時間の熱処理を行つた。
一方、 サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。 まず、 参考 例で得た FUT8ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の 配列に結合するプライマー （配列番号 9および配列番号 10) を設計した。 次に、 DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製） を用いて、 参考例 （2) で得たプラスミド PFUT8fgE2-2 4. Ong を含む 20 μ 1 の反応液 [ExTaq buffer (宝酒造社製）、 0. 2mmol/l dNTPs、 0. 5 mol/l 上記遺伝子特異的プライマー （配列番号 9 および 配列番号 10) ] を調製し、 ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) を行った。 PCR は、 94°C で 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 74°Cで 1分間からなる反 応を 1 サイクルとした 25 サイクルの条件で行った。 PCR後、 反応液を 1. 75% (w/v)ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 230bpのプローブ DNA断片を精製した。 得られたプローブ DNA溶液 5 μ 1に対し、 [ α - 32P] dCTP 1. 75MBqおよぴ Megaprime DNA Labelling system, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech社製） を用いて放射 線標識した。 ハイプリダイゼーシヨンは以下のように行った。 まず、 上記のナイロン膜を口 一ラーボトルへ封入し、 ハイブリダィゼーシヨン液 [5 X SSPE、 50 X Denhaldt' s 液、 0. 5% (w/v) SDS、 100 II g/ml サケ精子 DNA] 15ml を加えて 65°Cで 3時間の プレハイプリダイゼーシヨンを行った。 次に、 32P標識したプローブ DNAを熱変性 してボトルへ投入し、 65°Cで一 B免加温した。
ハイプリダイゼーシヨン後、 ナイロン膜を 2 X SSC-0. 1% (w/v) SDS 50ml に浸 漬し、 65°Cで 15分間加温した。 上記の洗浄操作を 2回繰り返した後、 膜を 0. 2 X SSC-0. 1% (w/v) SDS 50ml に浸漬し、 65°Cで 15分間加温した。 洗浄後、 ナイ口 ン膜を X線フィルムへ- 80°Cでニ晚暴露し現像した。
前述の制限酵素 Pstl処理により、 野生型 FUT8対立遺伝子から約 4. 4Kbの DNA 断片が生じる。 一方、 同制限酵素処理により、 ターグティングベクターとの相同 組換えが起こった対立遺伝子から約 6. 0Kbの DNA断片が生じる。
本法により、 本項 （3) における陽性クローンのゲノム DNAより上記約 4. 4Kbお よび約 6. 0Kbの特異的断片が見出された。 両断片の量比が 1 ： 1であったことから、 本クローンは、 FUT8対立遺伝子を 1 コピー破壊したクローンであることが確認さ れた。 本クローンを以下、 1st. AFUT8 2 - 46株と称す。
3. FUT8遺伝子が 1コピー破壊された CH0細胞からの薬剤耐性遺伝子の除去 (1) Creリコンビナーゼ発現ベクターの導入
本実施例第 2項で作製した 1st. AFUT8 2-46株へ、 Cre リコンビナーゼ発現べ クタ一 pBS185 (Life Technologies社製） を導入した。
プラスミド pBS185の 1st. AFUT8 2-46株への遺伝子導入はエレクトロポレーシ ヨン法 [サイトテクノロジー （Cytotechnology)， 3, 133 (1990) ] に準じて以下 の手順で行った。 まず、 1st. AFUT8 2-46株を K- PBS緩衝液 [137賺 ol/l KC1、 2. 7腿 ol/l NaCl、 8. lmmol/1 Na2HP04、 1. 5讓 ol/l KH2P04、 4. 0mmol/l MgCl2] に懸 濁して 8 X 107個/ ml とした。 細胞懸濁液 200 μ ΐ (1. 6 X 106個） をプラスミ ド PBS185 Α μ と混和した後、 細胞- DNA混和液の全量を Gene Pulser Cuvette (電 極間距離 2mm) (BI0-RAD社製） へ移し、 細胞融合装置 Gene Pulser (BIO- RAD社 製） を用いてパルス電圧 350V, 電気容量 250 /i F の条件で遺伝子導入を行った。 導入後、 細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血淸 （Life Technologies社製） および 1倍 濃度の HT supplement (Life Technologies社製） を添加した IMDM培地 （Life Technologies社製） 10mlに懸濁し、 さらに同培地を用いて 2万倍希釈した。 接着 細胞培養用 10cmディッシュ （Falcon社製） 7枚へ播種後、 5%C02、 37°Cの条件下 で 24 時間培養した。 培養後、 上清を除去し、 10 % ゥシ胎児透析血清 （Life Technologie社製）を添加した IMDM培地 （L e Technologies社製） を 10mlずつ 分注した。 この培地交換作業を 3〜4 日毎に繰り返しながら 10 日間の培養を行つ た。
(2) Creリコンビナーゼ発現ベクター導入株の取得
本項 （1) で得た株より任意の 400個のコロニーを以下の手順で採取した。
まず、 10cmディッシュより培養上清を除去し、 リン酸緩衝液 7mlを注入した後、 実体顕微鏡下に移した。 次にピペットマン （GILSON社製） を用いてコロニーを搔 き取って吸い込み、 丸底 96穴プレート （Falcon社製） へ採取した。 トリプシン 処理を行った後、 接着細胞用平底 96穴プレート （岩城硝子社製） へ各クローンを 播種し、 10%ゥシ胎児透析血清 （Life Technologie社製） を添加した IMDM培地 (Life Technologies社製） を用いて 1週間培養した。
培養後、 上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、 2倍量の凍 結培地 （20%DMS0、 40% ゥシ胎児血清、 40% IMDM) と混和した。 このうち半量 を接着細胞用平底 96穴プレート （岩城硝子社製） へ播種してレプリカプレートを 作製する一方、 残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。
次に、 レプリカプレートを 15 μ 8/ιη1 ピューロマイシン（SIGMA社製) および 10% ゥシ胎児透析血清 （Life Technologie社製） を添加した IMDM培地 （Ufe Technologies社製） を用いて 6 日間培養した。 Cre リコンビナーゼの発現により ΙοχΡ配列に挟まれたピュー口マイシン耐性遺伝子が除去された陽性クローンは、 ピューロマイシン存在下で死滅する。 本選択法により 91個の陽性クローンを見出 した。
(3) ゲノムサザンプロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断
本項 （2) で見出された陽性クローンのうち任意の 6クローンに対し、 以下の手 順でゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断を行つた。
本項 （2) で凍結保存したマスタープレートのうち、 上記 6 クローンを含む 96 穴プレートを選択し、 5%C02、 37°Cの条件下で 10分間静置した。 静置後、 上記ク ローンに該当するゥエルから細胞を接着細胞用平底 24穴プレート （Greiner社 、播種した。 10% ゥシ胎児透析血清 （Life Technologie社製） を添加した IMDM培地 （Ufe Technologies社製） を用いて 1週間培養した後、 接着細胞用平 底 6 穴プレート （Greiner社製） へ播種した。 該プレートより公知の方法 [ヌク レイツク ·ァシッド · リサーチ （Nucleic Acids Research) , 3, 2303 (1976) ] に 従って各クローンのゲノム DNA を調製し、 各々 ΤΕ- RNase 緩衝液 （pH8. 0) (I0mmol/1 Tri s - HC1、 lmmol/1 EDTA、 200 μ g/ml RNase A) 150 μ 1 にー晚溶解し た。
上記で調製したゲノム DNA 12 μ g を NEBuffer for BamHI (New England Biolabs社製） 120 1に溶解し、 20単位の制限酵素 BamHI (New England Biolabs 社製） を加えて 37°Cで一晩消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を 用いて DNA断片を回収した後、 TE緩衝液 (pH8. 0) (lOramol/1 Tri s- HC1、 lmmol/1 EDTA) 20 1 に溶解し、 0. 4% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供した。 泳動後、 公知の方法 [プ口シーデイングス'ォブ 'ザ'ナショナル 'ァカデミ一'ォブ ·サイェ ンス （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 76， 3683 (1979) ] に従い、 ナイロン膜へ ゲノム DNAを転写した。 転写終了後、 ナイ口ン膜に対し 80°Cで 2時間の熱処理を 行った。
一方、 サザンプロットに用いるプローブを以下のように調製した。 まず、 参考 例で得た FUT8ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の 配列に結合するプライマー （配列番号 9および配列番号 10) を設計した。 次に、 DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製） を用いて、 参考例 （2) で得たプラスミド pFUT8fgE2-2 4. Ong を含む 20 μ 1 の反応液 [ExTaq buffer (宝酒造社製）、 0. 2賺 ol/l dNTPs、 0· 5 μ ιηο1/1 上記遺伝子特異的プライマー （配列番号 9 および 配列番号 10) ] を調製し、 ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) を行った。 PCR は、 94°C で 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 74°Cで 1分間からなる反 応を 1 サイクルとした 25 サイクルの条件で行った。 PCR後、 反応液を 1. 75% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 230bp のプローブ DNA断片を精製した。 得られたプロープ DNA溶液 5 μ 1に対し、 [ α - 32P] dCTP 1. 75MBqおよぴ Megaprime DNA Labell ing system, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech社製） を用いて放射 線標識した。
ハイブリダィゼーシヨンは以下のように行った。 まず、 上記のナイロン膜を口 一ラーボトルへ封入し、 ハイブリダィゼーシヨン液 （5 X SSPE、 50 X Denhaldt' s 液、 0. 5% (w/v) SDS、 100 μ g/ml サケ精子 DNA) 15ml を加えて 65°Cで 3時間の プレハイプリダィゼーシヨンを行った。 次に、 32P標識したプローブ DNAを熱変性 してボトルへ投入し、 65°Cで一晚加温した。
ハイプリダイゼーシヨン後、 ナイロン膜を 2 XSSC- 0. 1% (w/v) SDS 50ml に浸 漬し、 65°Cで 15分間加温した。 上記の洗浄操作を 2回繰り返した後、 膜を 0. 2 X SSC-0. 1% (w/v) SDS 50ml に浸漬し、 65°Cで 15分間加温した。 洗浄後、 ナイ口 ン膜を X線フィルムへ- 80°Cでニ晚暴露し現像した。
前述の制限酵素 BamHI処理により、 野生型 FUT8対立遺伝子から約 25. 5Kb の DNA断片が生じる。 また、 同制限酵素処理により、 ターゲティングベクターとの 相同組換えが起こった対立遺伝子から約 20. 0Kbの DNA断片が生じる。 さらに、 相 同組換えが起こった対立遺伝子からピューロマイシン耐性遺伝子 （約 1. 5Kb) が 除去された場合には、 同処理により約 18. 5Kbの DNA断片が生じる。
本法により、 上記 6クローンのうち 5クローンのゲノム DNAより上記約 25. 5Kb および約 18. 5Kbの特異的断片が見出された。 両断片の量比が 1 ： 1であったこと から、 FUT8ゲノム領域を 1 コピー破壌した株よりピュー口—マイシン耐性遺伝子が 除去されたことが示された。 本クローンを以下、 1st. AFUT8 2-46-1株と称す。 尚、 上述の 1st. AFUT8 2-46-1株、 1st. AFUT8 2-46株、 および、 5-03株のゲノ ムサザンの結果を第 12図に示した。 なお 1st. AFUT8 2-46-1株は 2-46-1の株名 で、 平成 13年 9月 26日付けで独立法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ 一 （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地中央第 6) に FERM BP- 7755として寄託 されている。
4. FUT8遺伝子破壌株が生産する抗体組成物の精製
本実施例第 3項で得た FUT8対立遺伝子が 1コピー破壌された株 1st. AFUT8 2- 46-1株を、 3 X 105個/ ml の密度で 10% ゥシ胎児透析血清 （Life Technologie社 製） を添加した IMDM培地 （L e Technologies社製） へ懸濁後、 接着細胞培養用 T182 フラスコ （Greiner社製） 2本に計 60ml各々播種した。 3 日間の培養後、 上 清を除去し、 EXCELL301培地 （JRH Biosciences社製） 計 60mlへ交換した。
これらを 37°Cの 5%C02インキュベーター内で 7 日間培養後、 生細胞数をカウン トしてバイアビリティーが同程度 （各々 30%以下） であることを確認した後、 各 細胞懸濁液を回収した。 該細胞懸濁液に対し 3000rPm、 4°Cの条件で 10分間の遠 心分離を行って上清を回収し、 10000rpm、 4°Cの条件で 1時間の遠心分離を行った 後、 0. 22 m孔径 150ml容 PES Filter Unit (NALGENE社製） を用いて濾過した。 0. 8cm径のカラムに Prosep- A HighCapacity (bioPROCESSING社製） を厚さ 2cm で充填し、 0. lmol/1 クェン酸緩衝液 （pH3. 0) 10ml および lmol/1 グリシン /NaOH-0. 15mol/l NaCl 緩衝液 (pH8. 6) 10ml で順次洗浄することによって担体の 平後 ヒを行った。 次に、 上記培養上清各 100mlをカラムに通筒し、 lmol/1 グリシ ン /NaOH- 0. 15mol/l NaCl緩衝液 (pH8. 6) 50mlで洗浄した。 洗浄後、 0. lmol/1 ク ェン酸緩衝液 (pH3. 0) 2. 5ml を用いて Prosep-A に吸着した抗体の溶出を行い、 溶出液を 500 Ai l ずつ分画すると共に、 各画分をそれぞれ 2mol/l Tris-HCl (pH8. 5) 100 と混合して中和した。 BCA法 [アナリティカル 'パイオケミスト リー （Anal. Biochem. ) , 150， 76 (1985) ] を用いて抗体を高濃度で含む 2 画分 (計 1. 2ml) を選択して合一し、 lOmol/1 クェン酸- 0. 15mol/l NaCl 緩衝液 (pH6. 0) を用いて 4°Cで一昼夜透析を行った。 透析後、 抗体溶液を回収し、 0. 22 μ ι 孔径 Millex GV (MILLIP0RE社製） を用いて滅菌濾過した。
5. FUT8遺伝子破壊株が生産する抗体組成物の ADCC活性
本実施例第 4 項で精製した抗 CCR4 抗体の ADCC 活性を評価するため、 W001/6475 に記載の CCR4陽性細胞株 CCR4/EL- 4 を用いた ADCC活性を測定した。
10% ゥシ胎児血清 （Life Technologie 社製） を含む RPMI1640培地 （Life Technologie 社製） （以下、 RPMI1640-FBS (10) と略記する） で継代培養した CCR4/EL- 4株 1 X 106個を RPMI1640- FBS (10) 500 に懸濁し、 Na2 51Cr04 3. 7MBqを 添加して 37°Cで 90 分間培養することにより、 細胞の放射線標識を行った。 1200rpmで 5分間の遠心分離を行った後、 上清を除去し、 標識細胞を RPMI1640- FBS (IO) 5ml に懸濁した。 この洗浄操作を 3 回繰り返した後、 細胞懸濁液を氷上 で 30分間静置して放射性物質を自然解離させた。 再び上記の洗浄操作を 2回繰り 返した後、 RPMI1640-FBS (10) 5ral に懸濁することにより、 2. 0 X 105個/ ml の標的 細胞懸濁液を調製した。
一方、 健常人の静脈血 30ml を採取し、 へパリンナトリゥム (清水製薬社製） 0. 5ml を加えて穏やかに混和した後、 生理的食塩水 （大塚製薬社製） 30ml と混合 した。 混合後、 各 10mlをそれぞれ Lymphoprep (NYC0MED PHARMA AS社製） 4ml上 に穏やかに重層し、 室温下 2000rpmで 30分間の遠心分離を行った。 分離された単 核球画分を各遠心管より集めて合一し、 RPMI1640- FBS (10) 30ml に懸濁した。 室 温下 1200rpm で 15 分間の遠心分離を行った後、 上清を除去し、 該細胞を RPMI1640-FBS (10) 20ml に懸濁した。 この洗浄操作を 2 回繰り返した後、 RPMI1640- FBS(IO) を用いて 2.5X106個/ ralのエフェクター細胞懸濁液を調製した。
96穴 U字底プレート （Falcon社製） の各穴に標的細胞懸濁液を 50μ 1ずつ （1 X104個/穴） 分注した。 続いて各穴にエフヱクタ一細胞懸濁液を ΙΟΟμΙ ずつ (2.5X105個/穴） 分注することにより、 エフヱクタ一細胞と標的細胞の比を 25:1 とした。 次に RPMI1640- FBS(10)を用いて、 本実施例第 4項で得た各抗 CCR4抗体 より
Figure imgf000094_0001
0. liig/ml, 1/ g/ml, 10 g/mlの希釈系列を調製し、 該希釈溶 液を各ゥエルに 50^1 添加することにより、 終濃度 0.0025 μ§/ηι1、 0.025 ig/ml, 0.25 tg/ml、 2.5/_tg/mlとした。 5%C02、 37°Cの条件下で 4時間反応させた後、 プ レートに対し 1200rpmで 5分間の遠心分離を行った。 各穴の上清 75μ 1を 12mm径 RIAチューブ （IWAKI 社製） に分取し、 MINAX-aオートガンマ一カウンター 5550 (PACKRD社製） を用いて解離 51Cr量の測定を行つた。
また、 エフェクター細胞懸濁液おょぴ抗体溶液に代えて RPMI1640- FBS(10) 150 μ 1 を添カ卩した系で上記の反応を行うことにより、 自然解離 51Cr 量の値を求めた。 さらにエフェクター細胞懸濁液および抗体溶液に代えて 1規定塩酸 100 μ1およ ぴ RPMI1640- FBS (10) 50 μ 1を添加した系で上記の反応を行うことにより、 全解離 51Cr量の値を求めた。 これらの値を用いて実施例 2 (3) 記載の式 （I) により、 ADCC活性を求めた。
第 13図に各種抗 CCR4抗体の ADCC活性を示した。 FUT8対立遺伝子を 1コピー 破壌された 1st. AFUT8 2-46-1株より得た抗体組成物は、 該遺伝子破壊前の CH0 細胞 5-03株が生産する抗体組成物に比べ有意に高い ADCC活性を示した。 また、 これら抗体組成物での抗原結合活性には変化は観察されなかった。 以上の結果よ り、 宿主細胞の FUT8対立遺伝子を破壊することにより、 生産される抗体組成物の ADCC活性を高めることができることが明らかになった。 実施例 4. FUT8遺伝子が 1コピー破壊された CH0細胞からの高薬剤耐性株の取 得
ターゲットベクターを用い相同組換えの方法で取得されたゲノム遺伝子の片方 のァリルが破壊された細胞を、 ターゲットベクター挿入株を選抜する際に用いた ポジティブ選択のための薬剤濃度を 10倍程度高くした培地で培養し、 該薬剤に対 する高耐性株を取得することで、 両方のァリルが破壌された株が取得されること が一般的に知られている (マニピュレイティング'ザ'マウス'ェンブリオ.ァ 'ラボ ラ 卜リー-マ-ユアノレ、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 E S細胞を用いた変異マウスの作製) 。
そこで、 実施例 3の 2 (3)で得た 1st. AFUT8 2- 46株を用い、 公知の方法 [モレ キュラー ·アンド ·セノレラー · ノィ才ロジー (Molecular and Cellular Biology) , 12， 2391, (1992) ] に従って FUT8遺伝子が 2コピー破壊された形質転換株を以下 のようにして作製した。
(1) 高濃度ピューロマイシン耐性株の取得
10% ゥシ胎児透析血清 （Life Technologies社製） を添加した IMDM培地 (Life Technologies社製）へ 1st. A FUT8 2-46株 1 X 108個を懸濁し、 接着細胞培養用 10cmディッシュ （Falcon社製） 20枚へ播種した後、 5%C02、 37°Cの条件下で 24時 間培養した。 培養後、 上清を除去し、 150 μ §/ηι1 ピューロマイシン （SIGMA社 製） および 10% ゥシ胎児透析血清 （Life Technologie社製） を添加した IMDM培 地（Life Technologies社製）を 10mlずつ分注した。 この培地交換作業を 3〜4 日 毎に繰り返しながら 12日間の培養を行った。
出現した薬剤耐性コロニー 90個を以下の手順で採取した。 まず、 10cmデイツ シュより培養上清を除去し、 リン酸緩衝液 7ml を注入した後、 実体顕微鏡下に移 した。 次にピペットマン （GILS0N社製） を用いてコロニーを搔き取って吸い込み、 丸底 96 穴プレート （Falcon社製） へ採取した。 トリプシン処理を行った後、 接 着細胞用平底 96穴プレート （岩城硝子社製） へ各クローンを播種し、 150 μ ε/ιη1 Puromycin (SIGMA社製） および 10% ゥシ胎児透析血清 （Life Technologie社 製） を添加した IMDM培地 (Life Technologies社製）を用いて 1週間培養した。 培養後、 上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、 2倍量の凍 結培地 [20% DMS0、 40% ゥシ胎児血清、 40% IMDM] と混和した。 このうち半量を 接着細胞用平底 96穴プレート （岩城硝子社製） へ播種してレプリカプレートとす る一方、 残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。 レプリカプレ ートは、 15 i g/mlピューロマイシン （SIGMA社製） および 10% ゥシ胎児透析血清
(Life Technologie社製） を添加した IMDM培地（Ufe Technologies社製）を用 いて 1週間培養した。 (2) ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断
本項 （1) で得た全ての薬剤耐性クローンに対し、 以下の手順でゲノムサザンブ ロットによる相同組換えの診断を行った。
本項 （1) で作製したレプリカプレートに対しトリプシン処理を行った後、 全ク ローンを接着細胞用平底 24穴プレート （Greiner社製） へ播種した。 150 /i g/ml ピューロマイ シン （SIGMA 社製） および 10% ゥシ胎児透析血清 （Ufe Technologie社製） を添加した IMDM培地（Idfe Technologies社製）を用いて全ク ローンを 1週間培養した後、 トリプシン処理を行い接着細胞用平底 6穴プレート (Greiner社製） へ播種した。 該プレートより公知の方法 [ヌクレイック 'ァシ ッド ' リサーチ （Nucleic Acids Research) , 3, 2303, (1976) ] に従って各クロ ーンのゲノム DNA を調製し、 各々 TE - RNase緩衝液（pH8. 0) [10mmol/l Tris - HC1、 lmmol/1 EDTA、 200mg/ml RNase A] 150mlにー晚溶解した。
上記で調製したゲノム DNA 12 ;u gを NEBtrffer for BamHI (New England Biolabs 社製） 120 μ 1に溶解し、 25単位の制限酵素 BaraHI (New England Biolabs社製）を加 えて 37°Cでー晚消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA 断片を回収した後、 TE緩衝液（pH8. 0) [I0mmol/1 Tris-HCl、 lmmol/1 EDTA] 20 μ ΐ に溶解し、 0. 6% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供した。 電気泳動後、 公知 の方法 [プロシーデイングス'ォプ ·ザ ·ナショナル'アカデミー'ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 76, 3683, (1979)に従い、 ナイロン B莫へゲノム DNAを転写した。 転写終了後、 ナイロン膜に対し 80°Cで 2時間の熱処理を行った。 一方、 サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。 DNA ポリメ ラ一ゼ ExTaq (宝酒造社製）を用いて、 参考例（2)で得たプラスミド pFUT8f gE2- 2 4. Ongを含む 20 の反応液 [ExTaq buffer (宝酒造社製）、 0. 2画 ol/l dNTPs、 0· 5 μ mol/1 上記遺伝子特異的プライマー （配列番号 9および配列番号 10) ]を調製し、 ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) を行った。 PCRは、 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°C で 30秒間、 55°Cで 30秒間、 74°Cで 1分間からなる反応を 1サイクルとした 25サ イタルの条件で行った。 PCR後、 反応液を 1. 75% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に 供し、 約 230bpのプローブ DNA断片を精製した。 得られたプローブ DNA溶液 5ml に対し、 [ ct 32P] dCTP 1. 75MBqおよび Megaprime DNA Labelling system, dCTP
(Amersham Pharmacia Biotech社製） を用いて放射標識した。
ハイプリダイゼーシヨンは以下のように行った。 まず、 上記のナイロン膜を口 一ラーボトルへ封入し、 ハイブリダィゼーシヨン液 [5 X SSPE、 50 X Denhaldt' s 液、 0. 5°/。(w/v) SDS、 100 μ g/ml サケ精子 DNA] 15mlを加えて 65°Cで 3時間のプ レハイブリダイゼーションを行つた。 次に、 32P標識したプローブ DNAを熱変性し てボトルへ投入し、 65°Cで一 Bj&加温した。
ハイブリダィゼーション後、 ナイ口ン膜を 2 X SSC—0. l°/o (w/v) SDS 50mlに浸漬 し、 65°Cで 15分間加温した。 上記の洗浄操作を 2 回繰り返した後、 膜を 0. 2 X SSC-0. l°/o (w/v) SDS 50mlに浸漬し、 65°Cで 15分間加温した。 洗浄後、 ナイロン 膜を X線フィルムへ- 80°Cでニ晚暴露し現像した。
前述の制限酵素 BamHI 処理により、 野生型 FUT8対立遺伝子から約 25. 5Kb の DNA断片が生じる。 一方、 同制限酵素処理により、 ターゲティングベクターとの 相同組換えが起こった対立遺伝子から約 20. 0Kbの DNA断片が生じる。
本法により、 相同組換え領域特異的な上記約 14. 0Kbの断片のみを認めるクロー ンが見出された （第 14図） 。 本クローンを 2-46 - H10株と称す。 実施例 5. ゲノム上に存在する全ての FUT8遺伝子を破壊した CH0/DG44細胞の造 成
FUT8両対立遺伝子の翻訳開始コドンを含むゲノム領域を欠失した CH0/DG44細 胞株の造成をおこなった。
1. チャイニーズハムスター FUT8遺伝子ェクソン 2 ターゲティングベクタープラ スミ ド pK0FUT8Neoの構築
実施例 3第 1項で得たターゲティングベクタープラスミド pK0FUT8Puroの保有 するピュー口マイシン耐性遺伝子発現ュニットを以下の手順でネオマイシン耐性 遺伝子発現ユエットに置換することによって、 プラスミド PK0FUT8Neoを構築した
(第 15図) 。
プラス.ミ ド pKOSelectNeo (Lexicon社製） 1· 0 g を NEBuf f er4 (New England Biolabs社） 50 1に溶解し、 制限酵素 Ascl (New England Biolabs社) 16単位を 加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA 断片を回収した後、 100 / g/ml BSA (New England Biolabs 社） を含む NEBuffer4 (New England Biolabs社製） 50 μ 1 に溶解し、 20単位の制限酵素 AeaLKNew England Biolabs社製） を加えて 25°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 ネオマイシン耐 性遺伝子発現ュニットを含む約 1. 6Kbの DNA断片を精製した。 一方、 プラスミド pK0FUT8Puro 1. O w g を NEBuf f er4 (New England Biolabs社 製） 50 μ 1に溶解し、 制限酵素 ½£l (New England Biolabs社製） 16単位を加え て 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 pH8. 0の lmol/1 Tris- HC1緩衝 液 30 μ 1および大腸菌 C15株由来 Alkaline Phosphatase (宝酒造社製） 3· 0 μ 1 を添加し、 65°Cで 1時間反応させることにより DNA末端の脱リン酸ィヒを行った。 脱リン酸化処理後、 フヱノール /ク口口ホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行 い、 回収した DNA断片を滅菌水 ΙΟ μ Ιに溶解した。
上記で得たプラスミド pKOSelectNeo由来の Ascl- Ascl断片（約 1. 6Kb) 1. 0 μ 1、 プラスミド pK0FUT8Puro由来の Ascl- Ascl断片（約 10. 1Kb) 1. 0 μ 1、 滅菌水 3. 0 1、 Ligation High (東洋紡社製） 5. 0 ^ 1 を混合し、 16°Cで 30分間反応させる ことにより結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換し、 得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミ ド DNA を単離した。 本プラスミドを以下、 pK0FUT8Neoと称す。
2. ゲノム上の FUT8遺伝子を 1コピー破壌した CH0/DG44細胞の作製
(1) ターゲティングベクター導入株の取得
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子 （dhfr) を欠損したチャイニーズハムスター卵巣 由来 CH0/DG44 細胞 [Somatic Cel l and Moleculer Genetics, 12, 555 (1986) ] に対し、 本実施例第 1項で構築したチャイニーズハムスター FUT8ゲノム 領域ターゲティングべクタ一 pKOFUTSNeoを導入した。
プラスミド pK0FUT8Neoの CH0/DG44細胞への遺伝子導入はエレクトロポレーシ ヨン法 [サイトテクノロジー（Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ] に準じて以下の 手順で行った。 まず、 100 /z g/ml BSA (New England Biolabs 社製） を含む NEBuffer for Sail (New England Biolabs社製） 1· 2mlにプラスミド pK0FUT8Neo 280 μ gを溶解し、 400単位の制限酵素 il (New England Biolabs社製） を加えて 37°Cで 5時間消化反応を行うことにより線状ィ匕した。 該反応液に対しフエノール / クロ口ホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、 回収した線状化プラスミ ド を 1 μ 8/ μ 1水溶液とした。 一方、 CH0/DG44細胞を K- PBS緩衝液 [137mmol/l KC1、 2. 7mmol/l NaCl、 8. lmmol/1 Na2HP04、 1. 5ramol/l KH2P04、 4. 0mmol/l MgCl2] に懸 濁して 8 X 107個/ ml とした。 細胞懸濁液 200 /x l (1. 6 X 106個） を上記線状化プラ スミ ド 4 1 ( μ Ε) と混和した後、 細胞一 DNA混和液の全量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2讓）（BIO- RAD 社製） へ移し、 細胞融合装置 Gene Pulser (BI0-RAD社製） を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250 ;z F の条件で遺伝 子導入を行った。 遺伝子導入した細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血清 （Invitrogen社 製） および 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製） を添加した IMDM培地 (Invitrogen社製） に懸濁し、 接着細胞培養用 10cmデッシュ （Falcon社製） へ 播種した。 5% C02、 37°Cの条件下で 24時間培養した後、 培養上清を除去し、 600 μ g/ml G418 (ナカライテスク社製） 、 1 倍濃度の HT supplement (Invitrogen 社製） および 10% ゥシ胎児血清 （Invitrogen 社製） を添加した IMDM 培地 (Invitrogen社製） を 10ml/穴ずつ分注した。 この培地交換作業を 3〜4 日毎に繰 り返しながら 15日間の培養を行い、 G418耐性クローンを取得した。
(2) ゲノム PCRによる相同組換えの診断
本項 （1) で取得した G418耐性クローンに対し、 以下の手順でゲノム PCRによ る相同組換えの診断を行った。
96穴プレートに得た G418耐性クローンに対しトリプシン処理を行った後、 2倍 量の凍結培地 [20% DMS0、 40% ゥシ胎児血清、 40% IMDM] と混和した。 このうち 半量を接着細胞用平底 96穴プレート （旭テクノグラス社製） へ播種してレプリカ プレートとする一方、 残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。 レプリカプレートに対し、 600 μ g/ml G418 (ナカライテスク社製） 、 1倍濃度 の HT supplement (Invitroge 社製） および 10% ゥシ胎児血清（Invitrogen社 製） を添加した IMDM培地（Invitrogen社製） を用いて 1週間培養した後、 公知の 方法 [アナリティカル ·パイオケミス トリー (Analytical Biochemistry) , 201, 331 (1992) ] に従って各クローンのゲノム DNA を調製し、 各々 TE - RNase緩衝液 (pH8. 0) [I0mmol/1 Tris- HC1、 lramol/1 EDTA、 200 μ g/ml RNase A] 30 μ ΐ に一 晚溶解した。
参考例で得た FUT8ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた 部分の配列に結合するプライマー （配列番号 13 または配列番号 15) およびべク ター内配列に結合するプライマー （配列番号 14 または配列番号 16) を用いて、 以下のポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) を行った。 即ち、 上記で調製したゲノム DNA 溶液を各々 10 1 1含む 25 ^ 1 の反応液 [DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製） 、 ExTaq buffer (宝酒造社製） 、 0. 2mmol/l dNTPs、 0. 5 /x mol/l 上記遺伝子特異的プ ライマー （フォワードプライマーは配列番号 13 または配列番号 15、 リパースプ ライマーは配列番号 14または配列番号 16) ]を調製し、 94°Cで 3分間の加熱の後、 94°Cで 1分間、 60°Cで 1分間、 72°Cで 2分間からなる反応を 1サイクルとした条 件で PCRを行った。
PCR後、 反応液を 0. 8°/。(w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 CH0細胞ゲノム 領域とターグティングベクター相同領域との境界部を含む約 1. 7Kb の特異的増幅 が認められるものを陽性クローン （50-10-104) と判定した。
(3) ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断
本項 （2) で陽性が確認されたクローンに対し、 以下の手順でゲノムサザンプロ ットによる相同糸且換えの診断を行った。 '
本項 （2) で凍結保存したマスタープレートのうち、 本項 （2) で見出された陽 性クローンを含む 96穴プレートを選択し、 5% C02、 37°Cの条件下で 10分間静置 した。 静置後、 陽性クローンに該当するゥヱルから細胞を接着細胞用平底 24穴プ レート （Greiner社製） へ播種した。 600 i g/ml G418 (ナカライテスク社製） 、 1 倍濃度の HT supplement ( Invitrogen 社製） および 10% ゥシ胎児血清 (Invitrogen社製） を添加した IMDM培地（Invitrogen社製） を用いて 1週間培養 した後、 接着細胞用平底 6 穴プレート （Greiner社製） へ播種した。 該プレート より公知の方法 [ヌクレイック ·ァシッド · リサーチ（Nucleic Acids Research)， 3, 2303, (1976) ] に従って各クローンのゲノム DNA を調製し、 各々 TE-RNase緩 衝液（pH8. 0) [10mmol/l Tris— HC1、 lramol/1 EDTAヽ 200 μ g/ml RNase A] 150 1 に一晩溶解した。
100 μ g/ml BSA (New England Biolabs社製） を含む NEBuffer for BamHI (New England Biolabs社製） 120 μ 1に上記で調製したゲノム DNA 12 μ gを溶解し、 25単位の制限酵素 BamHI (New England Biolabs社製） を加えて 37°Cでー晚消化 反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断片を回収した後、 TE 緩衝液（pH8. 0) [ 10mmol/l Tris_HCl、 lmmol/1 EDTA] 20 μ 1 に溶解し、 0. 6% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供した。 泳動後、 公知の方法 [プロシーデ イングス'ォブ 'ザ'ナショナル'ァカデミ一'ォブ'サイエンス（Pro Natl. Acad. Sci. USA) , 76, 3683, (1979)に従い、 ナイロン膜へゲノム DNAを転写した。 転写 終了後、 ナイ口ン膜に対し 80°Cで 2時間の熱処理を行つた。
一方、 サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。 まず、 参考 例で得た FUT8ゲノム領域のうちターグティングベクター相同領域を越えた部分の 配列に結合するプライマー （配列番号 9 および配列番号 10) を用いて、 以下の PCRを行った。 即ち、 参考例 （2) で得たプラスミド PFUT8fgE2- 2 4. Ongを含む 20 μ ΐ の反応液 [DNA ポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製） 、 ExTaq buffer (宝酒造社 製） 、 0. 2腕 ol/l dNTPs、 0. 5 / mol/l 上記遺伝子特異的プライマー （配列番号 9 および配列番号 10) ]を調製し、 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°C で 30秒間、 74°Cで 1分間からなる反応を 1サイクルとした 25サイクルの条件で PCRを行った。 PCR後、 反応液を 1. 75% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 230bpのプローブ DNA断片を精製した。 得られたプローブ DNA溶液 5 1に対し、
[ a -32 P ] dCTP 1. 75MBq および Megaprime DNA Labelling system, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech社製） を用いて放射標識した。
ハイブリダィゼーシヨンは以下のように行った。 まず、 上記のナイロン膜を口 一ラーボトルへ封入し、 ハイブリダイゼーション液 [5 X SSPE、 50 X Denhaldt ' s 液、 0. 5°/。(w/v) SDS、 100 μ g/ml サケ精子 DNA] 15mlを加えて 65°Cで 3時間のプ レハイブリダイゼーションを行つた。 次に、 32P標識したプローブ DNAを熱変性し てボトルへ投入し、 65°Cで一晚加温した。
ハイブリダィゼーシヨン後、 ナイ口ン膜を 2 X SSC—0. l% (w/v) SDS 50mlに浸漬 し、 65°Cで 15 分間加温した。 上記の洗浄操作を 2 回繰り返した後、 膜を 0. 2 X SSC-0. l% (w/v) SDS 50mlに浸漬し、 65°Cで 15分間加温した。 洗浄後、 ナイロン 膜を X線フィルムへ- 80°Cで暴露し現像した。
前述の制限酵素 BamHI 処理により、 野生型 FUT8 対立遺伝子から約 25. 5Kb の DNA 断片が生じた。 一方、 同制限酵素処理により、 ターゲテイングベクターとの 相同糸且換えが起こった対立遺伝子から約 20. 0Kbの DNA断片が生じた。
本法により、 陽性クローン 50-10-104のゲノム DNAより上記約 25. 5Kbおよび約 20. 0Kbの特異的断片が見出された （第 16図） 。 両断片の量比が 1： 1であったこ と力 ら、 本クローンは FUT8対立遺伝子を 1コピー破壊したへミノックアウトクロ ーンであることが確認された。
3. ゲノム上の FUT8遺伝子をダブルノックアウトした CH0/DG44細胞の作製
(1) ターゲテイングベクター導入株の取得
本実施例第 2項で得た FUT8へミノックアウトクローン 50-10-104に対し、 実施 例 3第 1項で構築したチャイニーズノヽムスター FUT8ゲノム領域ターグティングべ クタ一 pK0FUT8Puroを導入した。 プラスミ ド pK0FUT8Puro の 50-10-104への遺伝子導入はエレク トロポレーショ ン法 [サイトテクノロジー（Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ] に準じて以下の手 順で行った。 まず、 100 /z g/ml BSA (New England Biolabs社製） を含む NEBuf f er for Sal I (New England Biolabs社製） 2. 4ml にプラスミド pK0FUT8Puro U0 μ g を溶解し、 800単位の制限酵素 Sail (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cで 5 時間消化反応を行うことにより線状化した。 該反応液に対しフエノール/ク口口 ホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、 回収した線状化プラスミ ドを 1 μ g/ 1 水溶液とした。 一方、 50 - 10- 104 を K-PBS 緩衝液 [ 137mraol/l KC1、 2. 7mraol/l NaCl、 8. lmraol/1 Na2HP04、 1. 5mmol/l KH2P04、 4. 0mraol/l MgClJ に懸 濁して 8 X 107個/ ml とした。 細胞懸濁液 200 i l (1. 6 X 106個） を上記線状化プラ スミ ド 4 μ 1 (4 z g) と混和した後、 細胞一DNA 混和液の全量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2讓） (BI0-RAD 社製） へ移し、 細胞融合装置 Gene Pulser (BIO- RAD社製） を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250 の条件で遺伝 子導入を行った。 遺伝子導入した細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血清 （Invitrogen社 製） および 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製） を添加した IMDM培地
(Invitrogen社製） に懸濁し、 接着細胞培養用 10cmディッシュ （Falcon社製） へ播種した。 5% C02、 37°Cの条件下で 24 時間培養した後、 培養上清を除去し、 15 μ g/ml ピューロマイシン ( SIGMA 社製） 、 1 倍濃度の HT supplement
(Invitrogen社製） および 10% ゥシ胎児血清 （Invitrogen社製） を添加した IMDM培地（Invitrogen社製） を 10mlずつ分注した。 この培地交換作業を 7日毎に 繰り返しながら 15日間の培養を行い、 薬剤耐性クローンを取得した。
(2) ゲノムサザンプロットによる相同組換えの診断
本項 （1) で得た薬剤耐性クローンに対し、 以下の手順でゲノムサザンプロット による相同組換えの診断を行った。
ピューロマイシン耐性クローンが出現した 10cmディッシュより培養上清を除 去し、 リン酸緩衝液 7ml を注入した後、 実体顕微鏡下に移した。 次にピペットマ ン （GILS0N社製） を用いてコロニーを搔き取って吸い込み、 丸底 96穴プレート
(Falcon社製） へ採取した。 トリプシン処理を行った後、 接着細胞用平底 96 穴 プレート （旭テクノグラス社製） へ各クローンを播種し、 lS x g/ml ピュー口マイ シン （SIGMA社製） 、 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製） および 10% ゥシ胎児血清 (Invitrogen社製） を添カ卩した IMDM培地（Invitrogen社製） を用い て 1週間培養した。
培養後、 上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、 接着細胞用 平底 24 穴プレート （Greiner社製） へ播種した。 lS ^ g/ml ピューロマイシン (SIGMA社製） 、 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製） および 10% ゥシ 胎児血清 （Invitrogen社製） を添加した IMDM培地（Invitrogen社製） を用いて 1 週間培養した後、 接着細胞用平底 6穴プレート （Greiner社製） へ播種した。 該 プレートより公知の方法 [ヌクレイック ·ァシッド · リサーチ（Nucleic Acids Research) , 3, 2303， (1976) ] に従って各クローンのゲノム DNA を調製し、 各々 TE-RNase緩衝液（pH8. 0) [lOmmol/1 Tris- HC1、 lmmol/1 EDTA、 200 μ g/ml RNase A] 150 μ ΐにー晚溶解した。
100 μ g/ml BSA (New England Biolabs社製） を含む NE Buffer for BamHI (New England Biolabs社製） 120 μ 1に上記で調製したゲノム DNA 12 μ gを溶解し、 25単位の制限酵素 BamHI (New England Biolabs社製） を加えて 37°Cでー晚消化 反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断片を回収した後、 TE 緩衝液（pH8. 0) [ 10mmol/l Tris - HC1、 lmmol/1 EDTA] 20 μ 1 に溶解し、 0. 6% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供した。 泳動後、 公知の方法 [プロシーデ イングス'ォブ'ザ'ナショナル'アカデミー'ォブ 'サイエンス（Pro Natl. Acad. Sci. USA) , 76, 3683， （1979)に従い、 ナイロン膜へゲノム DNAを転写した。 転写 終了後、 ナイ口ン膜に対し 80°Cで 2時間の熱処理を行った。
一方、 サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。 まず、 FUT8 ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合す るプライマー （配列番号 11および配列番号 12) を用いて、 以下の PCRを行った。 即ち、 参考例 （2) で得たプラスミド pFUT8fgE2- 2 4. Ong を含む 20 ^ 1 の反応液 [DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製） 、 ExTaq buffer (宝酒造社製） 、 0. 2匪 ol/l dNTPs、 0. 5 ηιο1/1 上記遺伝子特異的プライマー （配列番号 11 および配列番号 12) ]を調製し、 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 74°C で 1分間からなる反応を 1サイクルとした 25 サイクルの条件で PCRを行った。 PCR後、 反応液を 1. 75% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 230bpのプロ一 ブ DNA断片を精製した。 得られたプローブ DNA溶液 5 μ 1に対し、 [ひ-32 P] dCTP 1. 75MBq ぉょぴ Megaprime DNA Label l ing system, dCTP ^Amershara Pharmacia Biotech社製） を用いて放射標識した。 ハイプリダイゼーシヨンは以下のように行つ こ。 まず、 上記のナイロン膜を口 一ラーボトルへ封入し、 ハイプリダイゼーシヨン液 [5 X SSPE、 50 XDenhaldt' s 液、 0. 5% (w/v) SDS、 100 t g/ml サケ精子 DNA] 15mlを加えて 65°Cで 3時間のプ レハイブリダイゼーションを行つた。 次に、 32P標識したプローブ DNAを熱変性し てボトルへ投入し、 65°Cでー晚加温した。
ハイブリダイゼーシヨン後、 ナイ口ン膜を 2 X SSC—0. l% (w/v) SDS 50mlに浸漬 し、 65°Cで 15 分間加温した。 上記の洗浄操作を 2 回繰り返した後、 膜を 0. 2 X SSC-0. l% (w/v) SDS 50ml に浸漬し、 65°Cで 15分間加温した。 洗浄後、 ナイロン 膜を X線フィルムへ - 80。Cで暴露し現像した。
前述の制限酵素 BamHI 処理により、 野生型 FUT8 対立遺伝子から約 25. 5Kb の DNA 断片が生じる。 一方、 同制限酵素処理により、 ターゲティングベクターとの 相同組換えが起こった対立遺伝子から約 20. 0Kbの DNA断片が生じる。
本法により、 薬剤耐性クローン WK704 のゲノム DNA より相同組換え領域特異的 な約 20. 0Kbの断片のみが見出された （第 17図） 。 野生型対立遺伝子特異的断片 が消失していたこと （矢印の部分） から、 本クローンはゲノム上に存在する全て の FUT8対立遺伝子を破壊したクローンであることが確認された。
4. FUT8 遺伝子をダブルノックアウトした CH0/DG44細胞からの薬剤耐性遺伝子 の除去
(1) Creリコンビナーゼ発現ベクターの導入
本実施例第 3項で作製した FUT8ダブルノックアウトクローンのうち WK704に対 し、 Cre リコンビナーゼ発現ベクター PBS185 (Life Technologies社製） を導入し た。
プラスミ ド PBS185の各 FUT8ダブルノックァゥトクローンへの遺伝子導入はェ レク トロポレーシヨ ン法 [サイ トテク ノ ロジー（Cytotechnology)， 3, 133 (1990) ] に準じて以下の手順で行った。 まず、 各 FUT8ダブルノックアウトクロー ンを K-PBS 緩衝液 [ 137讓 ol/l KC1、 2. 7蘭 ol/l NaCl、 8. lmmol/1 Na2HP04、 1. 5ramol/l K¾P04、 4. 0mmol/l MgCl2] に懸濁して 8 X 107個/ ml とした。 細胞懸濁 液 200 1 (1. 6 X 106個） をプラスミド PBS185 4 g と混和した後、 細胞一 DNA混 和液の全量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2mm) (BIO- RAD社製） へ移し、 細 胞融合装置 Gene Pulser (BI0-RAD社製） を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250 の条件で遺伝子導入を行った。 導入後、 各細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血清 (Invitrogen社製） および 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製） を添 加した IMDM培地（Invitrogen社製） 10mlに懸濁し、 さらに同培地を用いて 2万 倍希釈した。 各希釈液を接着細胞培養用 10cmディッシュ （Falcon社製） 7枚へ 播種後、 5% C02、 37°Cの条件下で 10 日間の培養を行い、 コロニーを形成させた。
(2) Creリコンビナーゼ発現ベクター導入株の取得
WK704 に対し遺伝子導入して得たコロニーより任意のクローンを以下の手順で 採取した。 まず、 10cmディッシュより培養上清を除去し、 リン酸緩衝液 7ml を 注入した後、 実体顕微鏡下に移した。 次にピペットマン （GILS0N社製） を用いて コロニーを搔き取って吸い込み、 丸底 96穴プレート （Falcon社製） へ採取した。 トリプシン処理を行った後、 接着細胞用平底 96穴プレート （岩城硝子社製） へ各 クローンを播種し、 10% ゥシ胎児血清 （Invitrogen社製） および 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製） を添加した IMDM培地（Invitrogen社製） を用いて 1週間培養した。
培養後、 上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、 2倍量の凍 結培地 [20% DMS0、 40% ゥシ胎児血清、 40% IMDM] と混和した。 このうち半量を 接着細胞用平底 96穴プレート （岩城硝子社製） へ播種してレプリカプレートを作 製する一方、 残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。
次に、 レプリカプレートを 600 / g/ml G418 (ナカライテスタ社製） 、 15 μ g/ml ピューロマイシン （SIGMA社製） 10% ゥシ胎児血清 （Invitrogen社製） および 1 倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製） を添加した IMDM培地（Invitrogen 社製） を用いて 7日間培養した。 Creリコンビナーゼの発現により ΙοχΡ配列に挟 まれた両対立遺伝子上の薬剤耐性遺伝子が除去された陽性クローンは、 G418 およ びピューロマイシン存在下で死滅する。 本ネガティブ選択法により陽性クローン を見出した。
(3) ゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断
本項 (2) で見出された陽性クローン （4 - 5-C3) に対し、 以下の手順でゲノムサ ザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断を行った。
本項 （2) で凍結保存したマスタープレートのうち、 上記陽性クローンを含む 96穴プレートを選択し、 5% C02、 37°Cの条件下で 10分間静置した。 静置後、 上 記クローンに該当するゥエルから細胞を接着細胞用平底 24 穴プレート （Greiner 社製） へ播種した。 10% ゥシ胎児血清 （Invitrogen社製） および 1 倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製） を添加した IMDM培地（Invitrogen社製） を用い て 1週間培養した後、 接着細胞用平底 6穴プレート （Greiner社製） へ播種した。 該プレートより公知の方法 [ヌクレイック ·ァシッド · リサーチ（Nucleic Acids Research) , 3, 2303, (1976) ] に従って各クローンのゲノム DNA を調製し、 各々 TE-RNase 緩衝液（pH8. 0) [10mmol/l Tris - HC1、 lmmol/1 EDTA、 200 μ g/ml RNase A] 150 μ ΐにー晚溶解した。
100 μ g/ml BSA (New England Biolabs社製） を含む NE Buffer 2 (New England Biolabs社製） 120 μ 1に上記で調製したゲノム DNA 12 μ gを溶解し、 20単位の 制限酵素 NheI (New England Biolabs 社製） を加えて 37°Cでー晚消化反応を行 つた。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断片を回収した後、 TE緩衝液 (pH8. 0) [ 10mmol/l Tris- HC1、 lmmol/1 EDTA] 20 μ 1 に溶解し、 0. 6% (w八） ァ ガロースゲル電気泳動に供した。 泳動後、 公知の方法 [プロシーディンダス 'ォ ブ 'ザ 'ナショナノレ'アカデミー'ォブ'サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 76, 3683, (1979)に従い、 ナイロン膜へゲノム DNA を転写した。 転写終了後、 ナ ィ口ン膜に対し 80°Cで 2時間の熱処理を行った。
一方、 サザンプロットに用いるプローブを以下のように調製した。 まず、 FUT8 ゲノム領域のうちターグティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合す るプライマー （配列番号 11および配列番号 12) を用いて、 以下の PCRを行った。 即ち、 参考例 （2) で得たプラスミ ド pFUT8fgE2- 2 4. Ong を含む 20 ^ 1 の反応液 [DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製） 、 ExTaq buffer (宝酒造社製） 、 0. 2mmol/l dNTPs、 Ο. Β μ ΐΆθΙ/Ι 上記遺伝子特異的プライマー （配列番号 11 および配列番号 12) ]を調製し、 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 74°C で 1分間からなる反応を 1サイクルとした 25サイクルの条件で PCRを行った。 PCR後、 反応液を 1. 75% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 230bpのプロ一 ブ DNA断片を精製した。 得られたプローブ DNA溶液 5 μ 1に対し、 [ α -32 P] dCTP 1. 75MBq およひ Megaprime DNA Labell ing system, dCTP (Amersnam Pharmacia Biotech社製） を用いて放射標識した。
ハイブリダィゼーシヨンは以下のように行った。 まず、 上記のナイロン膜を口 一ラーボトルへ封入し、 ハイプリダイゼーション液 [5 X SSPE、 50 X Denhaldt， s 液、 0. 5% (w/v) SDS、 100 μ g/ml サケ精子 DNA] 15mlを加えて 65°Cで 3時間のプ レハイプリダイゼーションを行つた。 次に、 32P標識したプローブ DNAを熱変性し てボトルへ投入し、 65°Cでー晚加温した。
ハイブリダィゼーション後、 ナイ口ン膜を 2 X SSC—0. 1% (W/V) SDS 50mlに浸漬 し、 65°Cで 15分間加温した。 上記の洗浄操作を 2 回繰り返した後、 膜を 0. 2 X SSC-0. 1% (W/V) SDS 50mlに浸漬し、 65°Cで 15分間加温した。 洗浄後、 ナイロン 膜を X線フィルムへ- 80°Cで暴露し現像した。
前述の制限酵素 Nhel処理により、 野生型 FUT8対立遺伝子から約 8. 0Kbの DNA 断片が生じる。 また、 同制限酵素処理により、 ターゲテイングベクターとの相同 組換えが起こった対立遺伝子から約 9. 5Kbの DNA断片が生じた。 さらに、 相同組 換えが起こった対立遺伝子からネオマイシン耐性遺伝子 （約 1. 6Kb) またはピュ 一口マイシン耐性遺伝子 （約 1. 5Kb) が除去された場合には、 同処理により約 8. 0Kbの DNA断片が生じた。
本法により、 供試した陽性クローン 4 - 5- C3 (実施例 5 の 4 (3)陽性クローン）の ゲノム DNA より、 薬剤耐性遺伝子が除去された相同組換え領域特異的な約
8. 0Kb断片のみが見出された （第 18図） 。 実施例 6. FUT8対立遺伝子をダブルノックアウトした CH0/DG44細胞における抗 体分子の発現
1. 抗 CD20キメラ抗体発現ベクターの作製
(1) 抗 CD20マウスモノクローナル抗体の VLをコードする cDNAの構築
W094/11026に記載されている抗 CD20マウスモノクローナル抗体 2B8の VLのァ ミノ酸配列をコードする cDNA (配列番号 17)を PCR法を用いて以下の様にして構築 した。
まず、 W094/11026記載の VLの塩基配列の 5'末端と 3'末端に PCR反応時の增幅 用プライマーの結合塩基配列 （ヒト化抗体発現用ベクターへクロー-ングするた めの制限酵素認識配列も含む） を付加した。 設計した塩基配列を 5'末端側から約 100塩基ずつ計 6本の塩基配列に分け （隣り合う塩基配列は、 その末端に約 20塩 基の重複配列を有する様にする） 、 それらをセンス鎖、 アンチセンス鎖の交互の 順で、 実際には、 配列番号 19、 20、 21、 22、 23、 および 24の 6本の合成 DNAを 作製 (GENSET社製へ委託）した。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が 0. 1 / M となる様に、 50 し の反応液 [K0D DNA Polymerase添付 PCR Buffer #1 (東洋紡績社製） 、 0. 2raM dNTPs、 IraM塩ィ匕マ グネシゥム、 0. 5 μ Μ M13 primer M4 (宝酒造社製） 、 0. 5 / M M13 primer RV (宝 酒造社製） ]に添加し、 DNA サーマルサイクラ一 GeneAmp PGR System 9600
(Perkin Elmer社製） を用いて、 94°Cにて 3分間加熱した後、 2. 5 単位の K0D DNA Polymerase (東洋紡績社製） を添加し、 94°Cにて 30秒間、 55°Cにて 30秒間、 74°Cにて 1分間のサイクルを 25サイクル行ない、 更に 72°Cにて 10分間反応させ た。 該反応液 25 /z Lをァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製） を用いて、 約 0. 44kbの VLの PCR産物を回収した。
次に、 プラスミド pBluescriptll SK (-) (Stratagene社製） を制限酵素 Sma I
(宝酒造社製） して得られた DNA0. 1 gと、 上記で得られた PCR産物約 0. 1 ^ gを 滅菌水に加えて 7. 5 Lとし、 TAKARA ligation kit ver. 2の solution I (宝酒造 社製） 7· 5 μレ 制限酵素 ^ I (宝酒造社製） 0. 3 μ Ιを加えて 22°Cで 2時間反 応させた。 この様にして得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 α株 （東洋紡績社製） を形質転換した。 形質転換株のクローンより各プラスミ ド DNA を し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2. 0
(Applied Biosystems社製） を用いて添付の説明書に従って反応後、 同社の DNA シーケンサ ABI PRISM 377 により塩基配列を解析した。 こうして目的の塩基配列 を有する第 19図に示したプラスミ ド pBS- 2B8Lを得た。
(2) 抗 CD20マウスモノク口ーナル抗体の VHをコードする cDNAの構築
W094/11026に記載されている抗 CD20マウスモノクローナル抗体 2B8の VHのァ ミノ酸配列をコードする cDNA (配列番号 18) を PCR法を用いて以下の様にして構 築した。
まず、 TO94/11026記載の VHの塩基配列の 5'末端と 3'末端に PCR反応時の増幅 用プライマーの結合塩基配列 （ヒ ト化抗体発現用ベクターへクローニングするた めの制限酵素認識配列も含む） を付加した。 設計した塩基配列を 5'末端側から約 100塩基ずつ計 6本の塩基配列に分け （隣り合う塩基配列は、 その末端に約 20塩 基の重複配列を有する様にする） 、 それらをセンス鎖、 アンチセンス鎖の交互の 順で、 実際には、 配列番号 25、 26、 27、 28、 29、 および 30の 6本の合成 DNAを 作製 (GENSET社製へ委託）した。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が 0. 1 となる様に、 δθ μ ί の反応液 [K0D DNA Polymerase添付 PCR Buffer #1 (東洋紡績社製） 、 0. 2mM dNTPs、 ImM塩化マ グネシゥム、 0. 5 ^ Μ M13 primer M4 (宝酒造社製） 、 0. 5 μ Μ M13 primer RV (宝 酒造社製） ]に添加し、 DNA サーマルサイクラ一 GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer社製） を用いて、 94°Cにて 3分間加熱した後、 2. 5 単位の K0D DNA Polymerase (東洋紡績社製） を添加し、 94°Cにて 30秒間、 55°Cにて 30秒間、 74°Cにて 1分間のサイクルを 25サイクル行い、 更に 72°Cにて 10分間反応させた。 該反応液 25 i Lをァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製） を用いて、 約 0. 49 k bの VHの PCR産物を回収した。
次に、 プラスミド pBluescriptll SK (-) (Stratagene社製） を制限酵素 Sma I (宝酒造社製） して得られた DNA0. 1 ^ gと、 上記で得られた PCR産物約 0. 1 μ gを 滅菌水に加えて 7. 5 μ ίとし、 TAKARA ligation kit ver. 2の solution I (宝酒造 社製） 7. 5 x L, 制限酵素 ^ I (宝酒造社製） 0. 3 z L を加えて 22°Cで一晩反応 させた。
この様にして得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 a株 （東 洋紡績社製） を形質転換した。 形質転換株のクローンより各プラスミド DNA を調 製し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2. 0 (Applied Biosystems社製） を用いて添付の説明書に従って反応後、 同社の DNAシーケンサ ABI PRISM 377 により塩基配列を解析した。 こうして目的の塩基配列を有する第 20図に示したプラスミド pBS- 2B8Hを得た。
次に、 14番目のアミノ酸残基を Alaから Pro へ置換するために、 配列番号 31 で示した合成 DNA を設計し、 LA PCR in vitro Mutagenesis Primer Set for pBluescriptll (宝酒造社製） を用いた PCR法により、 以下の様に塩基の置換を行 つた。 上記のプラスミド pBS- 2B8H を lng含む 50 μ L の反応液 [LA PCR Buffer II (宝酒造社製）、 2. 5 単位の TaKaRa LA Taq、 0. 4mM dNTPs、 2. 5mM塩化マグネシ ゥム、 50nM T3 BcaBEST Sequencing primer (宝酒造社製） 、 50nM上記の変異導 入用プライマー （配列番号 31、 GENSET社製） ]を調製し、 DNAサーマルサイクラ — GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer社製） を用いて、 94°Cにて 30秒間、 55°Cにて 2分間、 72°Cにて 1分 30秒間のサイクルを 25サイクル行なった。 該反 応液 30 をァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit
(QIAGEN社製） を用いて、 約 0. 44kbの PCR産物を回収し、 30 μ Lの水溶液とした。 また、 同様に、 上記のプラスミド pBS- 2Β8Η を lng含む 50 L の反応液 [LA PCR Buffer II (宝酒造社製）、 2. 5単位の TaKaRa LA Taq、 0. 4mM dNTPs、 2. 5mM塩ィ匕マ グネシゥム、 50nM T7 BcaBEST Sequencing primer (宝酒造社製） 、 50nM MUT Bl primer (宝酒造社製) ]の PCR反応を行つた。 該反応液 30 をァガロースゲル電気 泳動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製） を用いて、 約 0. 63kb の PCR産物を回収し、 30 ;u Lの水溶液とした。 続いて、 上記で得られた 0. 44kbの PCR産物と 0. 63kb の PCR産物を 0. 5 しずつ 47· 5 μ ί の反応液 [LA PCR Buffer II (宝酒造社製）、 0. 4mM dNTPs、 2. 5raM塩化マグネシゥム]に添加し、 DNAサーマル サイクラ一 GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer社製） を用いて、 90°Cにて 10分間加熱した後、 60分間かけて 37°Cまで冷却した後、 37°Cで 15分間保持する ことによって DNA をアニーリングさせた。 2, 5 単位の TaKaRa LA Taq (宝酒造社 製） を添加して 72°Cにて 3 分間反応させた後、 lOpmol ずつの T3 BcaBEST Sequencing primer (宝酒造社製） と T7 BcaBEST Sequencing primer (宝酒造社 製） を添カ卩して反応液を 50 とし、 94°Cにて 30秒間、 55°Cにて 2分間、 72°Cに て 1分 30秒間のサイクルを 10サイクル行った。 該反応液 25 // Lを QIA quick PCR purification kit (QIAGEN社製） にて精製した後、 半量を 10単位の制限酵 素 ¾Πΐ (宝酒造社製） と 10単位の制限酵素^ I (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 0. 59kbの Kpnl-Sacl断片を回収した。
次に、 pBluescriptll SK (-) (Stratagene社製） 1 w gを 10単位の制限酵素 Kpn I (宝酒造社製） と 10単位の^ I (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応さ せた後、 該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 2. 9kb の Kpnl-Sacl 断片を回収した。
上記で得られた PCR産物由来の Kpnl-Sacl 断片とプラスミ ド pBluescriptll SK (-)由来の Kpnl-Sacl 断片を DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社製） の Solution I を用いて添付の説明書に従って連結した。 この様にして得られた組換 えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 a 株 （東洋紡績社製） を形質転換し、 形質転換株のクローンより各プラスミド DNAを調製し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2. 0 (Applied Biosystems社製) を用いて添付 の説明書に従って反応後、 同社の DNAシーケンサ ABI PRISM 377により塩基配列 を解析した。
こうして目的の塩基配列を有する第 20図に示したプラスミド pBS-2B8Hmを得た。
(3) 抗 CD20ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクター PKANTEX93 (Mol. Immunol. , 37, 1035, 2000) と本 項 （1) および （2) で得られたプラスミド PBS-2B8Lおよび PBS-2B8Hmを用いて抗 CD20 ヒト型キメラ抗体（以下、 抗 CD20 キメラ抗体と表記する）の発現ベクター PKANTEX2B8Pを以下の様にして構築した。
本項 （1) で得られたプラスミド pBS- 2B8Lの を 10単位の制限酵素 WI (New England Biolabs社製） を用いて 55°Cで 1時間反応させた後、 更に 10単位 の制限酵素^ RI (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液を ァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 0. 41kbの BsiWI-EcoRI断片を回収した。 次に、 ヒト化抗体発現用べクター pKANTEX93の 2 μ gを 10単位の制限酵素 BsiWI (New England Biolabs社製） を用いて 55°Cで 1時間反応させた後、 更に 10単位 の制限酵素 (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液を ァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 12. 75kb の BsiWI-EcoRI断片を回収した。 次に、 上記で得られたプラスミド pBS_2B8L由来 BsiWI- EcoRI断片とプラスミド PKANTEX93由来の BsiWI-EcoRI断片を DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社製） の Solution I を用いて添付の説明書に従って連結した。 この様にして得られた組換 えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 a 株 （東洋紡績社製） を形質転換し、 第 21図に示したプラスミド PKANTEX2B8- Lを得た。
次に、 本項 （2) で得られたプラスミド pBS - 2B8Hmの 2 μ §を 10単位の制限酵 素^ I (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた後、 更に 10単位の制限 酵素 l (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液をァガロー スゲル電気泳動にて分画し、 約 0. 45kbの Apal-Notl断片を回収した。
次に、 上記で得られたプラスミド pKANTEX2B8 - Lの 3 // gを 10単位の制限酵素 Aeal (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた後、 更に 10単位の制限酵 素 l (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液をァガロース ゲル電気泳動にて分画し、 約 13. 16kbの Apal-Notl断片を回収した。
次に、 上記で得られたプラスミド pBS_2B8Hm由来の Apal-Notl断片とプラスミ ド PKANTEX2B8- L 由来の Apal-Notl 断片を DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社 製） の Solution Iを用いて、 添付の説明書に従って連結した。 この様にして得ら れた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 a 株 （東洋紡績社製） を形質 転換し、 形質転換株のクローンより各プラスミド DNAを調製した。
导られ 7こフフスミ トを用レヽ、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2. 0 (Applied Biosystems社製） を同社の DNAシークェンサ一 377 を用いて塩基配列の角科斤を行った結果、 目的の DNAがクローニングされている第 21図に示したプラスミド PKANTEX2B8Pが得られたことを確認した。 2. 抗 CD20キメラ抗体の発現
実施例 5第 3項で作製した FUT8遺伝子ダブルノックアウトクローン WK704に対 し、 本実施例第 1項で得た抗 CD20抗体発現べクタ一 pKANTEX2B8Pを導入した。 プラスミ ド PKANTEX2B8Pの WK704への遺伝子導入はエレク トロポレーション法
[サイトテクノロジー（Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ] に準じて以下の手順で 行った。 まず、 プラスミ ド pKANTEX2B8P 10 μ g を NEBuffer 4 (New England Biolabs社製） 100 μ 1に溶解し、 40単位の制限酵素 Aatll (New England Biolabs 社製） を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行うことにより線状化した。 該反応液に 対しフエノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、 回収した線 状化プラスミ ドを l i g/ μ Ι 水溶液とした。 一方、 WK704 を K - PBS 緩衝液
[ 137mraol/l KC1、 2. 7nimol/l NaCl、 8. lmmol/1 Na2HP04、 1. 5蘭 ol/l K P04、 4. 0mmol/l MgCl2] に懸濁して 8 X 107個/ ml とした。 細胞懸濁液 200 1 (1. 6 X 106 個） を上記線状化プラスミド 4 z l (4/i g) と混和した後、 細胞一 DNA混和液の全 量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2mm) (BI0-RAD社製） へ移し、 細胞融合装 置 Gene Pulser (BI 0-RAD社製） を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250 μ Ρの条 件で遺伝子導入を行った。 遺伝子導入後、 細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血淸
(Invitrogen社製） および 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製） を添 加した IMDM培地 （Invitrogen社製） に懸濁し、 接着細胞培養用 T75 フラスコ
(Greiner社製） へ播種した。 5% C02、 37°Cの条件下で 24時間培養した後、 培養 上清を除去し、 10% ゥシ胎児透析血清 （Invitrogen社製） を添加した IMDM培地 (Invitrogen社製） 10ml を注入した。 この培地交換作業を 3〜4 日毎に繰り返し ながら 15 日間の培養を行い、 形質転換株 WK704 - 2B8Pを取得した。 なお、 WK704- 2B8P株は WK704- 2B8Pの株名で、 平成 15年 3月 20 日付けで独立法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1番地中央第 6) に FERM BP - 8337として寄託されている。
3. 抗ガングリオシド GD3キメラ抗体の発現
実施例 5第 3項で作製した FUT8遺伝子ダブルノックアウトクローン WK704に対 し、 抗ガングリオシド GD3キメラ抗体発現ベクタープラスミド pKANTEX641を導入 し、 抗 GD3キメラ抗体の安定的発現株を作製した。 PKANTEX641は、 TO00/61739記 載の抗 GD3キメラ抗体発現ベクタープラスミド pChi641LHGM4およびヒト化抗体発 現用ベクター PKANTEX93 [モレキュラー ' ィムノロジー （Mol. Immunol. ) ， 37, 1035 (2000) ] より構成された誘導体であり、 pChi641LHGM4 より得たタンデム 型抗体発現ュ-ットを含む EcoRI-HindHI断片を PKANTEX93より得た複製起点を 含む EcoRI- Hindlll断片へ連結したものである。
プラスミ ド pKANTEX641 の WK704 への遺伝子導入はエレク トロポレーシヨン法
[サイトテクノロジー（Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ] に準じて以下の手順で 行った。 まず、 プラスミ ド pKANTEX641 10 g を NEBuJffer 4 (New England Biolabs社製） 100 μ 1に溶解し、 40単位の制限酵素 Aatll (New England Biolabs 社製） を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行うことにより線状ィ匕した。 該反応液に 対しフエノール/クロロホルム抽出処理おょぴエタノール沈殿を行い、 回収した線 状化プラスミ ドを 水溶液とした。 一方、 WK704 を K - PBS 緩衝液
[ 137mmol/l KC1、 2. 7mmol/l NaCl、 8. lmmol/1 Na2HP0い 1. 5mmol/l KH2P04、 4. 0mmol/l MgCl2] に懸濁して 8 X 107個/ ml とした。 細胞懸濁液 200 // 1 (1. 6 X 106 個） を上記線状化プラスミド 4 μ 1 (4 ^ g) と混和した後、 細胞一DNA混和液の全 量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2ram) (BI0-RAD社製） へ移し、 細胞融合装 置 Gene Pulser (BIO- RAD社製） を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250 ^i Fの条 件で遺伝子導入を行った。 遺伝子導入後、 細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血清
(Invitrogen社製） および 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製） を添 加した IMDM培地 （Invitrogen社製） に懸濁し、 接着細胞培養用 T75 フラスコ
(Greiner社製） へ播種した。 5% C02、 37°Cの条件下で 24時間培養した後、 培養 上清を除去し、 10% ゥシ胎児透析血清 （Invitrogen社製） を添加した IMDM培地 (Invitrogen社製） 10mlを注入した。 この培地交換作業を 3〜4 日毎に繰り返し ながら 15 日間の培養を行い、 形質転換株 WK704- 2871 を取得した。 なお、 WK704- 2871株は WK704-2871 の株名で、 平成 15年 3月 20 日付けで独立法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば巿東 1 丁目 1番地中央第 6) に FERM BP- 8336として寄託されている。
4. 抗 CCR4キメラ抗体の発現
実施例 5第 3項で作製した FUT8遺伝子ダブルノックアウトクローン WK704に対 し、 TO01/64754記載の抗 CCR4キメラ抗体発現ベクター pKANTEX2160を導入し、 抗 CCR キメラ抗体の安定的発現株を作製した。 プラスミ ド pKANTEX2B8P の WK704への遺伝子導入はエレク トロポレーション法 [サイトテクノロジー（Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ] に準じて以下の手順で 行った。 まず、 プラスミ ド pKANTEX2160 15 g を NEBuffer 4 (New England Biolabs社製） 100 μ 1に溶解し、 40単位の制限酵素 Aatll (New England Biolabs 社製） を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行うことにより線状ィヒした。 該反応液に 対しフエノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、 回収した線 状化プラスミ ドを l i g/ μ Ι 水溶液とした。 一方、 WK704 を K- PBS 緩衝液
[ 137藤 ol/l KC1 、 2. 7mmol/l NaCl 、 8. lmmol/1 Na2HP04、 1. 5mmol/l KH2P04、
4. Ommol/1 MgCl2] に懸濁して 8 X 107個/ ml とした。 細胞懸濁液 200 / 1 (l. 6 X 106 個） を上記線状化プラスミド 4 μ 1 ( iu ) と混和した後、 細胞一 DNA混和液の全 量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2mm) (BI0-RAD社製） へ移し、 細胞融合装 置 Gene Pulser (BIO- RAD社製） を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250 Fの条 件で遺伝子導入を行った。 遺伝子導入後、 細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血清
(Invitrogen社製） および 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製） を添 加した IMDM培地 （Invitrogen社製） に懸濁し、 接着細胞培養用 T75 フラスコ
(Greiner社製） へ播種した。 5% C02、 37°Cの条件下で 24時間培養した後、 培養 上清を除去し、 10% ゥシ胎児透析血清 （Invitrogen社製） を添加した IMDM培地 (Invitrogen社製） 10ml を注入した。 この培地交換作業を 3〜4 日毎に繰り返し ながら 15 日間の培養を行い、 形質転換株 WK704- 2760を取得した。 なお、 WK704 - 2760株は WK704- 2760の株名で、 平成 15年 3月 20 日付けで独立法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1番地中央第 6) に FERM BP - 8335として寄託されている。
5. 抗体分子の精製
本実施例第 2項で得た抗 CD20抗体発現株 WK704-2B8Pを、 10% ゥシ胎児透析血 清 （Invitrogen社製） を添加した IMDM培地（Invitrogen社製） へ 3 X 105個/ mlの 密度で懸濁後、 接着細胞培養用 T182フラスコ （Greiner社製） 10本へ計 300ml播 種した。 同様にして、 本実施例第 3項で得た抗 GD3抗体発現株 WK704-2871および 本実施例第 4項で得た抗 CCR4抗体発現株 WK704-2760を播種した。 3 日間の培養 後、 各株の上清全量を除去し、 EXCELL301培地 （JRH Biosciences社製） へ交換し た。 これらを 37°Cの 5% C02インキュベーター内で 7 日間培養後、 各細胞懸濁液 を回収した。 回収した各細胞懸濁液に対し 3000rpm、 4°Cの条件で 10分間の遠心 分離を行って上清を回収した後、 0. 22 μ πι孔径 500ml容 PES Membrane (旭テクノ グラス社製） を用いて濾過した。
0. 8cm径のカラムに Mab Select (Araersham Pharmacia Biotech社製) 0. 5ml を 充填し、 精製水 3. 0ml および 0. 2mol/l ホウ酸一 0. 15mol/l NaCl 緩衝液
(pH7. 5) 3. 0ml を順次通筒した。 さらに、 0. lmol/1 クェン酸緩衝液 (pH3. 5) 2. 0mlおよび 0, 2mol/l ホウ酸一 0. 15mol/l NaCl緩衝液 (pH7. 5) 1. 5mlで順次洗 浄することによって担体の平衡化を行った。 次に、 上記培養上清 300ml をカラム に通筒した後、 0. 2mol/l ホウ酸一 0. 15mol/l NaCl緩衝液 （pH7. 5) 3. 0ml で洗浄 した。 洗浄後、 0. lmol/1 クェン酸緩衝液 (pH3. 5) 1. 25ml を用いて担体に吸着し た抗体の溶出を行った。 初めに溶出する 250 μ 1の画分を廃棄し、 次に得られる溶 出画分 1ml を回収して 2mol/l Tris-HCl (pH8. 5) 200 ^ 1 と混合して中和した。 取 得した溶出液に対し、 lOmol/1 クェン酸一 0. 15mol/l NaCl 緩衝液 （pH6. 0) を用 いて 4 °Cで一昼夜透析を行った。 透析後、 抗体溶液を回収し、 0. 22 μ m 孔径 Millex GV (MILLIP0RE社製） を用いて滅菌濾過した。 実施例 7. FUT8対立遺伝子をダブルノックアウトした CH0/DG44細胞が産生する 抗体組成物の in vitro細胞障害活性 （ADCC活性）
実施例 6で精製した抗 CD20抗体の in vitro細胞障害活性を評価するため、 以 下の記述に従い ADCC活性を測定した。
(1) 標的細胞溶液の調製
RPMI1640- FCS (10) 培地（FCSを 10%含む RPMI1640培地（GIBC0 BRL社製））で培 養したヒト Bリンパ球培養細胞株 Raji細胞 (JCRB9012)を遠心分離操作および懸濁 により RPMI1640- FCS (5)培地 （FCSを 5%含む RPMI1640培地（GIBC0 BRL社製）） で 洗浄した後、 RPMI1640- FCS (5) 培地によって、 2 X 105細胞/ mL に調製し、 標的細 胞溶液とした。
(2) エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血 50mLを採取し、 へパリンナトリウム （清水製薬社製） 0. 5mLを加 え穏やかに混ぜた。 これを Lymphoprep (AXIS SHIELD社製） を用いて使用説明書 に従い、 遠心分離 （800g、 20分間） して単核球層を分離した。 RPMI1640-FCS (5) 培地で 3回遠心分離して洗浄後、 同培地を用いて 4 X 106細胞/ mLの濃度で再懸濁 し、 ェフエクタ一細胞溶液とした。
(3) ADCC活性の測定
96 ゥヱル U字底プレート （Falcon社製） の各ゥエルに上記 （1) で調製した 標的細胞溶液の 50 W L (1 X 104細胞/ゥエル） を分注した。 次いで上記 （2) で調 製したエフェクター細胞溶液を 50 (2 X 105細胞/ゥエル、 エフェクター細胞と 標的細胞の比は 20 : 1 となる） 添加した。 更に、 各種抗 CD20キメラ抗体を各最終 濃度 0. 3〜3000ng/mLとなるように加えて全量を 150 z Lとし、 37°Cで 4時間反応 させた。 反応後、 プレートを遠心分離し、 上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH)活 性を、 CytoTox96 NoN- Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega社製） を用い て測定した。 標的細胞自然遊離 LDH量は、 エフェクター細胞溶液、 抗体溶液の代 わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、 上清の LDH活性を測定するこ とにより求めた。 エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、 標的細胞溶液、 抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、 上記と同様の操作を行うことで取得した。 全標的細胞破壊にともなう全遊離 LDH量は、 抗体溶液、 ェフエクタ一細胞溶液の 代わりに培地を用い、 反応終了 45分前に の 9% Triton X- 100溶液を添加 し、 上記と同様の操作を行い、 上清の LDH活性を測定することにより求めた。 こ れらの値を用いて下式 （II) により、 ADCC活性を求めた。
(検体上清中の LDH量） 一 （自然遊離 LDH量）
ADCC活性（％) = X 100 (II)
(全遊離 LDH量） 一 （自然遊離 LDH量） 第 22図に各抗 CD20抗体の ADCC活性を示した。 FUT8遺伝子ダブルノックァゥ トクローン WK704-2B8P より得た抗体は、 いずれの抗体濃度においても市販 Rituxan™より高い ADCC活性を示し、 最高細胞障害活性値も高かった。 Rituxan™ は、 FUT8遺伝子が破壊されていない CH0細胞を宿主細胞として製造された抗 CD20 キメラ抗体である。 また、 FUT8遺伝子ダブルノックアウトクローン WK704-2871 株、 WK704- 2760株より得たそれぞれの抗体に関して ADCC活性を測定したところ、 抗 CD20抗体の場合と同様に、 FUT8遺伝子が破壊されてない通常の CH0細胞株が 産生する抗体に比べて高い細胞障害活性を示した。 以上の結果より、 FUT8対立遺 伝子を破壊した宿主細胞を用いることにより、 FUT8遺伝子が破壊されていない宿 主細胞を用いた場合より、 細胞障害活性の高い抗体の生産が可能となることが分 かった。 実施例 8. FUT8対立遺伝子をダブルノックアウトした CH0/DG44細胞が産生する 抗体組成物の糖鎖解析
実施例 6 で取得した、 FUT8遺伝子ダブルノックァゥトクローンが生産した抗 CD20抗体、 抗 GD3抗体おょぴ抗 CCR4抗体の糖鎖解析を実施例 2. (4) に記載の 方法に従って行った。 また、 これら抗体の糖鎖の組成に関して単糖組成分析を、 公知の方法 [ジャーナル ·ォブ · リキッド 'クロマトグラフィー（Journal of Liquid Chromatography) , 6, 1577, (1983) ] に従って行った。 その結果、 FUT8 遺伝子ダブルノックアウトクローン WK704 より得たいずれの抗体においても、 フ コースを含有する糖鎖構造は確認されなかった。 以上の結果より、 宿主細胞の FUT8対立遺伝子を破壌することにより、 Ν -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する機能を完全に欠失 させることが可能であることを明らかとなった。 参考例 CH0細胞 FUT8遺伝子の取得
(1) CH0細胞 FUT8 cDNA配列の取得
000/61739の実施例 8 (1) の記載に基づき、 培養 2 日目の CH0/DG44細胞より 調製した一本鎖 cDNAより、 以下の手順でチャイニーズハムスター FUT8 cDNAを取 得した （第 23図)。
まず、 マウス FUT8の cDNA配列 (GenBank, AB025198) より、 5'側非翻訳領域に 特異的なフォワードプライマー （配列番号 7に示す） および 3'側非翻訳領域に特 異的なリバースプライマー (配列番号 8に示す）を設計した。
次に DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製） を用いて、 前述の CH0/DG44細胞由 来 cDNA 1 μ 1 を含む 25 μ 1 の反応液 [ExTaq buffer (宝酒造社製）、 0. 2mmol/l dNTPs、 4%DMS0、 0. 5 μ ηιο1/1 上記特異的プライマー （配列番号 7および配列番号 8) ] を調製し、 PCRを行った。 PCRは、 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 2分間からなる反応を 1サイクルとして 30サイクルの後、 さらに 72°Cで 10分間加熱する条件で行った。
PCR後、 反応液を 0. 8%ァガロースゲル電気泳動に供し、 特異的増幅断片約 2Kb を精製した。 この DNA断片 4 μ 1を、 T0P0 TA cloning Kit (Invitrogen社製） の 細 07 説明書に従ってプラスミド PCR2. 1へ揷入し、 該反応液を用いて大腸菌 DH5ひ株を 形質転換した。 得られたカナマイシン耐性コロニーのうち cDNAが組み込まれた 8 クローンから、 公知の方法に従って各々プラスミド DNAを単離した。
各プラスミ ドに揷入された cDNA の塩基配列は、 DNA シークェンサ一 377 (Parkin Elmer 社製) ぉょぴ BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Parkin Elmer社製） を使用して決定し、 方法は添付マニュアルに 従った。 本法により、 全ての挿入 cDNA力 CH0細胞 FUT8の 0RF全長を含む配列 をコードすることを確認した。 このうち PCR に伴う塩基の読み誤りを該配列内に 全く含まないプラスミド DNAを選択した。 以下、 本プラスミドを CHfFUT8- pCR2. 1 と称す。 決定した CH0細胞 FUT8 cDNAの塩基配列を配列番号 1に示した。 また、 そのアミノ酸配列を配列番号 4に示した。
(2) CH0細胞 FUT8ゲノム配列の取得
本項 （1) で取得した CH0細胞 FUT8 0RF全長 cDNA断片をプローブとして用い、 CH0-K1 細胞由来 λ -ファージゲノムライプラリー （STRATEGENE社製） よりモレキ ユラ一 ·クローニング第 2版、 力レント ·プロトコ一ルス、 'イン 'モレキユラ 一 ·バイオロジー、 A Laboratory Manual, 2 nd Ed. (1989) 等に記載の公知のゲ ノムスクリーユングの方法に従い CH0細胞 FUT8ゲノムクローンを取得した。 次に、 取得したゲノムクローンを各種制限酵素を用いて消化後、 CH0細胞 FUT8 cDNAの 開始コドンを含む AfaI-Sau3AI 断片 （約 280bp) をプローブとしてサザンハイブ リダィゼーシヨンを行い、 陽性を示した制限酵素断片のうち 断片 （約 2. 5Kb) および Sacト Sacl 断片 （約 6. 5Kb) を選択して pBluescriptll KS (+) (Strategene社製） へ各々挿入した。
取得した各ゲノム断片の塩基配列は、 DNAシークェンサ一 377 (Parkin Elmer社 製) および BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Parkin Elmer社製） を用いて決定し、 方法は添付マニュアルに従った。 本法に より、 Xbal- Xbal 断片は CH0細胞 FUT8 のェクソン 2 を含む上流ィントロン約 2. 5Kbの配列を、 Sacl-Sacl断片は CH0細胞 FUT8のェクソン 2を含む下流ィント ロン約 6. 5Kb の配列を各々コードすることを確認した。 以下、 Xbal-Xbal 断片を 含むプラスミドを PFUT8fgE2- 2、 Sacl-Sacl断片を含むプラスミドを pFUT8fgE2- 4 と称す。 決定した CH0細胞 FUT8のェクソン 2を含むゲノム領域の塩基配列 （約 9. 0Kb) を配列番号 3に示した。 産業上の利用可能性
本発明は、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1 位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または 欠失するようにゲノムが改変された細胞、 該細胞を用いた抗体組成物の製造方法、 該細胞を用いて作製されたトランスジエニック非ヒト動物あるいは植物、 該製造 方法により製造された抗体組成物およぴ抗体組成物を含有する医薬を提供するこ とができる。 配列表フリーテキスト
配列番号 7—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 8—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 9一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 10—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 11一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 12—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 13—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 14一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 15—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 16—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 19一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 20—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 21—人工配列の説明 合成腿
配列番号 22—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 23—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 24—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 25—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 26—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 27—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 28—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 29—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 30—人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 31—人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請 求 の 範 囲
1. N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親株細胞よりも 低下または欠失するようにゲノムが改変された細胞。
2. N-グリコシド結合複合型糠鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に フコースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックァ ゥトされた、 請求の範囲 1記載の細胞。
3. Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位に フコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子の すべてがノックアウトされた請求の範囲 1または 2に記載の細胞。
4. Ν-グリコシド結合複合型糠鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位に フコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、 oi l, 6 -フコシルトラン スフエラーゼである、 請求の範囲 1〜3のいずれか 1項に記載の細胞。
5. α 1, 6-フコシルトランスフェラーゼが、 以下の （a)、 (b)ヽ (c)および (d)か らなる群から選ばれる DNAがコードする蛋白質である、 請求の範囲 4に記載の細 胞。
(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA；
(c) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジヱントな条件 でハイブリダイズし、 かつ α 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白 質をコードする DNA；
(d) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件 でハイブリダイズし、 かつ a l， 6 -フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白 質をコードする DNA。
6. a l， 6-フコシルトランスフェラーゼが、 以下の （a)、 （b)、 （c)、 （d)、 (e) および （f) からなる群から選ばれる蛋白質である、 請求の範囲 4に記載の細胞。
(a) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号 5で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(c) 配列番号 4 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ《1， 6 -フコシ ルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質； (d) 配列番号 5 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ a l，6 -フコシ ルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(e) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ α 1， 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(f) 配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ α 1， 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
7. Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である、 請求 の範囲 1〜6のいずれか 1項に記載の細胞。
8. 少なくとも、 以下の（a)、 （b)、 （c)および (d)からなる群から選ばれるレク チンの一つに耐性である、 請求の範囲 7記載の細胞。
(a) レンズマメレクチン；
(b) ェンドウマメレクチン；
(c) ソラマメレクチン；
(d) ヒィロチャワンタケレクチン。
9. 細胞が、 下記の （a)〜（j) からなる群から選ばれる細胞である、 請求の範 囲 1〜8のいずれか 1項に記載の細胞。
(a) チャイニーズハムスター卵巣組織由来 CH0細胞；
(b) ラットミエロ一マ細胞株 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞；
(c) マウスミエ口一マ細胞株 NS0細胞；
(d) マウスミエ口一マ細胞株 SP2/0- Agl4細胞；
(e) シリアンハムスター腎臓組織由来 BHK細胞；
(f) 抗体を生産するハイプリ ドーマ細胞；
(g) ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
(h) 胚性幹細胞；
(i) 受精卵細胞；
(j) 植物細胞。
10. 抗体分子をコードする遺伝子を含む請求の範囲 1〜9のいずれか 1項に記 載の細胞。
11. 抗体分子が、 以下の（a)、 （b)、 （c)および (d)からなる群から選ばれる抗 体分子である、 請求の範囲 10に記載の細胞。 (a) ヒト抗体；
(b) ヒト化抗体；
(c) (a)または (b)の Fc領域を含む抗体断片；
(d) (a)または (b)の Fc領域を有する融合蛋白質。
12. 抗体分子のクラスが IgGである、 請求の範囲 10または 11に記載の細胞。
13. 親株細胞が生産する抗体組成物より、 抗体依存性細胞障害活性が高い抗 体組成物を生産する能力を有する、 請求の範囲 1〜12のいずれか 1項に記載の細 胞。
14. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糠鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、 親株細胞が生産 する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、 請求の範囲 13に記載の細胞。
15. フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N-ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に α結合していない糖鎖 である、 請求の範囲 14に記載の細胞。
16. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 20%以上である抗 体組成物である、 請求の範囲 13〜： 15のいずれか 1項に記載の細胞。
17. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 糖鎖還元末端の N-ァセチ ルダルコサミンとフコースが結合している糖鎖を有しなレ、抗体組成物である、 請 求の範囲 13〜16いずれか 1項に記載の細胞。
18. 請求の範囲 10〜17のいずれか 1項に記載の細胞を用いること特徴とする、 抗体組成物を製造する方法。
19. 請求の範囲 10〜18のいずれか 1項に記載の細胞を培地に培養し、 培養物 中に抗体組成物を生成蓄積させ、 該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、 抗体組成物を製造する方法。
20. 抗体組成物が親株細胞が生産する抗体組成物よりも、 抗体依存性細胞障 害活性が高い抗体組成物である、 請求の範囲 18または 19に記載の方法。
21. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N -ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、 親株細胞が生産 する抗体組成物より高いことを特徴とする、 請求の範囲 20に記載の方法。
22. フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N-グリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位にひ結合していない糖鎖 である、 請求の範囲 21に記載の方法。
23. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N -グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 20%以上である抗 体組成物である、 請求の範囲 20〜22のいずれか 1項に記載の方法。
24. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 糖鎖還元末端の N-ァセチ ルダルコサミンとフコースが結合している糖鎖を有しない抗体組成物である、 請 求の範囲 20〜23いずれか 1項に記載の方法。
25. 請求の範囲 1〜9のいずれかに記載の細胞を用いて作製された、 トランス ジェニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
26. トランスジヱニック非ヒ ト動物が、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 ニヮトリ、 サルおよびゥサギからなる群から選ばれる動物であ る、 請求の範囲 24に記載のトランスジヱニック非ヒト動物、 またはその子孫。
27. 抗体分子をコードする遺伝子を導入した請求の範囲 25または 26に記載 のトランスジエニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
28. 抗体分子が、 以下の（a)、 （b)、 （c)および（d)からなる群から選ばれる抗 体分子である、 請求の範囲 27に記載のトランスジヱニック非ヒト動物あるいは植 物、 またはその子孫。
(a) ヒト抗体；
(b) ヒト化抗体；
(c) (a)または (b)の Fc領域を含む抗体断片；
(d) (a)または (b)の Fc領域を有する融合蛋白質。
29. ■ 抗体分子のクラスが IgGである、 請求の範囲 27または 28に記載のトラ ンスジエニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
30. 請求の範囲 27〜29のいずれか 1項に記載のトランスジヱニック非ヒト動 物あるいは植物を飼育し、 飼育した動物あるいは植物から導入した抗体組成物を 含む組織あるいは体液を取得し、 該組織あるいは体液から抗体組成物を採取する 工程を含む、 抗体組成物を製造する方法。
31. 請求の範囲 26〜29のいずれか 1項に記載のトランスジエニック非ヒト動 物あるいは植物、 またはその子孫の抗体生産細胞を取得し、 取得した抗体生産細 胞を培地に培養し、 培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、 該培養物から抗体組 成物を採取する工程を含む、 抗体組成物を製造する方法。
32. 抗体組成物が、 ゲノムが改変されていない非ヒト動物あるいは植物、 ま たはその子孫から得られる抗体組成物よりも、 抗体依存性細胞障害活性が高い抗 体組成物である、 請求の範囲 30または 31に記載の方法。
33. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、 ゲノムが改変さ れていない非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫から得られる抗体組成物よ り高いことを特徴とする、 請求の範囲 32に記載の方法。
34. フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N -ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に a結合していない糖鎖 である、 請求の範囲 33に記載の方法。
35. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糠鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していない糠鎖の割合が 20%以上である抗 体組成物である、 請求の範囲 32〜34のいずれか 1項に記載の方法。
36. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 糖鎖還元末端の N-ァセチ ルダルコサミンとフコースが結合している糖鎖を有しなレ、抗体組成物である、 請 求の範囲 32〜35いずれか 1項に記載の方法。
37. N -ダリコシド結合型糖鎖を Fc領域に有する抗体分子からなる抗体組成物 であって、 該抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全ダリコシド結合複合型 糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダリコサミンにフコースが結合していな V、糖鎖を有する抗体組成物。
38. フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N-グリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に α結合していない糖鎖 である、 請求の範囲 37記載の抗体組成物。
39. 請求の範囲 18〜24のいずれか 1項に記載の方法を用いて製造される抗体 組成物。
40. 請求の範囲 27〜36のいずれか 1項に記載の方法を用いて製造される抗体 組成物。
41. 請求の範囲 37〜40のいずれか 1項に記載の記載の抗体組成物を有効成分 として含有する医薬。
42. 医薬が、 腫瘍を伴う疾患、 アレルギーを伴う疾患、 炎症を伴う疾患、 自 己免疫疾患、 循環器疾患、 ウィルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に 対する診断薬、 予防薬または治療薬である、 請求の範囲 41に記載の医薬。
43. 請求の範囲 41または 42に記載の医薬を製造するための、 請求の範囲 37 〜40のいずれか 1項に記載の抗体組成物の使用。
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