WO2004089404A1

WO2004089404A1 - Conjugat d'hemoglobine, son procede de preparation et son utilisation

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Publication number: WO2004089404A1
Application number: PCT/CN2004/000091
Authority: WO
Inventors: Zhiguo Su; Xiuling Lu; Chunyang Zheng; Yuhong Xu
Original assignee: Zhiguo Su; Xiuling Lu; Chunyang Zheng; Yuhong Xu
Priority date: 2003-04-09
Filing date: 2004-02-02
Publication date: 2004-10-21
Also published as: CN1535986A; CN1208346C; US20060247423A1

Description

血红蛋白的偶联物及其制备方法和用途技术领域

本发明涉及一种血红蛋白的偶联物，尤其涉及血红蛋白与人血清白蛋白的偶联物用作血液代用品，以及该偶联物的制备方法。背景技术

输血对于临床手术、抗灾和战场救护是不可缺少的医疗手段。靠人献血不仅面临血源短缺问题, 而且由于血型复杂，输血必须进行严格的配型，同时血液要低温储存，保存期短，运输不便，更为严重的是肝炎、艾滋病等病毒的污染使输血安全受到威胁。近年来，血液需求量不断增高，而安全有效的血源却日益紧缺。因此，近几十年来人血液代用品一直是国际科学界和企业界关注的研究开发热点。

人血液代用品（ human blood substitutes ),即人红细胞代用品（ human red cell substitutes ),是具有氧传递功能、维持血液渗透压和酸威平衡及扩充容量的人工制剂。理想的血液代用品要求具有天然红细胞的传递氧功能、生物相容性、安全性和稳定性。其具有广泛的应用前景，不仅能用于和平时期和战争时期用于临床外科、急性贫血、和大量出血的治疗之外，也可用于各种疾病的治疗，如围术期常规使用、创伤治疗、血液稀释、局部缺血组织的灌流、败血症休克、多种抗体病人、肿瘤治疗等。

现有的人血液代用品主要包括有机化学合成的高分子全氟碳化合物类和生物技术制备的血红蛋白类及红细胞类血液代用品。其中由于全氟碳化合物不具备天然血红蛋白的生物学载氧特性，其研究与开发已不再是重点；通过血型转换成的红细胞具有贮存期短、不易运输等缺点，其研究与应用也受到极大的限制；而来源于红细胞本身的血红蛋白（Hb )具有高效的载氧能力和维持胶体渗透压的功能，当前各国都将研制以血红蛋白为基质的携氧剂作为主攻方向，主要包括化学修饰血红蛋白以及脂质体包封血红蛋白和其它包含血红蛋白的胶嚢（Winslow RM. Hemoglobin-based red cell substitute. The John Hopkins University Press, Baltimore and London.1992: 39 )。

无基质血红蛋白在体内易氧化或解离成单体和二聚体而引起肾毒性，并且存在氧亲和性高、循环半寿期短、胶体渗透压高等缺陷，采用化学修饰法实现血红蛋白分子内交联并提高血红蛋白分子量可在一定程度上解决这些问题。血红蛋白分子由 4个亚基组成，分子内交联增强了四聚体的稳定性，提高血红蛋白的分子量可使其不易直接透过肾而被循环代谢掉，从而延长其在体内的循环半寿期。但并非所有的化学偶联均能降低血红蛋白的免疫原性。因此修饰要求一方面提高血红蛋白分子量，消除产品在体内代谢过程中的肾毒性副作用，另一方面修饰还要保持血红蛋白的生物学活性，消除产品的免疫原性。目前常用的几种血红蛋白修饰方法有血红蛋白自身聚合 ( Rausch C W, Gawryl M S， Light WR et al. Stable polymerized hemoglobin blood-substitute. EPl 093720. 2001-04-25 ),血红蛋白表面修饰大分子多聚物如 PEG ( Davis F, NHO K,ZALIPSKY S .Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute. US 5234903. 1993-08-10 ) , 以及血红蛋白与多糖或蛋白偶联 ( Adamson G J. Hemoglobin-polysaccharide conjugates. US 6500930. 2002-11.31 )

虽然目前所研制的血液代用品很少具有天然血液的缺点，但还没有一种血液代用品具有血液的全部优点。就目前的研究水平看，血液代用品仍存在许多问题尚未解决，其中重要的是血液代用品的安全性和有效性等问题。血液代用品存在一些副作用（如血管收缩和高血压）限制了它们的应用，特别是用于有各种病的老年人身上。其次是产品在体内循环中存留时间短（短则几小时，录长寿命为 70 几小时，而天然红细胞的寿命则为 120天），只能提供短期的供氧功能，且与正常的血液功能差距较大。

人血清白蛋白（HSA )分子量 67,000，是血浆的主要蛋白质，在人体内具有维持血液渗透压和携带血液中多种配基（包括脂肪酸、氨基酸、类固醇、金属离子及药物）与组织进行交换等生理功能，并能携带胆红素等积累性毒性物质从而具有解毒功能。在医疗上人血清白蛋白作为重要的临床药物用于手术输血和危重病人补液。发明内容

本发明的目的在于提供一种血红蛋白与人血清白蛋白的偶联物。本发明的偶联物用作血液代用品具有载氧、维持渗透压及运输营养成分的较完全的血液的功能。本发明的另一个目的在于提供血红蛋白与人血清白蛋白偶联物的制备方法。本发明的血红蛋白与人血清白蛋白的偶联物优选分子量分布在

100KD~300KD之间。偶联物中血红蛋白分子数目为 1 ~3个，优选为 1 ~ 2 个, 人血清白蛋白分子数目为 1~3个，优选为 1个。偶联物中血红蛋白是分子内交联或未分子内交联的血红蛋白，优选为分子内交联的血红蛋白。本发明偶联物的血红蛋白来自于人或其它哺乳动物, 优选为猪、牛、羊、马、狗的血红细胞。本发明的血红蛋白,与人血清白蛋白的偶联物的制备方法，包括无基质血红蛋白的制备、血红蛋白与人血清白蛋白的偶联以及偶联产物的纯化。

其中无基质血红蛋白的制备可以采用本领域公知的制备电泳纯或色谱纯无基质血红蛋白的方法。

优选使用膜过滤、和离子交换层析集成纯化血红蛋白，得到电泳纯或色谱纯的无基质血红蛋白。将洗净的红细胞在低渗透压下溶胀破裂（DocziJ. Injectable stroma free hemoglobin and its method of manufacture. 1976, US 3991181 ),得到的红细胞裂解液经 0.22~0.65μιη膜微滤，再经 10 ~ 30KD 膜超过滤，优选为 0.45 μιη膜微滤，再经 30KD膜超过滤进行预处理。所得血红蛋白溶液经透过式阴离子交换层析进一步纯化，层析介质优选为 DEAE Sepharose Fast Flow、 QMA Spherosil LS、 Q Sepharose Big Beads ( Amersham phamacia, Sweden ), 层析采用 pH值为 6.6 ~ 8.5, 优选为 pH 值为 7.0~7.8的罅酸緩冲液，緩冲液浓度为 10mM~ lOOmM, 优选为 20 ~ 50mM。采用 PEG伴随式层析，选择 PEG400 ~ PEG4000 , 浓度为 0.25% ~ 10%, 优选为 0.5 ~ 5%, 层析的回收率大于 95%。纯化各单元的操作温度为 4~ 10°C。得到用于与人血清白蛋白交联。本发明采用的偶联剂是与蛋白质氨基、巯基或羟基反应的双功能交联剂，优选为带有醛基、琥珀酰亚胺（NHS)基团、环氧基团、马来酰亚胺基团、亚胺酸酯基团的同型或异性汉功能交联剂。

本发明的人血清白蛋白与血红蛋白偶联的方法，可以是液相一步偶联法或两步偶联法，或采用将蛋白质吸附在固相介质上进行偶联的方法。一步偶联方法：将蛋白质溶于 pH6 - 12, 优选为 pH7.5 ~ 9.5的磷酸、 HEPES, 硼酸、硼砂 -氢氧化钠或碳酸钠緩冲溶液中，蛋白质浓度为 1~ 150mg/ml，优选蛋白质浓度为 10~100mg/ml, 加入交联剂，交联剂与蛋白质的摩尔比为 3: 1 - 600: 1, 优选为 10: 1~ 200:1，控制反应温度 4 ~ 55 °C，优选为 25~37°C，反应时间 0.1 ~ 48小时，优选为 0.5 ~ 10小时。 · 两步交联方法: 先活化血红蛋白或先活化人血清白蛋白，将其溶于 pH6~ 12, 优选为 pH7.0 ~ 9.5的磷酸、 HEPES、硼酸、硼砂-氢氧化钠或碳酸钠缓冲溶液中，蛋白质浓度为 1 ~ 150mg/ml, 优选蛋白质浓度为 5-60 mg/ml, 控制反应温度 4 ~ 55 °C之间，优选为 25~37°C，加入交联剂，交联剂与蛋白质的摩尔比为 3: 1 ~ 600: 1, 优选为 10: 1 - 500:1, 反应时间 0.1~48小时，优选为 ,0.5~ 10小时。交联剂与血红蛋白或人血清白蛋白的活性基团反应（该活性基团可以为巯基或氨基）后，过 Sephadex G ~ 25脱盐柱或低温透析脱修饰剂，同时调节緩冲液 pH值，使 pH与第一步反应 pH相同或不同，但其 pH范围仍为 6~ 12, 优选为 7.5 ~ 9.5,再等量加入另一种蛋白，使交联剂与其活性基团（该活性基团可以为巯基或氨基）再继续反应 1 ~48小时。

固相介盾上的偶联：介质选用阴离子交换介质或阳离子交换介质，优选为 DEAE Sepharose Fast Flow、 Q Sepharose Big Beads、 Q Sepharose Fast Flow、 SP Sepharose Fast Flow以及 CM Sepharose Fast Flow ( Amersham phamacia, Sweden )。用 50mMpH4.0 ~ 8.5, 优选为 pH4.5 ~ 7.5的磷酸盐或 HEPES緩冲液平衡层析介质，加入 0.5 ~ 5mg/ml的血红蛋白或人血清白蛋白溶液，使蛋白质首先吸附在介质上。再加入交联剂，使交联剂与蛋白质的摩尔比为 30: 1 - 600: 1, 优选为 1 0: 1~ 500:1, 反应时间 0.1 ~ 12小时，优选为 0.5 ~ 10小时。用上述平衡緩冲液洗柱除去过量的交联剂后，再用含有 0.5 MNaCl的该緩冲液将带有交联剂的活化的蛋白质洗脱，收集蛋白峰。经 SephadexG-25凝胶过滤柱，脱去溶液中的 NaCL 收集含蛋白的洗脱液，超过滤浓缩至蛋白浓度为 l~5mg/ml，加入等摩尔的另外一种蛋白质，同时调节缓冲液 pH值，使 pH与第一步反应 pH相同或不同，其 pH范围仍为 6~12,优选为 7.5-9.5,使活化的蛋白质交联剂与另外一种蛋白质活性基团（该活性基团可以为巯基或氨基）再继续反应 1~24小时，可以得到血红蛋白与人血清白蛋白摩尔比为 1: 1的偶联物。本发明制备的偶联产物进行纯化时，优选的方法选自离子交换层析、超过滤和凝胶过滤层析纯化，可以是其中的任一种方法，二种或三种方法同时使用。除去未发生偶联反应及分子量大于 300 D和小于 100KD的成分。

将纯化后的偶联产物 pH值调至 7.4, 对于受 2， 3—二磷酸甘油酸影响的血红蛋白，需要向溶液中加入 2, 3— DPG或磷酸吡哆醛等调节血红蛋白氧亲和力的共价调节剂。终产品其具有良好的血液代用品的特性。将血红蛋白与人血清白蛋白偶联制备血液代用品的优势非常明显。一方面，血红蛋白是主要的载氧蛋白质, 白蛋白能够维持血液渗透压 , 运输营养物质，携带胆红素等积累性毒性物质从而具有解毒功能 , 因此该新型血液代用品与现有的液代用品相比，将具有更完全的血液的功能。另一方面，偶联人血清白蛋白大大增加血红蛋白的分子量，同时进行的分子内交联可增强四聚体的稳定性，并且 HSA在体内显负电性，由于电荷作用不易透过膜，这样更进一步延长了偶联物在体内的循环半寿期。并且更容易形成分子量较均一的的交联产物，避免多聚体的聚集，消除肾毒副作用。更重要的是，不同于其它动物的血清白蛋白，来源于人的血清白蛋白不会产生免疫原性，若与动物血红蛋白偶联，还会在很大程度上减弱或消除异体的血红蛋白输入人体内造成的免疫原性。因此本发明采取来自于人或猪、牛、马、羊、狗等动物的血红蛋白与人血清白蛋白偶联的方式，制备一种安全有效的新型血液代用品。附图说明

图 1A为血红蛋白溶胀破裂液电泳扫描图谱

图 1B 为纯化后的血红蛋白电泳扫描图谱

图 2为纯化后的血红蛋白高效凝胶过滤液相色谱

色谱柱为 TSK 3000SW, 检测波长 280nm

图 3为 DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换法分离纯化偶联物

图 4为 Superdex 200凝胶过滤法鉴定偶联物

a 为离子交换法收集的蛋白峰上凝胶过滤柱

b 为反应混合物上凝胶过滤柱

图 5为 SDS-PAGE鉴定偶联物图谱

1为标准分子量蛋白， 2为偶联物， 3为标准牛血清白蛋白， 4为纯化的无基质血红蛋白 '

图 6为偶联产物的载氧活性

图 7 偶联产物的高效凝胶过滤色谱图

图 8 失血性休克大鼠存活情况具体实施方式实施例 1: 电泳纯无基质牛血红蛋白的制备

取一定体积洗净的新鲜牛血红细胞，用两倍体积的冷溶胀液（含 0.6 %NaCl的 20mmol/L ¾PO₄/Na₂HPO₄ (PBS)緩冲液， pH7.4) 悬浮， 4°C 振荡 lh;以每分钟溶: ¾总体积 10%的速度泵入 2倍红细胞体积的 20mmol/L PBS緩冲液（ρΗ7.4) , 振荡 lh后调 NaCl盐浓度为 0.9%，即得血红细胞溶胀破裂液。采用 Millipore Pellicon错流膜过滤系统对破裂液进行预处理。先采用 0.22 μπι膜微滤去除细胞碎片及大分子杂质，再进一步用截留分子量 10KD的膜超过滤除去小分子杂质。所得血红蛋白溶液经 DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析进一步纯化。采用 PEG伴随式层析，用含有 5 %PEG400的 20mM磷酸緩冲液，调节 pH值为 7.4进行层析，收集透过的血红蛋白峰经 SDS-PAGE电泳检测为一条带（图 1A和 B )。层析的回收率为 97%。操作温度为 10°C。用 HEMOX血气分析仪检测纯化后的血红蛋白的 50%氧饱和度 (P₅₀) 为 25.6mmHg, Hill系数为 2.41。实施例 2: 色谱纯无基质猪血红蛋白的制备

取一定体积洗净的新鲜猪血红细胞，用两倍体积的冷溶胀液（含 0.6 %NaCl的 20mmol/LKH₂PO₄/Na₂HPO₄ (PBS)緩冲液， pH7.4) 悬浮， 4°C 振荡 lh;以每分钟溶液总体积 10%的速度泵入 2倍红细胞体积的 20mmol/L PBS緩冲液（ρΗ7.4) , 振荡 lh后调 NaCl盐浓度为 0.9%, 即得血红细胞溶胀破裂液。采用 Millipore Pemcon.错流膜过滤系统对破裂液进行预处理。先采用 0.45 μ m膜微滤去除细胞碎片及大分子杂质, 再进一步用截留分子量 30KD的膜超过滤除去小分子杂质。所得血红蛋白溶液经 Q Sepharose Big Beads阴离子交换层析进一步纯化。操作温度为 4°C。采用 PEG伴随式层析，用含有 0.5%1¾04000的 20mM磷酸緩冲液，采用 10mM的磷酸緩冲液，调节 pH值为 7.8进行层析，收集透过的血红蛋白峰经高效凝胶过滤浚相色谱（HPLC )检测为单峰 (图 2) ，层析的回收率为 95 %。实施例 3 : 间 -马来酰亚胺苯曱酸 -N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS )—步交联人血红蛋白与人血清白蛋白

由于 HSA分子的巯基基团会与 1 BS反应，从而影响偶联反应。因此，在用 MBS活化 HSA前需要封闭剩余的巯基。向 10 ml的 5mg/ml HSA溶液

( pH 7.8的 HEPES緩冲液 )缓慢加入 0.2ml的 30mM碘代乙酰胺，室温下反应 20分钟。随后加入 0.5ml的 30mM MBS溶液 (溶于二甲基甲酰胺 ), 室温下反应 30分钟。反应混合液通过 Sephadex G-25凝胶过滤柱，除去过量的 MBS和碘代乙酰胺，收集蛋白组分。因血红蛋白分子有反应活性的巯基基团

( β-93半胱氨酸的巯蓦），活化的 HSA可直接与血红蛋白分子反应。收集的蛋白组分与 10 ml的 20 mg/ml血红蛋白溶液分别充氮气 2小时，混合后在氮气保护下于室温反应 2小时。随后，加入 0.2 ml的 30 mM碘乙酰胺来终止偶联反应。实施例 4: 乙二醇二缩水甘油醚两步法交联羊血红蛋白与人血清白蛋白

血红蛋白浓度 60mg/ml，溶液体系为 pH7.5的 50mM的 HEPES緩冲液、溶液总体系为 10ml, 乙二醇二缩水甘油醚与血红蛋白摩尔比为 500:1, 37°C水浴摇床反应 10小时，通过 Sephadex G-25凝胶过滤除修饰剂，换緩冲液为 pH9.5的 50mM的硼砂 -氢氧化钠緩冲液，按血红蛋白：白蛋白 =3: 1 (摩尔比）加入白蛋白， 37°C水浴摇床反应 48小时。交联产物经 SDS-PAGE电泳检测，结果显示有 83 kD和 97kD条带生成。血红蛋白单亚基分子量约为 16kD, 白蛋白分子量为 67kD， 83kD为单个血红蛋白亚基与血清白蛋白的交联物， 97W为交联的两个血红蛋白亚基与一个血清白蛋白的偶联物。说明生成了血红蛋白与血清白蛋白的偶联物。实施例 5: 戊二醛两步法交联狗血红蛋白与人血清白蛋白

白蛋白浓度 lmg/ml,溶液体系为 pH7.0的 50mM的 HEPES緩冲液、溶液总体系为 10ml,戊二醛与白蛋白摩尔比为 100:1, 37°C水浴摇床反应 1小时，通过 Sephadex G-25凝胶过滤除修饰剂，换緩冲液为 pH8.5的 50mM的硼酸 -硼砂緩冲液，按血红蛋白：白蛋白 =1 : 3加入血红蛋白，37°C水浴摇庆^ ^ 10小时。交联产物经 SDS-PAGE电泳检测，结果显示有 83 kD条带生成。血红蛋白单亚基分子量约为 16kD, 白蛋白分子量为 67kD, 83kD为单个血红蛋白'亚基与血清白蛋白的交联物，说明生成了血红蛋白与血清白蛋白的偶联物。实施例 6: 乙醇醛固相交联马血红蛋白与人血清白蛋白

用 50 mlvl HEPES緩冲液（ pH 6.6 )平衡 5 ml Q Sepharose Fast Flow介质 , 与 10 ml的 2 mg/ml血清白蛋白溶液混合，使蛋白吸附在介质上。加入乙醇醛，其与蛋白质的摩尔比为 500: 1 , 混匀后在 10°C下静置，并将柱封住。 2 小时后用 300 ml 50 mM HEPES緩沖液（ pH 6.6 )洗柱，随后改用含有 0.5 M NaCl的 50 mM HEPES緩冲液（pH 6.6 ) 洗脱，收集蛋白峰。收集物随后上用 50 mM HEPES緩冲 ( pH 6.6 )平衡的 Sephadex G-25凝胶过滤柱，脱去溶液中的 NaCl。收集含蛋白的洗脱液，超过滤浓缩至蛋白浓度为 5mg/ml, 加入等摩尔的血红蛋白，同时调节緩冲液 pH值 9.5,使活化的白蛋白所带交联剂与血红蛋白再继续反应 24小时，得到两种蛋白质的偶联物。实施例 7: 戊二醛固相交联牛血红蛋白与人血清白蛋白

用 50 mM碑酸緩冲液（ pH 8.0 ) 平衡 5 ml DEAE Sepharose Fast Flow 介质，与 10 ml的 5 mg/ml血红蛋白溶液混合，使蛋白吸附在介质上。加入交联剂戊二醛，其与蛋白质的摩尔比为 10: 1，混匀后在 4°C下静置，并将柱封住，血红蛋白在戊二醛的作用下分子内交联同时带上具有反应活性端的交联剂。 0.5小时后用 300 ml 50 mM磷酸緩冲液（ pH 8.0 ) 洗柱，随后改用含有 0.5 M NaCl的 50 mM HEPES緩冲液（ pH 8.0 ) 洗脱，收集蛋白峰。收集物随后上用 50 mM HEPES緩冲液（ pH 8.0 )平衡的 Sephadex G-25 凝胶过滤柱，脱去溶液中的 NaCl。收集含蛋白的洗脱液，超过滤浓缩至蛋白浓度为 lmg/ml，加入等摩尔的白蛋白，緩冲液 pH值仍为 8.0,使活化的血红蛋白的戊二醛醛基与白蛋白再继续反应 8小时，得到两种蛋白盾的偶联物。实施例 8: 偶联产物的纯化

用 300KD 和 100KD 的超滤膜除去聚合产物中大于 300K 和小于 100KD 的成分，所得产物为分子量分布在 100KD ~ 300KD之间的偶联产物，即 1 ~ 3个已经分子内交联或未分子内交联的血红蛋白与 1 3个人血清白蛋白分子的偶联物。实施例 9: 偶联产物的纯化

将实施例 6中偶联产物的 pH值调至 7.0, 上 DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析柱，该柱已用含有 0.1 M NaCl的 50 mM HEPES缓冲液（ pH 7.0 )平衡。用 25 ml平衡液洗脱 ₅ 流速为 0.5 ml/min。随后改用 55 ml含有 0.1-0.5 M NaCl的 50 mM HEPES缓冲液 ( pH 7.0 )洗脱，流速为 0.5 ml/min。洗脱液在 280 nm下检测，图谱见图 3。收集含有偶联物的蛋白峰，浓缩后上 Superdex 200凝胶过滤柱。以 50 mM HEPES緩冲液（ pH 7.0 )为流动相 , 流速为 0.35 ml/min。洗脱后在 280 nm下检测出现两个洗脱峰，其中偶联物在第一个洗脱峰（图 4 ),,收集用 SDS-PAGE凝胶电泳进一步鉴定（图 5 )。纯化的偶联物主要含两条蛋白带 (第 2泳道)，分子量约为 16 kDa和 83kDa。这是由于血红蛋白为四聚体蛋白，加入上样緩冲液煮沸后，解聚为 16 kDa的亚基。而血红蛋白与 HSA偶联后，四聚体蛋白中的 3个亚基解离出来，而剩下的 1个亚基与 BSA分子结合为分子量 83 l Da的蛋白。因此, 可确定该蛋白为 1:1 结合的 HSA-血红蛋白偶联物。实施例 10: 本血液代用品成品制得及特性

将纯化后的偶联产物的 pH值调至 7.4。对于受 2, 3—二碑 S史甘油酸影响的血红蛋白，需要向溶液中加入 2， 3— DPG或磷酸吡哆醛等调节血红蛋白氧亲和力的共价调节剂。实施例 7中偶联产物用 HEMOX血气分析仪检测纯化后的血红蛋白的 p₅₀为 26.8mmHg, Hill系数为 2.30 (图 6 )。

产品经高效凝胶过滤液相色谱（HPLC ) 与多角度激光散射检测器 ( MALLS, DAWN EOS ,Wyatt Technology Co. , USA )联用检测，将 HPLC 分离出的单峰进行分子量鉴定（图 7 )，色谱柱为 TSK 3000SW, 检测波长 280nm。结果表明， 88.5%为重均分子量 (Mw)138kD的血红蛋白与人血清白蛋白 1 : 1偶联物， 4.3 %为重均分子量 202kD的 2 ~ 4个蛋白偶联体, 未偶联的白蛋白和血红蛋白分别只占 4.5 %和 0.5%。产品组成单一，经测定其胶体渗透压（COP )为 21.5mmHg,接近人血液的正常胶体渗透压 25mmHg。而其它修饰血红蛋白产品组成复杂，分子量分布宽，胶体渗透压偏离正常值较大，如聚合血红蛋白的 COP—般在 lOmmHg以下，聚乙二醇（PEG ) 或聚氧乙烯（POE )修饰的血红蛋白 COP达 70mmHg以上，会影响体内的渗透压平衡。

实施例 11 : 产品的异常毒性试验

依据 2000版《中国生物制品规程》通则生物制品异常毒性试验规程，测试产品的异常毒性。实验动物为 5只 ICR小鼠（ 18 - 22克）和 2只普通级豚鼠（271.1-277.7克）。给药方式为腹腔注射，小鼠 0.5ml/只，豚鼠 5ml/ 只，观察 7天。观察期内，动物全部健存，无异常反应，到期每只体重均增加，产品的异常毒性试验合格。实施例 12: 对失血性休克大鼠救助试验

将麻醉的 SD 大鼠固定在酒精消毒的手术台上，在左大腿动脉和静脉以及右大腿动脉，分别插入直径 0.5mm的充满 0.3%肝素的聚乙烯管，其中右大腿动脉插管与多导生理记录仪联接，在线监测大鼠血压变化，以 0.5ml/min的速度从做大腿动脉抽取 30 %原血后，稳定 lOmin, 大鼠身体自行代偿，再以同样的速度继续抽血至 60 %原血，稳定 30min。此时大鼠血压降至原始血压的 25 %左右。再以 0.5ml/min的速度从左大腿静脉分别输入相同体积的偶联产品、纯化血红蛋白溶液、 HSA溶液、原血，以及三倍体积的乳酸盐溶液，救助失血性休克大鼠，将大鼠手术处缝合后饲养，观察生长状况， 14天仍健在则视为存活，每组 6只大鼠。结果只有偶联产品与原血回输的对照组大鼠存活达 14天（图 8 ), 说明本产品对失血性休克大鼠具有类似原血的救助效果。

实施例 13: 狗换血试验

将 6只 Beagle 狗麻醉，用蠕动泵从腿动脉抽血，同时从腿静脉输入偶联产品，并监测动脉血压变化。换血 50 %后监测 2小时，狗的血压基本维持在原始血压水平。将手术伤口缝合后，饲养并观察生长状况，狗在手术 2天后精神状态恢复正常，饲养 20天生长未出现异常，未有血红蛋白尿出现，血常规指标未见异常。

Claims

权利要求

1. 一种血红蛋白的偶联物，其特征在于，该偶联物为血红蛋白与人血清白蛋白的偶联物。

2. 根据权利要求 1 所述的血红蛋白的偶联物，其特征在于偶联物的分子量分布在 100KD - 300KD之间。

3. 根据权利要求 1 所述的血红蛋白的偶联物，其特征在于偶联物分子中血红蛋白分子数目为 1 ~ 3个，人血清白蛋白分子数目为 1 ~ 3个。

4. 根据权利要求 3 所述的血红蛋白的偶联物，其特征在于偶联物中血红蛋白分子数目为 1 ~ 2个, 人血清白蛋白分子数目为 1 ~ 2个。

5. 根据权利要求 4所述的血红蛋白的偶联物，其特征在于血红蛋白数目为 1 个，人血清白蛋白数为 1个。

6. 根据权利要求 1 ~ 4中任一项权利要求所述的血红蛋白的偶联物，其特征在于血红蛋白是分子内交联的血红蛋白。

7. 一种权利要求 1 所述的血红蛋白的偶联物的制备方法，包括无基质血红蛋白的制备、血红蛋白与人血清白蛋白的偶联以及偶联产物的纯化步骤。

8. 根据权利要求 7所述的血红蛋白的偶联物的制备方法，其特征在于无基质血红蛋白的制备方法是将膜过滤和离子交换层析集成纯化血红蛋白'，步骤如下：

1 ) 用 0.22 ~ 0.65 μ ηι膜微滤，得到的透过液经 10 ~ 30KD膜超滤；

2 ) 超过滤后的血红蛋白浓缩液经透过式阴离子交换层析，层析 pH 值为 6.6 ~ 8.5, 緩冲液浓度为 10mM ~ 50 mM，采用 PEG伴随式层析，选择 PEG400 - PEG4000,浓度为 0.25 % ~ 10 %，操作温度为 4 ~ 10°C。

9. 根据权利要求 7所述的血红蛋白的偶联物的制备方法，其特征在于血红蛋白与人血清白蛋白的偶联是在液相中将两种蛋白质直接与交联剂反应的一步偶联法，或者先修饰一种蛋白质再偶联另夕 I、一种蛋白质的两步偶联法，或者将蛋白质吸附在固相介质上进行偶联的方法。

10.根据权利要求 7所述的血红蛋白的偶联物的制备方法，其特征在于偶联产物的纯化方法选自离子交换层析、超过滤和凝胶过滤层析纯化方法中的一种或两种或三种方法。

11. 一种权利要求 1所述的血红蛋白偶联物在制备血液代用品中的用途。