WO2004062693A1 - 遺伝子治療用ベクター及び該遺伝子治療用ベクターを投与された哺乳動物中又は培養細胞中の目的タンパク質の定量方法 - Google Patents

遺伝子治療用ベクター及び該遺伝子治療用ベクターを投与された哺乳動物中又は培養細胞中の目的タンパク質の定量方法

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target protein
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Definitions

  • Gene therapy vector and method for quantifying target protein in mammals or cultured cells to which the gene therapy vector has been administered are provided.
  • the present invention relates to a vector for gene therapy for producing a target protein in a living body, which can easily quantify the target protein produced in a living body or cultured cells.
  • the blood concentration of the target protein can be established if measurement methods are established for that protein, such as ELISA. If not, the concentration cannot be measured. Therefore, an Atsey method for measuring the protein concentration using a labeled protein has been commercialized and sold. However, the sensitivity of this measurement is low, and there is no established method for measuring blood concentration in gene therapy (Ref.Treatment of Murine Lupus with cDNA encoding I FN—rR Fc, The Journal of Clinical Investigation, July 2000, volume 106, Number 2 p207-215) quantifies the affected protein without measuring the target protein and indirectly proves the expression of the target protein. This is thought to indicate the difficulty of measuring blood levels.
  • An object of the present invention is to provide a gene therapy vector that can monitor the blood concentration of a target protein in gene therapy with high sensitivity and hardly cause unwanted physiological action or antigen-antibody reaction due to labeling. It is to provide.
  • the inventors of the present invention found that a gene containing a target protein to be produced in the body by gene therapy and a nucleic acid encoding a fusion protein of the 19-29 amino acid peptide at the C-terminal side of glucagon were inserted into the vector.
  • the concentration of the target protein in the blood can be measured with high sensitivity using the above-mentioned glucagon peptide as a label, and the expression of undesired physiological effects and the induction of an immune response caused by the labeled peptide can be achieved.
  • the present invention has a structure in which a nucleic acid encoding a fusion protein of a C-terminal 19-129 amino acid peptide region of glucagon and a target protein region to be produced in the body is incorporated into a mammalian cell expression vector, It is intended to provide a gene therapy vector capable of producing the fusion protein in mammalian cells.
  • the present invention also provides a method for gene therapy, comprising: administering an effective amount of the vector for gene therapy of the present invention to a mammal or a cultured mammalian cell in which expression of the target protein in vivo or in cells is desired. I do.
  • the present invention provides the use of the above-described gene therapy vector of the present invention for the production of a gene therapy drug. Furthermore, the present invention provides an immunoassay for a glucagon C-terminal 19-29 amino acid peptide region in a test sample collected from a mammal or a cultured mammalian cell to which the gene therapy vector of the present invention has been administered. And a method for quantifying the target protein produced in vivo or in cultured mammalian cells by expression of the gene therapy vector.
  • the present invention provides a method for labeling a target protein produced by expression of an externally administered expression vector in a mammal or a cultured mammalian cell, comprising a 19-29 amino acid peptide at the C-terminal side of glucagon. Provide the agent.
  • the present invention relates to the fusion of a target protein produced by the expression of an externally administered expression vector in the body of a mammal or cultured mammalian cells with a glucagon C-terminal 19-29 amino acid peptide as a labeling agent
  • a target protein produced by the expression of an externally administered expression vector in the body of a mammal or cultured mammalian cells with a glucagon C-terminal 19-29 amino acid peptide as a labeling agent
  • the target peptide produced in the body or in cultured cells is labeled with 19-29 amino acid peptide on the C-terminal side of glucagon, and is produced in the body or in cultured cells.
  • Methods for labeling proteins are provided.
  • the present invention provides a labeling agent for a target protein produced by expression of an expression vector, which is administered externally in a mammal or cultured mammalian cells, of a 19-29 amino acid peptide at the C-terminal side of glucagon. Provide for use.
  • the present invention provides, for the first time, a gene therapy vector capable of measuring the blood concentration of a target protein with high sensitivity without the labeled peptide having a physiological effect.
  • the C-terminal side 19-29 of glucagon has no physiological action by itself and is well conserved in various mammals, so it does not substantially elicit an immune response, Quantification can be performed by immunoassay with high sensitivity using a commercially available immunoassay kit.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of an inserted nucleic acid fragment inserted into the vector for gene therapy prepared in Example 1, together with the amino acid sequence encoded by the fragment.
  • FIG. 2 is a diagram showing a continuation of FIG.
  • FIG. 3 is a diagram showing a continuation of FIG.
  • FIG. 4 is a gene map of pGAGGS, which is a mammalian expression vector used in Examples 1 to 5.
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between the number of days after administration of a gene therapy vector and the blood concentration of a target protein measured by measuring a glucagon-derived labeled peptide in Example 1.
  • FIG. 6 shows the concentration of the target protein in blood when gene therapy was performed using the vector of the present invention, the case where gene therapy was performed using the vector of the present invention, and the glucagon-derived protein measured in Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing a change over time in blood glucose level when gene therapy is performed using a vector into which a nucleic acid encoding a target protein not fused with a labeled peptide is inserted.
  • FIG. 7 is a diagram showing the nucleotide sequence of the inserted nucleic acid fragment inserted into the gene therapy vector prepared in Example 2, together with the amino acid sequence encoded by the fragment.
  • FIG. 8 is a diagram showing a continuation of FIG.
  • FIG. 9 is a diagram showing a continuation of FIG.
  • FIG. 10 is a graph showing the relationship between the number of days after administration of a gene therapy vector and the blood concentration of a target protein measured by measuring a glucagon-derived labeled peptide in Example 2.
  • FIG. 11 is a diagram showing the number of days of engraftment of rat transplanted hearts in Example 2 and Comparative Example 2.
  • FIG. 12 is a diagram showing the nucleotide sequence of the inserted nucleic acid fragment inserted into the vector for gene therapy prepared in Example 3, together with the amino acid sequence encoded thereby.
  • FIG. 13 is a diagram showing a continuation of FIG.
  • FIG. 14 is a diagram showing a continuation of FIG. 13.
  • FIG. 15 is a diagram showing the nucleotide sequence of the inserted nucleic acid fragment inserted into the vector for gene therapy prepared in Comparative Example 3, together with the amino acid sequence encoded thereby.
  • FIG. 16 is a diagram showing a continuation of FIG.
  • FIG. 17 is a diagram showing the relationship between the number of days after administration of the gene therapy vector and the blood concentration of the target protein measured by measuring the glucagon-derived labeled peptide in Example 3.
  • FIG. 18 is a diagram showing an area ratio of a myocarditis lesion site in a rat in Example 3 and Comparative Example 3.
  • FIG. 19 is a view showing the nucleotide sequence of the inserted nucleic acid fragment inserted into the vector for gene therapy prepared in Example 4 together with the amino acid sequence encoded by the nucleic acid fragment.
  • FIG. 20 is a view illustrating a sequel to FIG.
  • FIG. 21 is a diagram showing a continuation of FIG. 20.
  • FIG. 22 is a graph showing the relationship between the number of days after administration of a gene therapy vector and the blood concentration of a target protein measured by measuring a glucagon-derived labeled peptide in Example 4.
  • FIG. 23 is a diagram showing an area ratio of a myocarditis lesion site in a rat in Example 4 and Comparative Example 4.
  • FIG. 24 is a diagram showing the nucleotide sequence of the inserted nucleic acid fragment inserted into the vector for gene therapy prepared in Example 5, together with the amino acid sequence encoded by the fragment.
  • FIG. 25 shows the blood concentration of the target protein measured by measuring the glucagon-derived labeled peptide and the blood concentration of the target protein measured by measuring human interleukin 8 in Example 5.
  • FIG. 3 is a diagram showing a correlation with a concentration.
  • the 19-29 amino acid peptide J at the C-terminal side of glucagon which is expressed by fusion with the target protein by the vector of the present invention, is the total of the 19th to 29th amino acids counted from the C-terminus of glucagon.
  • 11 means a peptide consisting of one amino acid. That is, this peptide is a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Since the “19-29 amino acid peptide j on the C-terminal side of glucagon is used as a label for the target protein, it may be referred to as“ glucagon-derived labeled peptide J ”for convenience.
  • the vector of the present invention incorporates a nucleic acid encoding a fusion protein of a glucagon-derived labeled peptide region and a target protein region.
  • Expression vectors for mammalian cells used in the present invention are well known in the field of gene therapy, and are not limited as long as they are expression vectors for mammalian cells.
  • the feature of the present invention lies in that a glucagon-derived labeled peptide region as a label of a target protein is expressed by fusing it with a target protein, and the expression vector for mammalian cells is not limited at all. Any known mammalian cell expression vector used in the field of therapy can be used. Although a plasmid vector or a virus vector may be used, a plasmid vector is preferred from the viewpoint of safety.
  • Various expression vectors for mammalian cells are well known and commercially available, and these well-known or commercially available vectors can be preferably used.
  • pCAGGS Efficient se lect ion on for high express express on transfactans with a nove l eukaryotic vector, Gene 1991 Dec. 15, 108 (2) p193-P199. Is shown in Fig. 4 and its nucleotide sequence is shown in SEQ ID No. 3 in the sequence listing.)
  • the forces that can be created are not limited to these.
  • the target protein to be produced in the body by gene therapy is not limited at all, and includes various cytokins such as interferon, interleukin and GTLA4, growth factors, hormones such as insulin and cell adhesion factors, and the like. These receptors can be exemplified.
  • any antigen protein can be produced in the body to produce a gene vaccine.
  • the target protein itself may be a fusion protein.
  • the constant region (FG) of an immunoglobulin, preferably IgG, particularly IgG1 is fused to one end of a desired site where binding to the FG receptor is required to enhance the binding to the FG receptor. Tampa (See Examples 1 to 4 below).
  • nucleotide sequence of the nucleic acid encoding the IgG FG region is well known.
  • the nucleotide sequence of the nucleic acid encoding the human IgG FG region is described, for example, in GenBank Accession No. BG020823.
  • the nucleotide sequence of the nucleic acid encoding the IgG FG region of the rat is shown in FIGS. 1 to 3 of the present application.
  • the vector of the present invention can be obtained by inserting a nucleic acid encoding a fusion protein of a target protein and the above-mentioned labeled peptide into a cloning site of an expression vector for mammalian cells.
  • the labeled peptide is fused to one end of the target protein, particularly to the C-terminus.
  • Gene therapy can be performed by administering the gene therapy vector of the present invention to a mammal.
  • the administration route is preferably parenteral administration such as intravenous injection or intramuscular injection.
  • the amount can be appropriately determined according to the properties of the target protein, the type and degree of the disease to be treated, etc.
  • a solution obtained by dissolving a gene therapy vector in Ringer's solution can be used as an injection, and an injection additive well known in the field of pharmaceutical preparations.
  • the vector for gene therapy of the present invention can also be administered to mammalian cells cultured in vitro.
  • a gene therapy in which cells such as medulla cells are taken out of the body and cultured, a gene vector is administered to the cultured cells, and the cells that have acquired the target protein producing ability are returned to the patient again.
  • the vector for administration can also be administered to such cultured mammalian cells, or can be administered to mammalian cells cultured in experiments such as in vitro studies on the therapeutic effect of the gene therapy vector. .
  • a fusion protein of the target protein and a glucagon-derived labeled peptide is produced by a vector introduced into the body.
  • a vector for gene therapy to mammalian cells cultured in vitro
  • fusion of the target protein with a glucagon-derived labeled peptide in the cultured cells is performed. Protein is produced. Since the target protein is fused with the labeled peptide, the concentration of the target protein can be measured by measuring the concentration of the glucagon-derived labeled peptide.
  • kits for immunoassay of a glucagon-derived labeled peptide used in the present invention including an antibody obtained using a glucagon-derived labeled peptide as an antigen
  • Glucagon RIA manufactured by Daiichi Radioisotope Research Institute. Kit, etc.
  • the test sample for quantifying the labeled peptide derived from glucagon is various body fluids or tissues from the individual to which the vector for gene therapy of the present invention has been administered, or a dilution thereof, and is preferably whole blood, C) A blood sample such as serum or plasma or a dilution thereof, or a homogenate of cultured cells ⁇ culture supernatant when administering a gene therapy vector to mammalian cells cultured in vitro. .
  • PGR was performed using 5'-gagaat tcatttaaatgagagcggccgccgtgcccagaaactgtg-3 'and o-tcaaccactgcacaaaatcttgg gctttacccggagagtgggagagact-3' as a primer, and the PGR product was further diluted 300 times.
  • the obtained product was used as a ⁇ , and PGR was performed using 5'-gagaattcatttaaatgagagcg gccgccgtgcccagaaactgtg-3 'and 5'-gagagagagaattctcaggtattcatcaaccactgcacaa aatcttgggc-3' as a primer. It was integrated into the pGAGGS cloning site. As a result, pGAGGS-lgG-glu19-29 containing the Swal and Notl restriction enzyme sites (a glucagon-derived labeled peptide is located downstream of the FG region encoding immunoglobulin G1 (lgG1)). A nucleic acid fragment to which the region coding for was inserted was inserted into the EGOR I site of pGAGGS).
  • PCR was performed using 5'-gagaattcatttaaatga ttctgctggtggtcctgatg-3 'and 5'-gcagcatcgcggccgcttcttctctgtcatcatggagaaa-3' as primers, and the PGR product was previously prepared. It was incorporated into pGAGG S-IgG-glu19-29 using Swal and NotI.
  • the vector of the present invention in which the DNA fragment having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 (including the restriction enzyme site) was inserted into the EGO RI site of the above-described mammalian cell expression vector pCAGGS, Fabricated (Example 1).
  • SEQ ID NO: 2 is shown in FIGS. 1 to 3 together with other information.
  • the inserted nucleic acid fragment has an EGORI site at both ends, and a fusion protein of an interferon r receptor (IFR) protein and an Fc region of immunoglobulin G1 (IgGI). co downstream one de region is that region which co one de glucagon-derived labeled base peptide is bound (I MF r R- 1 gG- glucagon 29).
  • a plasmid vector containing no glucagon-derived labeled peptide (Comparative Example 1) and a plasmid vector of the present invention containing a glucagon-derived labeled peptide (Example 1) prepared as described above (Example 1) were each treated with 7 rat tails.
  • Gene injection was performed by rapid intravenous injection from a vein.
  • the composition of the injection solution was such that 800 g of the plasmid was dissolved in 20 ml of Ringer's solution per animal. After injection, blood is collected with time, blood is collected, and the plasma of 1-10j «1 is diluted 100- to 1000-fold.
  • RIA was carried out specifically as follows.
  • Figure 5 shows the measurement results of blood concentration.
  • the results were as good as m, and were measurable in all cases.
  • gene therapy using a plasmid doctor containing no glucagon peptide (Comparative Example 1), similar tests showed lower sensitivity.
  • Figure 6 shows the blood glucose levels 4, 8 and 12 hours after the intravenous injection of plasmid and the protein blood concentration values examined by the RIA measurement method as described above.
  • Example 1 the blood concentration was 2 815 ⁇ 2318 ng / m after 4 hours, 6061 ⁇ 2789 ng / m after 8 hours, and 5752 ⁇ 2270 ng / ml after 12 hours, and the maximum blood concentration was 8 to 12 hours.
  • blood glucose was 89.3 ⁇ 15.1 mg / dl (Example 1) vs 81.8 ⁇ 7.5 mg / dl (Comparative Example 1), and after 12 hours 63.5 ⁇ 5.7 tng / dl (Example 1) vs 71.4 There was no difference from ⁇ 6.9 mg / dl (Comparative Example 1).
  • PGAGGS- IgG was prepared by the method described in example 1 - c thereby incorporating with Swal and not I to Glu19-29, nucleotide sequences (restriction sites also including Umate shown in FIG off to 9 and SEQ ID nO: 4
  • the above-mentioned mammalian cell is a rat GTLA4-IgGlucagon 19 ⁇ 29 (a nucleic acid fragment having a rat IgG Fc coding region downstream of a rat CTLA4 coding region and a glucagon-derived labeled peptide coding region downstream thereof).
  • the recombinant vector was administered to the rat after heart transplantation in the same manner as in Example 1, and the blood concentration was measured. The number of days the transplanted heart survived was also examined.
  • LA4-lgG- glucagon 19 - 29 protein remained as shown in FIG. 7.
  • Glucagon was unmeasurable before dilution at 100-fold dilution, but increased sharply on the first day, showed a protein concentration exceeding 5000 ng / ml, and then decreased gradually. Slaughtered 105 Until the day, the protein concentration exceeded 1000 ng / ml.
  • FIG. 11 in Example 2, one out of ten animals was rejected on the 14th day, but the remaining nine animals survived until the 105th day when evaluated.
  • CTLA4 does not contain PGAGGS - In SP-lgG- the group treated with glutaric exaggeration 19 _ 29 (Comparative Example 2), the five day 1 out of 5 mice in one animal is 6 days, 3 out of 7 days Rejected in eyes. This is significantly show the effectiveness of pGAGGS-GTLA4-lgG- glucagon 19 _ 29 treatment.
  • 13- IgG- glucagon 19 - 29 protein has good sea urchin transition in Figure 1 7. That is, on day 1, the protein concentration exceeds 2000 ng / ml, After that, it gradually decreased, but showed a protein concentration of about 8 ng / ml until 16 days after sacrifice for evaluation. Further, as shown in FIG. 18, a group to which p GAGGS-IL13-lgG-glucagon 19-29 (a vector into which IL13-IgG-glucagon 19-29 was inserted -pGAGGS), which was the vector for gene therapy of the present invention, was administered.
  • the rat IgG FG coding region, and a nucleic acid fragment to which a glucagon-derived labeled peptide coding region was bound downstream thereof were inserted into the EGO RI site of pGAGGS, an expression vector for mammalian cells, as described above.
  • 1RA-IgG in rat cells - recombinant vectors expressing glucagon 19 '29 was fabricated (example 4).
  • IgG- glucagon 19 _ 29 protein remained as shown in Figure 22. In other words, the protein concentration exceeded 2000 ng / ml on the first day, and then gradually decreased, but remained around 20 ng / ml until 16 days after sacrifice for evaluation. Also, as shown in Figure 23, Compared to Example 4 Comparative Example 4 significantly reduced the area of myocarditis lesion, pGAGG S- I L1 RA- 1 gG- glucagon 19 - 29 efficacy of the treatment it was shown.
  • PGR was performed using 5'-gagaattGatttaaatgacttccaagctg gccgtggct-3 'and 5'-gcagcatcgcggccgctgaattctcagccctcttcaaaa-3' as a plasmid, and the PGR product was previously prepared, pGAGGS-gl. 9-29 was incorporated using Swal and Notl.
  • the human 8 having the nucleotide sequence shown in Figure 24 and SEQ ID NO: 8 - mammals glucanotransferase Gon 19 _ 29 was the inserted into the EGO RI site of cell expression vector PG A6GS, recombinant vectors expressing 8- glucagon 19, 29 in the rat cells was prepared (example 5).
  • Recombinant vectors were administered to rats in the same manner as in Example 1, blood was collected one day later, and the blood concentration was measured. The concentration of human-8 in the same sample was also determined. Human IL-8 was quantified using the IL-8 EASIA kit manufactured by BI0SURSE (Nivel! Es, Belgium) according to the protocol.

Abstract

遺伝子治療を行った際の目的タンパク質の血中濃度をより高感度にモニターでき、かつ、標識ペプチドが生理作用を持たずに多くの動物で免疫原性がない、遺伝子治療用ベクターが開示されている。遺伝子治療用ベクターは、哺乳類細胞用発現ベクターに、グルカゴンのＣ端側19-29アミノ酸ペプチド領域と、体内で生産させるべき目的タンパク質領域との融合タンパク質をコードする核酸を組み込んだ構造を持つ。

Description

明細書
遺伝子治療用ベクター及び該遺伝子治療用ベクターを投与された哺乳動物中又は 培養細胞中の目的タンパク質の定量方法
技術分野
本発明は、 生体内又は培養細胞内で生産された目的タンパク質を簡便に定量す ることができる、 生体内で目的タンパク質を生産するための遺伝子治療用べクタ 一に関する。
背景技術
患者の体内で目的のタンパク質を生産させる遺伝子治療を行った際、 目的のタ ンパク質の血中濃度はその蛋白の ELISA法など、 測定法が確立している場合は可 能であるが、 確立していない場合は濃度測定ができない。 そこで、 標識蛋白を用 いて、 その蛋白濃度を測定するアツセィ法が実用化され販売されている。 しかし、 この測定感度は低く、 遺伝子治療における血中濃度測定として確立した方法はな しゝ 文献 (Treatment of Murine Lupus with cDNA encoding I FN— rR Fc, The Journal of Clinical Investigation, July 2000, volume 106, Number 2 p207- 215)では目的のタンパク質を測定せずに影響を受けるタンパク質を定量化して間 接的に目的のタンパク質の発現を証明している。 これは血中濃度測定の難しさを 示していると考えられる。
発明の開示
本発明の目的は、 遺伝子治療を行った際の目的タンパク質の血中濃度を高感度 にモニターでき、 標識に起因する不所望の生理作用や抗原抗体反応がほとんど引 き起こされない、 遺伝子治療用ベクターを提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、 遺伝子治療により体内で生産させるべき目 的タンパク質と、グルカゴンの C端側 19— 29アミノ酸べプチドとの融合タンパク 質をコードする核酸を組み込んだベクターで遺伝子治療を行うことにより、 上記 グルカゴンぺプチドを標識として目的タンパク質の血中濃度を高感度に測定する ことができ、 かつ、標識べプチドに起因する不所望な生理作用の発現や免疫反応 の誘起がほとんどないこどを見出し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明は、 哺乳類細胞用発現ベクターに、グルカゴンの C端側 19一 29アミノ酸ぺプチド領域と、体内で生産させるべき目的タンパク質領域との融合 タンパク質をコードする核酸を組み込んだ構造を持ち、 哺乳類細胞内で前記融合 タンパク質を生産させることができる遺伝子治療用ベクターを提供する。 また、 本発明は、 上記本発明の遺伝子治療用ベクターの有効量を、 前記目的タンパク質 の体内又は細胞内発現が望まれる哺乳動物又は培養哺乳動物細胞に投与すること を含む、 遺伝子治療方法を提供する。 さらに、 本発明は、 上記本発明の遺伝子治 療用ベクターの、 遺伝子治療用薬剤の製造のための使用を提供する。 さらに、 本 発明は、 上記本発明の遺伝子治療用ベクターを投与された哺乳動物又は培養哺乳 動物細胞から採取された被検試料中の、 グルカゴンの C端側 19—29アミノ酸べ プチド領域を免疫測定することを含む、 前記遺伝子治療用ベクターの発現により 体内又は培養哺乳動物細胞内で生産された前記目的タンパク質の定量方法を提供 する。 さらに、 本発明は、 グルカゴンの C端側 19—29アミノ酸ペプチドから成 る、 哺乳動物体内又は培養哺乳動物細胞内において、 外部から投与された発現べ クタ一の発現により生産される目的タンパク質の標識剤を提供する。 さらに、 本 発明は、 哺乳動物体内又は培養哺乳動物細胞において、 外部から投与された発現 ベクターの発現により生産される目的タンパク質を、 標識剤としてのグルカゴン の C端側 19— 29アミノ酸ペプチドとの融合タンパク質として発現させることに より、 体内又は培養細胞内で生産される目的ペプチドを、 グルカゴンの C端側 1 9-29ァミノ酸べプチドで標識することを含む、 体内又は培養細胞内で生産され るタンパク質の標識方法を提供する。 さらに、 本発明は、 グルカゴンの C端側 1 9— 29アミノ酸べプチドの、 哺乳動物体内又は培養哺乳動物細胞内において外部 から投与された発現ベクターの発現により生産される目的タンパク質の標識剤と しての使用を提供する。
本発明により、 標識ペプチドは生理作用を持つことなく、 目的タンパク質の血 中濃度を高感度に測定することを可能にする遺伝子治療用べクタ一が初めて提供 された。 グルカゴンの C端側 19一 29は、 それ自体生理作用を有さず、 各種哺乳 動物においてよく保存されているので、 免疫反応を実質的に誘起せず、 それでい て市販の免疫測定キッ卜を用いて高感度に免疫測定することにより定量すること が可能である。
図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、 挿入核酸断 片の塩基配列を、 それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
図 2は、 図 1の続きを示す図である。
図 3は、 図 2の続きを示す図である。
図 4は、 実施例 1 ~ 5で用いた哺乳動物用発現ベクターである pGAGGSの遺伝 子地図である。
図 5は、 実施例 1における、 遺伝子治療用ベクターの投与後の日数と、 グルカ ゴン由来標識べプチドを測定することにより測定された目的タンパク質の血中濃 度との関係を示す図である。
図 6は、 実施例 1において測定された、本発明のベクターを用いて遺伝子治療 を行った場合の目的タンパク質の血中濃度並びに本発明のベクターを用いて遺伝 子治療を行った場合及びグルカゴン由来標識べプチドを融合していない目的タン パク質をコードする核酸を挿入したベクターを用いて遺伝子治療を行った場合の 血糖値の経時変化を示す図である。
図 7は、 実施例 2で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、 挿入核酸断 片の塩基配列を、 それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
図 8は、 図 7の続きを示す図である。
図 9は、 図 8の続きを示す図である。
図 1 0は、 実施例 2における、 遺伝子治療用ベクターの投与後の日数と、 グル カゴン由来標識べプチドを測定することにより測定された目的タンパク質の血中 濃度との関係を示す図である。
図 1 1は、 実施例 2及び比較例 2における、 ラットの移植心臓の生着日数を示 す図である。
図 1 2は、 実施例 3で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、 挿入核酸 断片の塩基配列を、 それがコ一ドするアミノ酸配列と共に示す図である。 図 1 3は、 図 1 2の続きを示す図である。
図 1 4は、 図 1 3の続きを示す図である。
図 1 5は、 比較例 3で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、 挿入核酸 断片の塩基配列を、 それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
図 1 6は、 図 1 5の続きを示す図である。
図 1 7は、 実施例 3における、 遺伝子治療用ベクターの投与後の日数と、 グル カゴン由来標識べプチドを測定することにより測定された目的タンパク質の血中 濃度との関係を示す図である。
図 1 8は、 実施例 3及び比較例 3における、 ラットの心筋炎病変部位の面積率 を示す図である。
図 1 9は、 実施例 4で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、 挿入核酸 断片の塩基配列を、 それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
図 2 0は、 図 1 9の続きを示す図である。
図 2 1は、 図 2 0の続きを示す図である。
図 2 2は、 実施例 4における、 遺伝子治療用ベクターの投与後の日数と、 グル カゴン由来標識ペプチドを測定することにより測定された目的タンパク質の血中 濃度との関係を示す図である。
図 2 3は、 実施例 4及び比較例 4における、 ラットの心筋炎病変部位の面積率 を示す図である。
図 2 4は、 実施例 5で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、 挿入核酸 断片の塩基配列を、 それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
図 2 5は、 実施例 5における、 グルカゴン由来標識ペプチドを測定することに より測定された目的タンパク質の血中濃度と、 ヒ卜インターロイキン 8を測定す ることにより測定された目的タンパク質の血中濃度との相関関係を示す図である 発明を実施するための最良の形態
本発明のベクターにより、目的タンパク質と融合されて発現される、 「グルカ ゴンの C端側 19—29アミノ酸ぺプチド Jとは、グルカゴンの C末端から数えて 1 9番目から 2 9番目までの合計 1 1個のアミノ酸から成るぺプチドを意味する。 すなわち、このべプチドは、配列表の配列番号 1に示すアミノ酸配列を有するぺプ チドである。 この 「グルカゴンの C端側 19一 29アミノ酸ペプチド jは、目的タン パク質の標識として用いられるので、 以下、 便宜的に 「グルカゴン由来標識ぺプ チド Jと呼ぶことがある。
本発明のベクターには、グルカゴン由来標識ペプチド領域と、 目的タンパク質 領域との融合タンパク質をコードする核酸が組み込まれている。
本発明に用いられる哺乳類細胞用発現ベクターは、遺伝子治療の分野において 周知であり、 哺乳類細胞用発現ベクターであれば限定されない。 本発明の特徴は、 目的タンパク質の標識としてのグルカゴン由来標識べプチド領域を、 目的タンパ ク質と融合させて発現させる点にあり、 哺乳類細胞用発現ベクターは、 何ら限定 されるものではなく、 遺伝子治療の分野で用いられている公知のいずれの哺乳類 細胞用発現ベクターをも用いることができる。 プラスミ ドベクターでもウィルス ベクターでもよいが、安全性の観点からプラスミドベクターが好ましい。 種々の 哺乳類細胞用発現ベクターが周知であり、 また、 市販されており、 これらの周知 又は市販のベクターを好ましく用いることができる。 周知又は市販ベクターの例 として、 pCAGGS (Eff i c i ent se l ect i on for h i gh express i on transfactans w i t h a nove l eukaryot i c vector, Gene 1991 Dec. 15, 108 (2) p193-P199. , 遺伝子地 図を図 4に、 その塩基配列を配列表の配列番号 3に示す） 、 プロメガ社の pG Iベ クタ一、 pS Iベクタ一及び pTARGETべクタ一並びにィンビトロジ ιン社の pcDNA5/ TO等を挙げることができる力、これらに限定されるものではない。
遺伝子治療により体内で生産させようとする目的タンパク質は、何ら限定され るものではなく、 インターフェロン、 インターロイキン及び GTLA4のような種々 のサイト力イン、 成長因子、 インスリン等のホルモン及び細胞接着因子等並びに これらのレセプターを例示することができる。 また、 任意の抗原タンパク質を体 内で生産させ、 遺伝子ワクチンとすることもできる。 また、 目的タンパク質自体 が融合タンパク質であってもよい。 例えば、 FGレセプターとの結合が求められ る所望のサイ ト力インの一端に、 免疫グロブリン、 好ましくは l gG、 特に l gG1 の定常領域 (FG)を融合し、 FGレセプターとの結合性を高めたものを目的タンパ ク質とすることもできる （下記実施例 1〜4参照） 。 I gGの FG領域をコードす る核酸の塩基配列は、 周知であり、 例えば、 ヒ卜の I gG FG領域をコードする核 酸の塩基配列は例えば GenBank Access i on No. BG020823等に記載されており、 ラッ卜の I gG FG領域をコードする核酸の塩基配列は本願の図 1ないし図 3等に 示されている。
本発明のベクタ一は、 目的タンパク質と、上記標識べプチドとの融合タンパク 質をコードする核酸を、 哺乳類細胞用発現ベクターのクローニングサイ卜に挿入 することにより得られる。 なお、標識ペプチドは、目的タンパク質の一端、 特に C 末端に融合させることが好ましい。
遺伝子治療は、 本発明の遺伝子治療用ベクターを、 哺乳動物に投与^"ることに より行うことができる。 投与経路は、 静脈注射や筋肉内注射のような非経口投与 が好ましい。 ベクターの投与量は、 目的タンパク質の性質や治療すべき疾患の種 類及び程度等に応じて適宜設定することができるが、 体重 1 kg当りのベクター の投与量は、 通常、 1 ing〜10 mg程度、 好ましくは 2 mg〜4 mg程度である。 製 剤としては、 例えば、 遺伝子治療用ベクターをリンゲル液に溶解した溶液を注射 液として用いることができる。 これに医薬製剤の分野で周知の注射剤用添加剤を 添加することも可能である。 あるいは、 本発明の遺伝子治療用ベクターは、 イン ビトロで培養されている哺乳動物細胞に投与することもできる。 すなわち、 患者 のリンパ球や骨髄細胞等の細胞を体外に取り出して培養し、 培養細胞に遺伝子べ クタ一を投与し、 目的タンパク質の生産能を獲得した細胞を再び患者に戻す遺伝 子治療があるが、 本発明の遺伝子治療用ベクターは、 このような培養哺乳動物細 胞に投与することもできる。 あるいは、 遺伝子治療用ベクターの治療効果をイン ビトロで調べるため等の実験において培養される哺乳動物細胞に投与することも できる。
遺伝子治療において、体内に導入されたべクタ一により上記目的タンパク質と グルカゴン由来標識ペプチドとの融合タンパク質が生産される。 あるいは、 イン ビトロで培養されている哺乳動物細胞に遺伝子治療用ベクターを投与する場合に は、 該培養細胞内で上記目的タンパク質とグルカゴン由来標識べプチドとの融合 タンパク質が生産される。 目的タンパク質は、標識べプチドと融合しているので、 目的タンパク質の濃度は、 グルカゴン由来標識ペプチドの濃度を測定することに より測定すること力《できる。 なお、本発明で用いられるグルカゴン由来標識ぺプ チドを免疫測定するキッ卜 （グルカゴン由来標識べプチドを抗原として得られる 抗体を含む） が市販されている （第一ラジオアイソトープ研究所製塍グルカゴン R I Aキット等） ので、このような市販の免疫測定用キッ卜を用いて容易に測定す ることができる。
グルカゴン由来標識べプチドを定量する被検試料は、 本発明の遺伝子治療用べ クタ一を投与された個体由来の各種体液や組織等又はそれらの希釈物であり、 好 ましくは、 全血、 血清若しくは血漿又はそれらの希釈物のような血液試料である c あるいは、 インビトロで培養されている哺乳動物細胞に遺伝子治療用ベクターを 投与する場合には、 培養細胞のホモジネートゃ培養上清等である。
実施例 1、 比較例 1
ラットのレクチンで刺激した培養脾細胞の GDNAを錶型として用い、 5' - gagaat tcatttaaatgagagcggccgccgtgcccagaaactgtg-3' と o -tcaaccactgcacaaaatcttgg gctttacccggagagtgggagagact-3'をプライマーとして用いて PGRを行い、 さらに その PGR産物を 300倍希釈したものを錶型として、 5' -gagaattcatttaaatgagagcg gccgccgtgcccagaaactgtg-3' と 5' -gagagagagaattctcaggtattcatcaaccactgcacaa aatcttgggc-3' をプライマ一として用いて PGRを行い、 増幅産物を、 EGOR I を用 いて上記した哺乳類細胞用発現ベクター pGAGGS のクローニングサイ卜に組み込 んだ。 これにより、 Swa l と Not lの制限酵素部位の入った pGAGGS- l gG-g l u19 - 29 (免疫グロブリン G1 ( l gG1 )の FG領域をコードする領域の下流に、グルカゴン由 来標識べプチドをコ一ドする領域が結合された核酸断片が pGAGGSの EGOR I部位 に挿入されたもの） が得られた。
次に、 ラット心筋炎の心臓の cDNAを錶型として用い、 5' - gagaattcatttaaatga ttctgctggtggtcctgatg-3 ' と 5' -gcagcatcgcggccgcttcttctctgtcatcatggagaaa-3 'をプライマーとして用いて PCRを行い、 その PGR産物を、 先に作成した pGAGG S- I gG- g l u1 9 - 29に Swa l と Not I を用いて組み込んだ。 これにより、 上記した哺乳類細胞用発現ベクター pCAGGSの EGO RI部位に、 配 列表の配列番号 2に示す塩基配列 （制限酵素部位も含めて示す） を有する DNA 断片が挿入された、本発明のベクターを作製した （実施例 1 ) 。 なお、配列番号 2 を他の情報と共に図 1ないし図 3に示す。 図 1ないし図 3に示されるように、 揷 入した核酸断片は、 両端に EGORI部位を有し、 インタ一フエロン rレセプター（I F R)タンパク質と、免疫グロプリン G1 (IgGI)の Fc領域の融合タンパク質をコ 一ドする領域の下流に、グルカゴン由来標識べプチドをコ一ドする領域が結合さ れたもの（ I MF r R- 1 gG-グルカゴン 29)である。
グルカゴン由来標識ペプチドを含まないプラスミドベクター （比較例 1 ) と、 上記のように作成したグルカゴン由来標識ペプチドを含む本発明のプラスミドぺ クタ一 （実施例 1 ) を、 それぞれ 7匹のラッ卜の尾静脈から急速静脈注射し、 遺 伝子治療を行った。 注射液の組成は、 一匹あたり 800 gのプラスミ ドを 20 m Iのリンゲル液に溶解したものであった。 注射後、経時的に血液を採取し、 採 血して得た 1〜10j«1の血漿を 100〜1000倍希釈し、市販の RIAキッ卜 （第一ラジ オアイソトープ研究所製滕グルカゴン RIAキット等） を用いて、該キットの添付 文書に従ってグルカゴン由来標識ぺプチドの濃度、ひいては、目的タンパク質 （本 実施例では、 IFNrR/lgG1FG融合タンパク質） の濃度を測定した。 すなわち、 RI Aは、 具体的には次のようにして行なった。 アツセィ用緩衝液 400〃 Iに標準グ ルカゴン溶液あるいは希釈した被検血漿を 200 j« I加え、 さらにグルカゴン- 1251 溶液を 100 し グルカゴン抗血清溶液を 100 ju I加え、 4°C、 48時間放置した。 その後、 第二抗体を 100 し グルカゴン RI A用沈殿安定剤 400 I を加え 4°C、 3 0分間放置し、 遠心分離 （2000xg 30分間、 4°C) 後、 上清除去後計数率を測定し 濃度を求めた。
図 5は血中濃度の測定結果である。 実施例 1では、 静脈注射後 1日目 2870±1 062ng/ml (平均土標準偏差） 、 3日目 1440±334ng/mし 7日目 1120±433ng/mし 1 6曰目 281±162ng/mし との結果が得られ、 全例で測定可能であった。 一方、 グルカゴンぺプチドを含まないプラスミ ドぺクタ一での遺伝子治療 （比較例 1 ) では同様な検査ですベて感度以下であった。 図 6はプラスミ ド静脈注射 4, 8, 12時間後の血糖値及び上記と同様に RIA測 定法で検査した蛋白血中濃度の値である。 実施例 1では、 血中濃度は 4時間後 2 815±2318ng/mし 8時間後 6061 ±2789ng/mし 12時間後 5752±2270ng/ml を示し, 最大血中濃度を示した 8— 12時間後の血糖は、 8時間後 89.3±15.1mg/dl (実施 例 1 ) vs81.8±7.5 mg/dl (比較例 1 ) 、 12時間後 63.5±5.7tng/dl (実施例 1 ) vs71.4±6.9 mg/dl (比較例 1 ) と差はなかった。
以上の結果から、 本発明のベクターを用いることにより、 ベクター投与の数十 曰後まで、 極少量の血漿サンプルから、 目的タンパク質の血中濃度を十分測定す ることが可能であることが明らかになった。
実施例 2、 比較例 2
ラットのレクチンで刺激した培養脾細胞の GDNAを錶型として用い、 5'- gagaat tcatttaaatggcttgtcttggactccagagg-3'<i: 5'-gcagcatcgcggccgcgtctgaatctgggcat ggttctgg -3'をプライマーとして用いて PGRを行い、 その PGR産物を、 実施例 1 記載の方法で作製した pGAGGS- IgG - glu19-29に Swal と Not I を用いて組み込んだ c これにより、 図フないし 9及び配列番号 4に示す塩基配列 （制限酵素部位も含 めて示す） を有するラッ卜 GTLA4- IgG-グルカゴン 19·29 (ラット CTLA4コード領 域の下流にラット IgG Fcコード領域、 その下流にグルカゴン由来標識べプチド コード領域を結合した核酸断片） が上記した哺乳類細胞用発現ベクター PCAGGS の EGO RI部位に挿入された、 ラット細胞内で GTLA4- IgG-グルカゴン 19— 29を発現 する組換えベクターが作製された （実施例 2) 。 比較のため、 GTLA4コード領域 を含まない IgG -グルカゴン 19'29コード領域のみを挿入した組換えべクタ一も作 製した （比較例 2) 。
心臓移植後のラッ卜に、 実施例 1と同様にして組換えベクターを投与し、 血中 濃度を測定した。 また、 移植心臓の生着日数も調べた。
結果を図 1 0及び図 1 1に示す。 図 1 0に示されるように、 実施例 2では、 CT
LA4-lgG-グルカゴン 19— 29蛋白が図 7のように推移した。 つまリ前値は 100倍希釈 ではグルカゴンが測定不能であつたが、 1 日目に急激に上昇し、 5000ng/ml を越 えるような蛋白濃度を示し、 その後徐々に低下したが、 評価のため屠殺した 105 日後まで、 1000ng/ml を越えるような蛋白濃度を示した。 また、 図 1 1に示され るように、 実施例 2では、 10匹中 1匹が 14日目に拒絶されたが、 残りの 9匹は すべて評価した 105日まで生着していた。 CTLA4を含まない pGAGGS - SP-lgG-グル カゴン 19_29で治療した群 （比較例 2) では、 5匹中 1匹が 5日目に、 1匹が 6日 目に、 3匹が 7日目に拒絶された。 これは有意に pGAGGS-GTLA4-lgG-グルカゴン 19_29治療の有効性を示している。
実施例 3、 比較例 3
ラッ卜のレクチンで刺激した培養脾細胞の cDNAを錶型として用い、 5' - gagaat tcatttaaatggcactctgggtgactgcagtc-3'<}: 5'-gcagcatcgcggccgcgtggccatagcggaaa ag gctt-3'をプライマーとして用いて PGRを行い、 その PGR産物を実施例 1記 載の方法で作製した pGAGGS-lgG - glu19 - 29に Swal と Notl を用いて組み込んだ。 これにより、 図 1 2ないし 1 4及び配列番号 5に示す塩基配列 （制限酵素部位 も含めて示す） を有するラット IL13-lgG-グルカゴン^29 (ラッ卜インタ一ロイ キン 1 3 (IL13)コード領域の下流にラッ卜 IgG FGコード領域、 その下流にダル カゴン由来標識べプチドコード領域を結合した核酸断片） が上記した哺乳類細胞 用発現ベクター pGAGGSの Eco RI部位に揷入された、 ラット細胞内で IL13 - IgG- グルカゴン 19'29を発現する組換えべクタ一が作製された （実施例 3) 。 比較の ため、 IL13コード領域を含まない SP-lgG-グルカゴン 19'29コード領域 （配列番 号 6並びに図 1 5及び図 1 6) のみを挿入した組換えべクタ一も作製した （比較 例 3) 。
自己免疫性心筋炎ラッ卜 （A novel experimental model of iant eel I myoca rditis induced in rats by immunization with cardiac myosin fraction. Clinical Immunology and Immunopathology, November 1990, volume 57, p250- 262.) のラッ卜に、 実施例 1と同様にして組換えベクターを投与し、 血中濃度を 測定した。 また、 投与 1 6日後に屠殺、 解剖し、 心筋炎病変部位の病変面積率も 調べた。
結果を図 1 7及び図 1 8に示す。 13- IgG-グルカゴン 19— 29蛋白が図 1 7のよ うに推移した。 つまり、 1 日目に 2000ng/ml を越えるような蛋白濃度を示し、 そ の後徐々に低下したが、 評価のため屠殺した 16日後まで、 約 8ng/mlの蛋白濃度 を示した。 また、 図 1 8に示すように、 本発明の遺伝子治療用ベクターである p GAGGS-IL13-lgG-グルカゴン 19-29 (IL13- IgG -グルカゴン 19-29を挿入したベクタ -pGAGGS)を投与した群では、 IL13を含まない pCAGGS- SP - IgG-グルカゴン 19—29を 投与した群に比べて、 有意に心筋炎病変部位の面積が小さく、 pCAGGS-IL13-IgG- グルカゴン 19—29治療の有効性が示された。
実施例 4、 比較例 4
マウスのレクチンで刺激した培養脾細胞の GDNAを錶型として用い、 5'-gagaat tcatttaaatggaaatctgctggggaccctac-3't 5'-gcagcatcgcggccgcttggtcttcctggaag tagaactt-3'をプライマーとして用いて PGRを行い、 その PGR産物を実施例 1記 載の方法で作製した pGAGGS-lgG - glu19- 29に Swal と Notl を用いて組み込んだ。 これにより、 図 1 9ないし 2 1及び配列番号フに示す塩基配列 （制限酵素部位 も含めて示す） を有するラット 1RA- IgG-グルカゴン 19— 29 (ラットインタ一口 ィキン 1 レセプターアンタゴニストコード領域の下流にラット IgG FGコード領 域、 その下流にグルカゴン由来標識ペプチドコード領域を結合した核酸断片） が 上記した哺乳類細胞用発現べクタ一 pGAGGSの EGO RI部位に挿入された、 ラッ卜 細胞内で 1RA -IgG-グルカゴン 19'29を発現する組換えベクターが作製された （ 実施例 4) 。
自己免疫性心筋炎ラッ卜 （A novel experimental model of giant cell myoca rditis induced in rats by immunization with cardiac myosin fraction. CI i nical Immunology and Immunopathology, November 1990, volume 57， p250-262. ) のラットに、 実施例 1と同様にして組換えべクタ一を投与し、 血中濃度を測定 した。 また、 投与 1 6日後に屠殺、 解剖し、 心筋炎病変部位の病変面積率も調べ た。 比較のため、 上記比較例 3のベクターも投与した （比較例 4) 。
結果を図 22及び図 23に示す。 図 22に示すように、 実施例 4では、 IL1RA-
IgG-グルカゴン 19_29蛋白が図 22のように推移した。 つまり、 1 日目に 2000ng/m I を越えるような蛋白濃度を示し、 その後徐々に低下したが、 評価のため屠殺し た 16日後まで、 約 20ng/mlの蛋白濃度を示した。 また、 図 23に示すように、 実施例 4では比較例 4に比べて、 有意に心筋炎病変部位の面積が小さく、 pGAGG S- I L1 RA- 1 gG-グルカゴン 19— 29治療の有効性が示された。
実施例 5
Swal と Notlの制限酵素部位の入った pGAGGS- glu19 - 29 を作るために、 5， - gag aattcatttaaatgagagcggccgccccgggtaaagcccaagattttgtgcagtggttg-3'と 5'-gagag agagaattctcaggtattcatcaaccactgcacaaaatcttgggc-3'(7) Λマーのみで PGRを 行い、 EcoRI を用いて、 pGAGGSのクローニングサイ卜に組み込んだ。
次に Gos7細胞の GDNAを錶型として用い、 5' - gagaattGatttaaatgacttccaagctg gccgtggct-3'と 5'-gcagcatcgcggccgctgaattctcagccctcttcaaaaa-3'をプラ — として用いて PGRを行い、 その PGR産物を、 先に作成した pGAGGS - glul 9-29に S wal と Notl を用いて組み込んだ。
これにより、 図 24及び配列番号 8に示す塩基配列を有するヒト 8 -グルカ ゴン 19_29 (ヒ卜インターロイキン 8コード領域の下流にグルカゴン由来標識べ プチドコード領域を結合した核酸断片） が上記した哺乳類細胞用発現ベクター PG A6GSの EGO RI部位に挿入された、 ラット細胞内で 8-グルカゴン 19·29を発現 する組換えベクターが作製された （実施例 5) 。
ラッ卜に、 実施例 1と同様にして組換えベクターを投与し、 1 日後に採血し、 血中濃度を測定した。 また、 同じ試料中のヒト - 8の濃度も定量した。 ヒ卜 I L - 8の定量は、 BI0S0URSE社製 (Nivel !es, Belgium) 、 IL-8 EASIAキットを用 いてそのプロ卜コールに従って行った。
結果を図 25に示す。 図 25に示すごとく、 両者のモル濃度はほぼ一致し、 グ ルカゴン 19·29の標識べプチドを用いた方法の正確性が証明された。

Claims

請求の範囲
1 . 哺乳類細胞用発現ベクターに、グルカゴンの C端側 19—29ァミノ酸ぺプチ ド領域と、体内で生産させるべき目的タンパク質領域との融合タンパク質をコー ドする核酸を組み込んだ構造を持ち、 哺乳類細胞内で前記融合タンパク質を生産 させることができる遺伝子治療用べクタ一。
2 . 前記グルカゴンの C端側 19—29アミノ酸ペプチド領域は、 前記目的タン パク質領域の C末端に結合される請求項 1記載のべクタ一。
3 . 前記目的タンパク質が、 サイ卜力イン若しくはサイトカインに免疫グロブ リンの定常領域を付加した融合タンパク質、 成長因子、 ホルモン若しくは細胞接 着因子又はこれらのレセプターである請求項 1又は 2記載のベクタ一。
4 . 前記サイ卜力イン又はそのレセプターが、 インターフェロン及びそのレセ プター、 GTLA4、 インターロイキン及びそのレセプターから成る群から選ばれる 請求項 3記載のベクター。
5 . 請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載の遺伝子治療用べクタ一の有効量 を、 前記目的タンパク質の体内又は培養哺乳動物細胞内発現が望まれる哺乳動物 又は培養哺乳動物細胞に投与することを含む、 遺伝子治療方法。
6 . 前記遺伝子治療用ベクターを、 哺乳動物に投与する請求項 5記載の方法。
7 . 請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載の遺伝子治療用ベクターの、 遺伝 子治療用薬剤の製造のための使用。
8 . 請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載の遺伝子治療用べクターを投与さ れた哺乳動物又は培養哺乳動物細胞から採取された被検試料中の、 グルカゴンの C端側 19一 29アミノ酸べプチド領域を免疫測定することを含む、 前記遺伝子治 療用ベクターの発現により体内又は培養細胞内で生産された前記目的タンパク質 の定量方法。
9 . 前記被検試料が、 前記遺伝子治療用ベクターを投与された哺乳動物から採 取されたものである請求項 8記載の方法。
1 0 . 前記被検試料が、 血液試料である請求項 9記載の方法。
1 1 . グルカゴンの C端側 19—29アミノ酸べプチドから成る、 哺乳動物体内 又は培養哺乳動物細胞において、 外部から投与された発現べクタ一の発現により 生産される目的タンパク質の標識剤。
1 2 . グルカゴンの C端側 19一 29アミノ酸ペプチドから成る、 哺乳動物体内 において、 外部から投与された発現ベクターの発現により生産される目的タンパ ク質の標識剤。
1 3 . 哺乳動物体内又は培養哺乳動物細胞内において、 外部から投与された発 現ベクターの発現により生産される目的タンパク質を、 標識剤としてのグルカゴ ンの C端側 19一 29アミノ酸ペプチドとの融合タンパク質として発現させること により、 体内又は培養細胞内で生産される目的ペプチドを、 グルカゴンの C端側 19一 29アミノ酸ペプチドで標識することを含む、 体内又は培養細胞内で生産さ れるタンパク質の標識方法。
1 4 . 哺乳動物体内において、 外部から投与された発現ベクターの発現により 生産される目的タンパク質を、 標識剤としてのグルカゴンの C端側 19—29アミ ノ酸ペプチドとの融合タンパク質として発現させることにより、 体内で生産され る目的べプチドを、 グルカゴンの C端側 19— 29アミノ酸ぺプチドで標識するこ とを含む、 請求項 1 3記載の方法。
1 5 . グルカゴンの C端側 19一 29ァミノ酸べプチドの、 哺乳動物体内又は培 養哺乳動物細胞において外部から投与された発現ベクターの発現により生産され る目的タンパク質の標識剤としての使用。
1 6 . グルカゴンの C端側 19一 29アミノ酸ペプチドの、 哺乳動物体内におい て外部から投与された発現ベクターの発現により生産される目的タンパク質の標 識剤としての使用。
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