WO2004101610A1

WO2004101610A1 - オリゴペプチド

Info

Publication number: WO2004101610A1
Application number: PCT/JP2004/006909
Authority: WO
Inventors: Yohei Hirai; Kiichiro Nakajima
Original assignee: Sumitomo Electric Industries, Ltd.
Priority date: 2003-05-16
Filing date: 2004-05-14
Publication date: 2004-11-25
Also published as: TW200505945A; KR20060036382A; US7560428B2; EP1626054A4; EP1626054A1; US20080051325A1; JPWO2004101610A1; AU2004238713A1

Abstract

　本発明の目的は、毛成長促進作用を有するオリゴペプチドを提供することである。本発明によれば、式（I）：Ｘ１-Ｘ２-Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（式中、Ｘ１は、Serなどのアミノ酸残基を示し、Ｘ２はIleなどのアミノ酸残基を示し、Ｘ３はGluなどのアミノ酸残基を示し、Ｘ４はGlnなどのアミノ酸残基を示し、Ｘ５はSerなどのアミノ酸残基を示し、Ｘ６は、カルボニル基を含有する修飾基が結合しているCysのアミノ酸残基、またはカルボニル基を含有する修飾基が結合しているLysのアミノ酸残基を示し、そしてＸ７はGluまたはAlaなどのアミノ酸残基を示す）等で表されるオリゴペプチドが提供される。

Description

明細書

ォリゴぺプチド技術分野

本発明は、毛成長促進作用を有するオリゴペプチド、及ぴ該オリゴペプチドを有効成分として含む医薬に関するものである。背景技術

上皮組織の正常な形態形成は上皮組織の周りに存在する間充織細胞由来の因子による制御を受けていることが示唆されており、また、上皮組織の形態形成異常に起因する疾患の多くが間充織細胞の異常を原因としていることから、間充織細胞が上皮組織の形態形成を制御するメカニズムの解明に興味がもたれている。しかしながら、上皮糸且織の形態形成の制御に関与する物質群は複雑な系の中で時間的及び空間的な制御を受けて発現されており、それらの物質を単離して機能を解析することは極めて困難であること、また、上皮組織の形態形成を単純化したモデル実験系の構築も難しいことなどの理由から、この分野の研究には今日まで大きな進展が見られていない。上皮組織の形態形成に起因する疾患の発症機序の解明やそれらの疾患の治療方法の確立などのために、上皮組織における形態形成の制御メカニズムの解析が切望されていた。

このような状況下にあって、上皮組織の形態形成の制御に関与するェピモルフィン（epimorphin) が分離 ·精製された（欧州特許公開第 0 5 6 2 1 2 3号（米国特許第 5， 726， 298号））。この物質は 277 ないし 289個のアミノ酸からなる蛋白質をコア ·蛋白質とする生理活性物質であり、主として間充織細胞により生合成されていることが明らかにされた。また、ェピモルフインは、上皮細胞に作用して上皮組織の形態形成を促進する作用を有していること、並びにェピモルフィンが機能しない場合には正常な組織形成が行われないことも明らかにされた。ェピモルフインの構造については、ェピモルフイン分子が構造上大きく 4個のフラグメントに分けられることが見いだされている（欧州特許公開第 0698666号)。すなわち、ェピモルフインの全長を構成するポリペプチドは、 N末端側より、コィルドコイル領域（1)、機能ドメイン（2)、コイルドコイル領域（3)、及び C末端の疎水性領域に分けることができる。これらのフラグメントのうち、機能ドメィン（ヒト .ェピモルフインでは N末端より 104番目から 187番目のアミノ酸により特定される領域）については、この領域が細胞接着に関与しており、ェピモルフィンの生理活性の発現に密接にかかわつていることが示唆されている（上掲欧州特許公開)。

ェピモルフインが正常な形態形成を促進する作用を有することから、この物質は、形態形成の異常に起因する疾患などの予防や治療のための医薬や、又は育毛剤などの医薬の有効成分として有用であることが期待される。しかしながら、哺乳類動物から得られた天然型ェピモルフィンは生理食塩水などの水性媒体に難溶であり、医薬として実用に供することが困難であった。このため、天然型ェピモルフィンの形態形成促進作用を実質的に保持しつつ、溶解性に優れたェピモルフイン誘導体を創製する試みがなされている。例えば、 C末端部の疎水性領域を除去した改変体（フラグメント 123) などが知られている.（欧州特許公開第 0 5 6 2 1 2 3号（米国特許第 5, 726, 298号)）。

ェピモルフィンの部分構造を有するポリぺプチドが上皮細胞に作用して上皮,袓織の形態形成を促進することが知られている（欧州特許公開第 1 0 0 8 6 0 3号)。このポリぺプチドは生理食塩水などの水性媒体に溶解可能なポリぺプチドであり、上記刊行物には、該ポリぺプチドが毛成長促進作用を有することが教示されている。また、欧州特許公開第 1 2 8 8 2 2 1号には、ェピモルフインの部分構造であるオリゴペプチドであって、毛成長促進作用を有するオリゴペプチドが開示されている。発明の開示

本発明の課題は、毛成長促進作用を有するオリゴぺプチドを提供することにある。本発明の別の課題は、精製効率の高い上記オリゴペプチドを提供することである。本発明のさらに別の課題は、上記のオリゴぺプチドを有効成分として含む医薬を提供することにある。

本発明者は上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、ェピモルフインの部分構造であるオリゴぺプチド中の Cys残基または Lys残基をカルボ二ル基を含有する修飾基により修飾することにより得たオリゴペプチドが、優れた毛成長促進作用を有していることを見出した。さらに本発明者らは、ェピモルフインの部分構造であるオリゴぺプチド中のァミノ酸配列中に連結基を導入して分子内に環構造を形成することによって得られるオリゴぺプチドが、優れた精製効率を示すと同時に優れた毛成長促進作用を有していることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。

すなわち本発明によれば、下記の式（I) から（IV) の何れかのアミノ酸配列を含む 5から 100アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって、毛成長促進作用を有するオリゴぺプチドまたはその修飾オリゴぺプチドが提供される。

X 1-X-2-X 3-X4-X 5-X6-X7 (I)

X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7 (II)

X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7 (III)

X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7 (IV)

(式中、 X Iは、 Ser、 Ala, Tyr、 Thr、 Pro, Phe、 Val、 Gly、 Leu、 lie または Metのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X2は、 Ile、 Gly、 Asn、 Thr、 Val、 Ser、 Phe、 Leu、 Ala, Pro、 Cysまたは Met のアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X3は、 Glu、 Lys, Gln、 Arg、 Ala、 Val、 Trp、 Cysまたは Aspのアミノ酸残基を示し、

X4は、 Gln、 Pro、 Glu、 Thr、 Arg、 Ser、 His, Cysまたは Lysのアミノ酸残基を示し、

X 5は、 Ser、 Trp、 Phe、 Thr、 Cys、 Tyr、 Pro, Ala、 Gly、 Val、 Leu、 lie または Metのアミノ酸残基を示し、

X6は、カルボ二ル基を含有する修飾基が結合している Cys のアミノ酸残基、またはカルボ二ル基を含有する修飾基が結合している Lysのアミノ酸残基を示し、そして

X7は、 Asp、 Glu、 His, Ser、 Ala、 Gly、 Asn、 Tyr、 Argまたは Leuのァミノ酸残基を示すか、あるいは欠失している。）

好ましくは、 XIは Serアミノ酸残基を示し、 X 2は lieのアミノ酸残基を示し、 X 3は Gluのアミノ酸残基を示し、 X4は Ginのアミノ酸残基を示し、 X5 は Serのァミノ酸残基を示し、 X 6はカルボ二ル棊を含有する修飾基が結合している Cysのアミノ酸残基を示し、そして X.7は Gluまたは Alaのアミノ酸残基を示す。

好ましくは、上記式（I) から（IV) の何れかのアミノ酸配列から成る 5から 7ァミノ酸残基から成るオリゴペプチドが提供される。

本発明の別の側面によれば、下記の式（XI) から（XIV) の何れかのアミノ酸配列を含む 6から 100アミノ酸残基から成るオリゴぺプチドであって、毛成長促進作用を有するオリゴぺプチドまたはその修飾オリゴぺプチドが提供される。 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (XI)

X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7-X8-X9 (XII)

X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7-X8-X9 (XIII)

X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7-X8-X9 (XIV)

(式中、 X Iは、 Ser、 Ala、 Tyr、 Thr、 Pro, Phe、 Val、 Gly、 Leu, lie または Metのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X2は、 Ile、 Gly、 Asn、 Thr、 Val、 Ser, Phe、 Leu、 Ala、 Pro_s Cysまたは Met のアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X 5は、 Ser、 Trp、 Phe、 Thr、 Cys、 Tyr、 Pro, Ala, Gly、 Val、 Leu、 lie または Metのァミノ酸残基を示し、

X 6は、カルボ二ル基を含有する修飾基が結合している Cys のアミノ酸残基、または力ルポ二ル基を含有する修飾基が結合している Lysのアミノ酸残基を示し、

X 7は、 Asp、 Glu、 His、 Ser、 Ala、 Gly、 Asn、 Tyr、 Argまたは Leuのァミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X 8は、 Ginのアミノ酸残基を示し、そして

X 9は、 Asp、 Glu、 His、 Ser、 Ala、 Gly、 Asn、 Tyr、 Argまたは Leuのァミノ酸残基を示す。）

好ましくは、 X 7及ぴ X 9の少なくとも片方は、 Asp のアミノ酸残基以外のァミノ酸残基である。

さらに好ましくは、 X Iは Serアミノ酸残基を示し、 X 2は lieのアミノ酸残基を示し、 X 3は Gluのァミノ酸残基を示し、 X 4は Ginのァミノ酸残基を示し、 X 5は Serのァミノ酸残基を示し、 X 6はカルボ二ル基を含有する修飾基が結合している Cysのァミノ酸残基を示し、 X 7は Gluまたは Alaのァミノ酸残基を示し、 X 8は Ginのァミノ酸残基を示し、そして X 9は Gluのァミノ酸残基を示す。好ましくは、上記式（XI) から（XIV) の何れかのアミノ酸配列から成る 7から 9ァミノ酸残基から成るオリゴペプチドが提供される。

好ましくは、 X 6は、末端にカルボキシル基を有する修飾基が結合している Cys のアミノ酸残基、または末端にカルボキシル基を有する修飾基が結合している Lysのアミノ酸残基を示す。

好ましくは、修飾基内においてカルボ二ル基は炭素数 2から 1 0の炭化水素鎖に結合している。

好ましくは、修飾基内においてカルボ二ル基は炭素数 3から 7の炭化水素鎖に結合している。

好ましくは、修飾基は、 N— ]3—マレイミドプロピオン酸に由来する修飾基、 N— ε —マレイミドカプロン酸に由来する修飾基、または Ν _ Κ —マレイミドウンデカン酸に由来する修飾基である。

好ましくは、以下の何れかのオリゴぺプチドまたはその修飾オリゴぺプチドが提供される。

Ser- Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Ala-Gln-Glu (配列番号 1 )

Ser- Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Glu-Gln-Glu (配列番号 2 )

Ser- Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Glu-Gln-Glu-Ala (配列番号 3 )

(式中、 Xaa は、 N— ε —マレイミドカプロン酸に由来する修飾基が結合している Cysのアミノ酸残基を示す。）

本発明の別の側面によれば、上記した何れかに記載のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む、医薬並びに毛成長促進剤が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、上記の医薬または毛成長促進剤の製造のための上記のオリゴぺプチドまたはその修飾オリゴぺプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩の使用；及ぴ毛の成長促進方法であって、上記のオリゴぺプチドまたはその修飾ォリゴぺプチドあるいは生理学的に許容されるその塩の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、下記の式（1 ) のアミノ酸配列から成り、毛成長促進作用を有する環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチドが提供される。

X1— X2— X3— X4—X5— X6— X7— Y (1 ) '—— L- Cys 1

(式中、 X 1は、 Ser、 Ala、 Tyr、 Thr、 Pro、 Phe、 Val、 Gly、 Leu、 lie または Metのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X 2は、 Ile、 Gly、 Asn、 Thr、 Val、 Ser、 Phe、 Leu、 Ala、 Pro, または Metのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、 X 3は、 Glu、 Lys、 Gln、 Arg、 Ala、 Val、 Trp、または Aspのアミノ酸残基を示し、

X 4は、 Gln、 Pro, Glu、 Thr、 Arg、 Ser、 His、または Lys のアミノ酸残基を示し、

X 5は、 Ser、 Trp、 Phe、 Thr、 Tyr、 Pro、 Ala、 Gly、 Val、 Leu、 lie.または Met のアミノ酸残基を示し、

X 6は、 Cysのアミノ酸残基を示し、

X 7は、 Asp, Glu、 His、 Ser、 Ala、 Gly、 Asn、 Tyr、 Argまたは Leuのァミノ酸残基を示すか、あるいは欠失し、

Yは、欠失している力 \ 1〜9 0個のアミノ酸配列を示し、

Lは連結基を示す。）

好ましくは、 X 1が Serアミノ酸残基を示し、 X 2が lieのアミノ酸残基を示し、 X 3が Gluのアミノ酸残基を示し、 X 4が Ginのアミノ酸残基を示し、 X 5 が Serのアミノ酸残基を示し、 X 6が Cysのアミノ酸残基を示し、そして X 7が Gluまたは Alaのアミノ酸残基を示す。

好ましくは、 Yは欠失しているか、又は 1〜1 2個のアミノ酸配列を示す。好ましくは、下記の式（2 ) 力ら成るアミノ酸配列を有し、毛成長促進作用を有する環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチドが提供される。

X1— X2—X3— X4— X5— X6—X7— X8—X9 (2) I ~ L一 Cys 1

X 2は、 Ile、 Gly、 Asn、 Thr、 Val、 Ser、 Phe、 Leu、 Ala、 Pro、または Metのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X 3は、 Glu、 Lys、 Gin, Arg、 Ala, Val、 Trp、または Asp のアミノ酸残基を示し、 X 4は、 Gln、 Pro、 Glu、 Thr、 Arg、 Ser、 His、または Lys のアミノ酸残基を示し、

X 5は、 Ser、 Trp、 Phe、 Thr、 Tyr、 Pro、 Ala、 Gly、 Val、 Leu、 lieまたは Met のアミノ酸残基を示し、

X 6は、 Cysのアミノ酸残基を示し、

X 7は、 Asp、 Glu、 His、 Ser、 Ala、 Gly、 Asn、 Tyr、 Argまたは Leuのァミノ酸残基を示すか、あるいは欠失し、

X 8は、 Ginのアミノ酸残基を示し、そして

X 9は、 Asp、 Glu、 His、 Ser、 Ala、 Gly、 Asn、 Tyr、 Argまたは Leuのァミノ酸残基を示し、

Lは連結基を示す。）

好ましくは、 X 7及び X 9の少なくとも片方は Aspのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である。

好ましくは、 X Iが Serアミノ酸残基を示し、 X 2が lieのアミノ酸残基を示し、 X 3が Gluのアミノ酸残基を示し、 X 4が Ginのアミノ酸残基を示し、 X 5 が Serのアミ/酸残基を示し、 X 6が Cysのアミノ酸残基を示し、 X 7が Gluまたは Alaのアミノ酸残基を示し、 X 8が Ginのアミノ酸残基を示し、そして X 9 が Gluのアミノ酸残基を示す。

本発明の別の側面によれば、下記の式（3 ) のアミノ酸配列から成り、毛成長促進作用を有する環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチドが提供される。

X1 -X2 -X3 -X4-X5 -X6 -X7 -Y (3)

(式中、 X Iは、 Ser、 Ala、 Tyr、 Thr、 Pro、 Phe、 Val、 Gly、 Leu、 lie または Metのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X 2は、 Ile、 Gly、 Asn、 Thr、 Val、 Ser、 Phe、 Leu、 Ala、 Pro、または Metのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、 X 3は、 Glu、 Gln、 Arg、 Ala, Val、 Trp、または Aspのアミノ酸残基を示し、 X 4は、 Gln、 Pro、 Glu、 Thr、 Arg、 Ser、または Hisのアミノ酸残基を示し、

X 5は、 Ser, Trp、 Phe、 Thr、 Tyr、 Pro, Ala、 Gly、 Val、 Leu, lieまたは Met のアミノ酸残基を示し、

X 6は、 Lysのアミノ酸残基を示し、

Yは、欠失している力 1〜9 0個のアミノ酸配列を示し、

Lは連結基を示し、

Zは、 Lysと反応して結合できる基を示す。）

好ましくは、 X Iが Serアミノ酸残基を示し、 X 2が lieのアミノ酸残基を示し、 X 3が Gluのアミノ酸残基を示し、 X 4が Ginのアミノ酸残基を示し、 X 5 が Serのアミノ酸残基を示し、 X 6が Cysのアミノ酸残基を示し、そして X 7が Gluまたは Alaのアミノ酸残基を示す。

好ましくは、 Yは欠失しているか、又は 1〜1 2個のアミノ酸配列を示す。好ましくは、下記の式（4 ) 力ら成るアミノ酸配列を有し、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドが提供される。

X1— X2— X3— X4—X5— X6— X7— X8— X9 (4)

L し一 _z 1

(式中、 X Iは、 Ser、 Ala、 Tyr、 Thr、 Pro, Phe、 Val、 Gly、 Leu、 lie または Metのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X 3は、 Glu、 Gln、 Arg、 Ala、 Val、 Trp、または Aspのアミノ酸残基を示し、 X 4は、 Gln、 Pro、 Glu、 Thr、 Arg、 Ser、または Hisのアミノ酸残基を示し、 X 5は、 Ser, Trp、 Phe、 Thr、 Tyr、 Pro, Ala、 Gly、 Val、 Leu, lieまたは Met のアミノ酸残基を示し、

X 6は、 Lysのァミノ酸残基を示し、

X 7は、 Asp、 Glu、 His、 Ser、 Ala, Gly、 Asn、 Tyr、 Argまたは Leuのァミノ酸残基を示すか、あるいは欠失し、

X 8は、 Ginのアミノ酸残基を示し、そして

X 9は、 Asp、 Glu、 His, Ser、 Ala、 Gly、 Asn、 Tyr、 Argまたは Leuのァミノ酸残基を示し、

Lは連結基を示し、

Zは、 Lysと反応して結合できる基を示す。）

好ましくは、 X 7及ぴ X 9の少なくとも片方は Aspのァミノ酸残基以外のァミノ酸残基である。

好ましくは、 X 1が Serアミノ酸残基を示し、 X 2が lieのアミノ酸残基を示し、 X 3が Gluのアミノ酸残基を示し、 X 4が Ginのアミノ酸残基を示し、 X 5 が Serのアミノ酸残基を示し、 X 6が Cysのアミノ酸残基を示し、 X 7が Gluまたは Alaのアミノ酸残基を示し、 X 8が Ginのアミノ酸残基を示し、そして X 9 が Gluのァミノ酸残基を示す。

好ましくは、連結基 Lの炭素数は 6から 8である。

好ましくは、連結基 L内においてカルボニル基が炭素数 5から 7の炭化水素鎖に結合している。

好ましくは、連結基 Lは、一C O— ( C H ₂) _n - NH - (式中、 nは 5〜7の整数を示す）である。

好ましくは、連結基 L中の一 C Oが X 1と結合し、連結基 L中の NH—が、 X 6に結合している Cys残基又は Zで表される基と結合している。

特に好ましくは、以下の何れかの環状ォリゴぺプチド又はその修飾ォリゴぺプチドが提供される。 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala-Gln-Glu (1 1 ) Lc〇（CH2) ₅NH-Cys ~ I

Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala-Gln-Glu (12) LcO(CH₂) 7 N H-Cys— I

Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala (■] ₃)

LcO(CH₂)₅ NH-Cys ~ I

Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys (14) LcO (CH₂)₅ NH-Cys ~ I 本発明のさらに別の側面によれば、上記した何れかの環状ォリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む、医薬並びに毛成長促進剤が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、上記した何れかの環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩、並びにミノキシジルを有効成分として含む毛成長促進剤が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、上記の医薬または毛成長促進剤の製造のための上記環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩の使用；及び毛の成長促進方法であって、上記環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチドあるいは生理学的に許容されるその塩の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が提供される。図面の簡単な説明図 1は、合成したオリゴペプチド、並びに修飾試薬との反応産物を、液体クロマトグラフィーを用いて解析した結果を示す。

図 2は、合成したオリゴペプチド、並びに修飾試薬との反応産物を、液体クロマトグラフィーを用いて解析した結果を示す。

図 3は、合成したオリゴペプチド、並びに修飾試薬との反応産物を、液体クロマトグラフィーを用いて解析した結果を示す。

図 4は、各種のオリゴぺプチドの毛成長促進作用を評価した結果を示す。図 5は、各種のオリゴぺプチドの毛成長促進作用を評価した結果を示す。図 6は、化合物（1 1) の HP LCによる分析結果を示す。

図 7は、化合物（12) の HP LCによる分析結果を示す。

図 8は、化合物（13) の HP LCによる分析結果を示す。

図 9は、化合物（14) の HP LCによる分析結果を示す。

図 10は、本発明の環状オリゴぺプチドの毛成長促進作用を示す。

図 11は、本発明の環状オリゴぺプチドの毛成長促進作用を示す。

図 12は、本発明の環状オリゴぺプチドとミノキシジルとを併用した場合の毛成長促進作用を示す。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

本発明の第一の態様のオリゴペプチドは、下記の式（I) から（IV) の何れかのァミノ酸配列を含む 5から 100ァミノ酸残基から成るォリゴぺプチドであつて、毛成長促進作用を有するオリゴぺプチドである。

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (I)

X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7 (II)

X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7 (III)

X 1-X2-X6-X3-X4-X5-X7 (IV)

X2は、 Ile、 Gly_s Asn、 Thr、 Val、 Ser、 Phe、 Leu、 Ala、 Pro、 Cysまたは Met のアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X3は、 Glu、 Lys、 Gln、 Arg, Ala, Val、 Trp、 Cysまたは Aspのアミノ酸残基を示し、

X4は、 Gln、 Pro, Glu、 Thr、 Arg、 Ser、 His、 Cysまたは Lysのアミノ酸残基を示し、

X 5は、 Ser、 Trp、 Phe、 Thr、 Cys、 Tyr、 Pro、 Ala Gly、 Val、 Leu, lie または Metのアミノ酸残基を示し、

本発明の第二の態様のオリゴペプチドは、下記の式（XI) から（XIV) の何れかのアミノ酸配列を含む 6から 100アミノ酸残基から成るオリゴぺプチドであつて、毛成長促進作用を有するオリゴぺプチド：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (XI)

X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7-X8-X9 (XII)

X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7-X8-X9 (XIII)

X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7-X8-X9 (XIV)

(式中、 X 1から X 7は上記と同様のアミノ酸残基を示し、 X8は、 Gin のアミノ酸残基を示し、そして X 9は、 Asp、 Glu、 His、 Ser、 Ala, Gly、 Asn、 Tyr、 Arg または Leuのアミノ酸残基を示す。）

なお、本発明においては、 X 7及ぴ X 9の少なくとも片方が Aspのアミノ酸残基以外のァミノ酸残基であることが好ましい。 X 7及ぴ X 9の少なくとも片方が、 Aspのァミノ酸残基以外のァミノ酸残基である場合は、 X 7及ぴ X 9がともに Asp のアミノ酸残基である場合に生じることがあるァスパラギン酸に起因する ]3転移 (スクシィミド）が起こることがなく合成収率が向上するためである。 X 7が Asp のァミノ酸残基以外のァミノ酸残基であればより好ましい。 X 7の Aspが β転移を生じることが多いためである。

上記のアミノ酸配列（I)から（IV) 並びに（XI) から（XIV) は、欧州特許公開第 1 0 0 8 6 0 3号に開示されたポリべプチド（II)の C -末端から 1 1個のアミノ酸残基において、 Ν -末端から 1個のアミノ酸残基（Lys) および C -末端から 2 個のアミノ酸残基（Asp-Glu) を除いたアミノ酸配列、または該アミノ酸配列においてさらにシスティン残基（Cys) の位置を変更したアミノ酸配列であって、当該 Cys残基を、カルボ二ル基を含有する修飾基が結合している Cysのアミノ酸残基、またはカルボ二ル基を含有する修飾基が結合している Lysのアミノ酸残基に置き換えたアミノ酸配列をベースにして、さらに 1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列である。上記アミノ酸配列（I)〜（IV) 並びに（XI) から（XIV) を含むオリゴペプチドは、下記の実施例に具体的に示すように優れた毛成長促進作用を有している。

アミノ酸配列（I)から（IV) 並びに（XI) から（XIV) において、 X 6は、カルポニル基を含有する修飾基が結合している Cysのアミノ酸残基、またはカルボ二ル基を含有する修飾基が結合している Lysのアミノ酸残基を示す。

本発明の好ましい態様によれば、修飾基は、末端にカルボキシル基を有する修飾基である。また、本発明のさらに好ましい態様によれば、修飾基内において力ルポ二ル基は炭素数 2から 1 0の炭化水素鎖、さらに好ましくは炭素数 3力ら 7 の炭化水素鎖に結合している。

本発明において X 6がカルボ二ル基を含有する修飾基が結合している Cysのァミノ酸残基を示す場合の修飾基の具体例としては、好ましくは、 N— β一マレイミドプロピオン酸に由来する修飾基、 Ν— ε—マレイミドカプロン酸に由来する修飾基、または Ν _ κ—マレイミドウンデカン酸に由来する修飾基などを挙げることができる。このような修飾基は、 Ν— —マレイミドプロピオン酸、 Ν— ε 一マレイミドカプロン酸または N— κ—マレイミドウンデカン酸などの試薬とォリゴペプチドとを反応させることにより、オリゴペプチド中のシスティン残基のスルフヒドリル基と上記試薬とを反応させ、これによりオリゴペプチド中のシスティン残基に導入することができる。

また本発明において X 6がカルボ二ル基を含有する修飾基が結合している Lys のァミノ酸残基を示す場合の修飾基の具体例としては、上記した X 6が力ルポ二ル基を含有する修飾基が結合している Cysのアミノ酸残基を示す場合と同様である。

本発明のオリゴペプチドは、式（I) から（IV) 又は（XI) から（XIV) の何れかのアミノ酸配列を含む 5から 1 0 0アミノ酸残基から成るオリゴペプチドである。例えば、アミノ酸残基の数の下限値は、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、 1 1、 1 2、 1 3、 1 4または 1 5の何れでもよく、上限値は 1 5、 2 0、 2 5、 3 0、 3 5、 4 0、 4 5、 5 0、 6 0、 7 0、 8 0、 9 0または 1 0 0の何れでもよレ、。アミノ酸残基の数は好ましくは 5から 4 0、より好ましくは 6から 3 0、さらに好ましくは 7から 2 0、さらに好ましくは 7から 1 5、さらに好ましくは 7から 1 2であり、特に好ましくは 7から 1 0の範囲内である。アミノ酸残基の数は、オリゴぺプチドが生理食塩水又は水などの水性媒体に可溶であり、生物学的活性を有するように選択することが望ましい。

本発明の第三の態様によるオリゴペプチドは、下記の式（1 ) のアミノ酸配列から成り、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴぺプチドである。

X1一 X2— X3— X4— X5—X6— X7— Y (1 ) '—— L一 Cys '

(式中、 X Iは、 Ser、 Ala, Tyr、 Thr、 Pro、 Phe、 Val、 Gly、 Leu、 lie または Metのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X 2は、 Ile、 Gly、 Asn、 Thr、 Val、 Ser、 Phe、 Leu、 Ala、 Pro, または Metのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X 3は、 Glu、 Lys、 Gin, Arg、 Ala、 Val、 Trp、または Asp のアミノ酸残基を示し、

X 5は、 Ser、 Trpゝ Phe、 Thr、 Tyr、 Pro、 Ala、 Gly、 Val、 Leu、 lieまたは Met のアミノ酸残基を示し、

X 6は、 Cysのアミノ酸残基を示し、

Yは、欠失しているか、 1〜9 0個のアミノ酸配列を示し、

Lは連結基を示す。）

上記オリゴペプチドの好ましい具体例としては、下記の式（2 ) から成るアミノ酸配列を有し、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドが挙げられる。

X1— X2— X3— X4— X5— X6— X7— X8— X9 (2) I ~ L- Cys ¹

(式中、 1〜 7ぉょびは、式（1 ) と同義であり、

X 8は、 Ginのアミノ酸残基を示し、そして

X 9は、 Asp、 Glu、 His, Ser、 Ala、 Gly、 Asn、 Tyr、 Argまたは Leuのァミノ酸残基を示す。）

本発明の第四の態様のオリゴペプチドは、下記の式（3 ) のアミノ酸配列から成り、毛成長促進作用を有する環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチドである。 X1一 X2— X3— X4—X5— X6— X7— Y (3)

X 3は、 Glu、 Gln、 Arg、 Ala、 Val、 Trp、または Aspのアミノ酸残基を示し、 X 4は、 Gln、 Pro, Glu、 Thr、 Arg、 Ser、または Hisのアミノ酸残基を示し、 X 5は、 Ser、 Trp、 Phe、 Thr、 Tyr、 Pro, Ala、 Gly、 Val、 Leu、 lieまたは Met のアミノ酸残基を示し、

X 6は、 Lysのアミノ酸残基を示し、

X 7は、 Asp、 Glu、 His, Ser、 Ala、 Gly、 Asn、 Tyr、 Argまたは Leuのァミノ酸残基を示すか、あるいは欠失し、

Yは、欠失している力、 1〜9 0個のアミノ酸配列を示し、 ' Lは連結基を示し、

Zは、 Lysと反応して結合できる基を示す。）

上記オリゴペプチドの好ましい具体例としては、下記の式（4 ) から成るアミノ酸配列を有し、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴぺプチドが挙げられる。

X1— X2— X3— X4— X5— X6—X7— X8— X9 (4)

L _L _ z 1

(式中、 X 1〜X 7、 Lおよび Zは、式（3 ) と同義であり、

X 8は、 Ginのアミノ酸残基を示し、そして

なお、本発明においては、 X 7及ぴ X 9の少なくとも片方が Aspのアミノ酸残基以外のァミノ酸残基であることが好ましい。 X 7及ぴ X 9の少なくとも片方が、 Aspのァミノ酸残基以外のァミノ酸残基である場合は、 X 7及ぴ X 9がともに Asp のアミノ酸残基である場合に生じることがあるァスパラギン酸に起因する /3転移 (スクシイミド）が起こることがなく合成収率が向上するためである。 X 7が Asp のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基であればより好ましい。 X 7の Aspが jS転移を生じることが多いためである。

上記のアミノ酸配列は、欧州特許公開第 1 0 0 8 6 0 3号に開示されたポリぺプチド（II)の C-末端から 1 1個のアミノ酸残基において、 N -末端から 1個のアミノ酸残基'（Lys) および C -末端から 2個のアミノ酸残基（Asp- Glu) を除いたアミノ酸配列をベースにしたアミノ酸配列である。

上記した本発明の環状オリゴペプチドは、下記の実施例で具体的に示す通り、 3 0 %ァセトニトリル、 0 . 1 %トリフルォロ酢酸で処理し、乾燥した後においても優れた毛成長促進作用を発揮できる。 3 0 %ァセトニトリル、 0 . 1 %トリフルォロ酢酸での処理は、逆相クロマトグラフィーによる精製時にオリゴぺプチドが供される条件でもあることから、本発明の環状オリゴペプチドは逆相クロマトグラフィーを使用して精製することができ、これにより精製効率を高めることができる。

アミノ酸配列（1 ) から（4 ) において、 X 6は Cysまたは Lysのアミノ酸残基を示し、特に好ましくは、 X 6は Cysのアミノ酸残基を示す。

本発明の環状オリゴペプチドにおいては、 X Iと X 6とが、一 L—Cys _ (式中、 Lは X 1と結合している連結基を示し、 Cysは X 6と結合している Cys残基を示す）または一L一 Z (式中、 Lは X 1と結合している連結基を示し、 Zは Lys と反応して結合できる基を示す）を介して結合して分子内環構造を形成していることを特徴とする。 Zで表される Lysと反応して結合できる基の具体例としては、 N—ヒドロキシサクシンィミドエステル基、ィミドエステル基、ヒドロキシメチルフォスフィン基などが挙げられる。

Lで表される連結基の具体例としては、炭素数が 6力ら 8の連結基が挙げられ、例えば、カルボニル基が炭素数 5から 7の炭化水素鎖に結合している連結基などが挙げられる。連結基 Lの具体例としては、一 C O— ( C H ₂) _n— NH _ (式中、 nは 5〜7の整数を示す）が挙げられる。上記の連結基 L中において、一 C Oは X 1と結合し、 NH—は、 X 6に結合している Cys残基または Zと結合することができる。

本発明の環状オリゴペプチドは、式（1 ) 又は（3 ) のアミノ酸配列を有する 5から 9 8アミノ酸残基から成るオリゴペプチドである。アミノ酸残基の数は好ましくは 5から 2 0、より好ましくは 7から 1 5、さらに好ましくは 7から 1 2 であり、特に好ましくは 7から 1 0の範囲内である。アミノ酸残基の数は、オリゴぺプチドが生理食塩水又は水などの水性媒体に可溶であり、生物学的活性を有するように選択することが望ましい。

以下、上記した第一の態様から第四の態様までのオリゴペプチド（即ち、式（I) から（IV) の何れかのアミノ酸配列を含む 5から 1 0 0アミノ酸残基から成るォリゴぺプチドであって、毛成長促進作用を有するオリゴぺプチド；式（XI) から (XIV) の何れかのアミノ酸配列を含む 5から 1 0 0アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって、毛成長促進作用を有するオリゴペプチド；式（1 ) のアミノ酸配列から成り、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド；及ぴ、式（3 ) のァミノ酸配列から成り、毛成長促進作用を有する環状ォリゴぺプチド）を本発明のオリゴぺプチドと称する。

本発明のオリゴペプチドにおけるアミノ酸残基の種類は特に限定されず、天然型アミノ酸残基、非天然型アミノ酸残基、又はそれらの誘導体の何れでもよい。即ち、即ち、アミノ酸としては L—アミノ酸であってもよいし、 D—アミノ酸であってもよいし、これらの混合物でもよい。また、アミノ酸の種類としては、 a 一アミノ酸、 ]3—アミノ酸、アミノ酸、 δ—アミノ酸の何れでもよいが、天然型ァミノ酸であるーァミノ酸が好ましい。本明細書で言う非天然型ァミノ酸とは、天然型蛋白質を構成する天然型ァミノ酸 2 0種類（グリシン、 Lーァラニン、 L一パリン、 L一口イシン、 L—イソ口イシン、 Lーセリン、 L—トレオニン、 Lーァスパラギン酸、 L—グルタミン酸、 Lーァスパラギン、 L—グルタミン、 L一リシン、 L—アルギニン、 L—シスチン、 L—メチォニン、 L—フエ二ルァラニン、 Lーチロシン、 L—トリプトファン、 L一ヒスチジン、 L—プロリン）以外の全てのアミノ酸を意味し、具体的には、（1 )天然型アミノ酸中の原子を他の物質で置換した非天然型アミノ酸、（2 ) 天然型ァミノ酸の側鎖の光学異性体、（ 3 )天然型ァミノ酸の側鎖に置換基を導入した非天然型アミノ酸、並びに（4 ) 天然型アミノ酸の側鎖を置換して疎水性、反応性、荷電状態、分子の大きさ、水素結合能などを変化させた非天然型ァミノ酸などが挙げられる。

本発明のオリゴペプチドの別の態様は、上記のアミノ酸配列（I) から（IV)、 (XI) から（XIV) を含む 5から 1 0 0アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって毛成長促進作用を有するオリゴぺプチドの修飾オリゴぺプチドであって、上記した本発明のオリゴぺプチドと同様の毛成長促進作用を有する修飾オリゴぺプチドである。

本発明のオリゴペプチドの別の態様は、上記のアミノ酸配列（1 ) から（4 ) の何れかを含む 7から 9 8アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって毛成長促進作用を有するオリゴぺプチドの修飾オリゴぺプチドであって、上記した本発明のオリゴペプチドと同様の毛成長促進作用を有する修飾オリゴペプチドである。本発明のオリゴぺプチド又は修飾オリゴぺプチドが、毛成長促進作用を有することは、本明細書の実施例に詳細かつ具体的に記載した試験方法によって、又は上記試験方法に適宜の改変や修飾を加えることにより、当業者が容易に確認可能である。このような方法の具体例としては、以下の方法が挙げられるがこれらに限定されるものではない。

( 1 ) C3Hや C57BL/6マウスは生後 45日から 95日前後まで約 50日間休止期が続くことが知られている。また、休止期ではピンク、成長期ではグレー又はクロと皮膚の色が変化するため、毛周期の判定が容易である。このマウスを使用し、被験物質の投与により、成長期への移行が促進されるか否か評価することにより、育毛活性を評価することが可能である。

( 2 ) 上皮性の新生毛包に存在する抗原（例えば、約 2 2 0 k D aの抗原が挙げられる）を特異的に認識するモノクローナル抗体（例えば、受託番号 F E RM B P— 8 1 2 1を有するハイプリドーマが産生するモノクローナル抗体）またはその断片を用いて育毛活性を評価することができる。より具体的には、生体由来の皮膚組織を被験物質の存在下で培養し、該皮膚組織片を回収し、上記のモノクローナル抗体またはその断片と反応させ、皮膚組織片と反応した該モノクローナル抗体またはその断片を検出または測定することにより、上皮性の新生毛包に存在する抗原の発現量を測定し、育毛活性を評価することができる。あるいは、皮膚を切断して被験物質の存在下で培養し、その培養物中の蛋白質と前記モノクロ一ナル抗体を反応させた結果により、育毛活性を評価することができる。

本発明の修飾オリゴペプチドにおいて、「修飾」という用語は、化学的修飾及び生物学的修飾を含めて最も広義に解釈しなければならない。修飾の例としては、例えば、アルキル化、エステル化、ハロゲン化、又はアミノ化などの官能基導入、酸化、還元、付加、又は脱離などによる官能基変換、糖化合物（単糖、二糖、ォリゴ糖、若しくは多糖）又は脂質化合物などの導入、リン酸化、あるいはビォチン化などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。

好ましい修飾オリゴぺプチドとしては、ビォチン化されたオリゴぺプチドを挙げることができ、より好ましくは修飾オリゴペプチドとして、スぺーサを介して又はスぺーサーを介さずにピオチンが N-末端に結合したオリゴペプチドを挙げることができる。上記の修飾オリゴペプチドにおいて、ビォチンには所望の生理活性を損なわない限りにおいて適宜の化学的修飾が施されていてもよい。適宜の長さのスぺーサーを介してピオチンをオリゴペプチドの N-末端に導入するためには、例えば、 NHS- B.iotin又は NHS- LC- Biotin (いずれもピアース社から入手できる）などを用いることができる。上記した本発明の各種のオリゴペプチド（修飾オリゴペプチドも含む）は遊離形態であってもよいが、酸付加塩又は塩基付加塩として提供されてもよい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの鉱酸塩；又は、 p -トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、クェン酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリゥム塩、力リゥム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩；アンモニゥム塩；メチルアンモニゥム塩、トリェチルアンモニゥム塩などの有機アンモニゥム塩を挙げることができる。グリシンなどのアミノ酸と塩を形成する場合もあり、また、分子内で対イオンを形成することもある。

さらに、これらのオリゴぺプチド又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合がある。上記オリゴペプチドは複数の不斉炭素を有している。各不斉炭素の立体は特に限定されないが、アミノ酸残基は L -アミノ酸であることが望ましい。これらの不斉炭素に基づく光学活性体、ジァステレオ異性体などの立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。

本発明のオリゴぺプチドは、ぺプチド合成に通常用いられる固相法およぴ液相法などの化学的手法により合成することができる。ぺプチド合成におけるアミノ基等の保護基および縮合反応の縮合剤については種々の成書があり、それらを参照することができる。固相法では市販の各種べプチド合成装置を利用することができる。必要に応じて、官能基の保護及び脱保護を行うことにより効率的に合成を行うことができる。保護基の導入及ぴ脱離方法については、例えば、プロテクティブ ·グノレープス 'イン，オーガニック ·シンセシス（Protective Groups in Organic Synthesis) , グジーン (T. W. Greene) 著、ジョン ·フィジー ·アンド、 · サンズ ·インコーポレイテッド（John Wiley & Sons, Inc. ) (1981年）などを参照することができる。また、化学的修飾又は生物学的修飾などを含めて修飾オリゴぺプチドの製造方法は当業者に周知されており、いかなる方法を用いてもよレ、。また、通常の遺伝子発現操作等の生物学的手法に従って、上記オリゴペプチドをコードする DNA配列を含む組み換えベクターを製造した後、該ベクターにより形質転換された微生物（形質転換体）を調製し、該形質転換体を培養した培養物から所望のオリゴペプチドを分離.精製することができる。もっとも、上記オリゴぺプチドの製造方法はこれらの化学的方法及び生物学的方法に限定されることはない。また、化学的修飾又は生物学的修飾などを含めて修飾オリゴペプチドの製造方法は当業者に周知されており、いかなる方法を用いてもよい。

次に、本発明のオリゴぺプチドが環状オリゴぺプチドである場合の製造方法をより具体的に説明する。本発明の環状オリゴペプチドは、以下の（1) 〜（3) の手順に従つて合成することができる。

(1) 先ず、連結基 L (一 CO— (CH₂) _n— NH_) に相当する化合物である HOOC- (CH₂) _n-NH₂ (式中、 nは 5〜7の整数を示す）を化学合成する。

(2) 次に、 Cys— L— X 1— X 2— X 3— X4—X 5— X 6— X 7 (X 6が Cys の場合）で表されるオリゴぺプチドまたは Z— L— X 1-X2-X3-X4-X5 -X6-X7 (X 6が Lysの場合）を上記したような通常のぺプチド合成法により合成する。例えば、市販のペプチド自動合成機（例えば、 Applied Biosystem 社のペプチド自動合成機 430Aモデルなど）を使用して、プログラムに従って C 端より逐次 B O C法によりぺプチド鎖を延長して目的の保護べプチド樹脂の合成を行なうことができる。

(3) 最後に、 X6が Cysの場合は、 N末端の Cys残基と X 6で表される Cysとを共有結合により結合させる。この共有結合の形成は常法により行なうことができる。具体的には、遊離チオール基を有するオリゴペプチドを酢酸溶液中でのョゥ素酸化により環化反応を行なうことにより、上記共有結合を形成することができる。

また、 X 6が Lysの場合は、 N末端の Z残基と X 6で表される Lysとを共有結合により結合させる。この共有結合の形成は常法により行なうことができる。本発明のオリゴペプチドは、医薬の有効成分として有用である。本明細書における医薬という用語は、ヒトを含む哺乳類の病気の予防又は治療のほか、医薬部外品や化粧品として分類される場合がある毛成長促進剤などを含めて最も広義に用いる。

本発明の医薬の投与対象、薬効、並びに本発明の医薬による治療の対象疾患の具体例を以下に列挙する。

(1) 本発明のオリゴペプチドは、血管再生作用、再生促進作用、心臓血管再生作用、血管内皮細胞誘導作用などを示し、慢性閉塞性動脈硬化症、バージャ一病、重症狭心症、動脈硬化症などの治療及ぴ予防に有用である（Exp Cell Res 1996 Jan 10, 222(1) :189— 98)

(2) 本発明のオリゴペプチドは、膝臓上皮の形態形成に関与し、糖尿病などの治療おょぴ予防に有用である (J Cell Biol 2001, Mar 5 ;152 (5) :911— 22)。

(3) 本発明のオリゴペプチドは、肝臓の形成（再生）に関与し、肝代謝障害の治療おょぴ予防に有用である（Biochem Biophys Res Commun 1998 Sep 18; 250(2)： 486-90) o

(4) 本発明のオリゴペプチドは、骨や歯の形成に関与し、歯周病、骨折、骨腫瘍、骨欠損、骨粗しょう症の治療および予防に有用である（Arch Oral Biol 1995 Feb；40 (2)：161-4) ₀

(5) 本発明のオリゴペプチドは、肺分岐の形態形成や肺線維症に関与し、肺疾患の治療および予防に有用である（Biochem Biophys Res Commun 1997 May 19； 234(2)：522-5；及び Am J Respir Cell Mol Biol 2000 Aug ;23 (2) : 168- 74)。

(6) 本発明のオリゴペプチドは、腸ひだの形成に関与し、腸疾患の治療および予防に有用である (Am J Physiol 1998 Jul; 275(1 Ptl) :G114- 24)。

(7) 本発明のオリゴペプチドは、筋肉の構造の維持に関与し、例えば、筋ジストロフィー症の治療および予防に有用である（ Histochem J 1998 Dec ;30 (12) :903 - 8)。

(8) 本発明のオリゴペプチドは、胆嚢上皮の形成に関与し、胆嚢疾患の治療および予防に有用である (Cell Tissue Res 2000 May; 300 (2) :331-44) ( 9 ) 本発明のオリゴペプチドは、乳上皮の形態形成に関与し、乳疾患の治療おょぴ予防に有用である (J Cell Biol 2001 May 14; 153 (4) : 785-94)

これらの中でも最も好ましくは、毛成長促進剤として使用することができる。本明細書において用いられる「毛成長促進剤」という用語は、育毛促進、発毛促進、及び脱毛予防などを含めて最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。

また、本発明の環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩を毛成長促進剤として使用する場合、ミノキシジルと組み合わせて使用することもできる。

本発明の医薬としては、上記のオリゴペプチド又は生理学的に許容されるその塩から選ばれる 1又は 2種以上の物質をそのまま用いてもよいが、通常は、製剤学的に許容しうる 1又は 2種以上の製剤用添加物を用いて上記物質の 1又は 2種以上を有効成分として含む医薬組成物を製造して投与することが好ましい。上記のオリゴぺプチドの 1種又は 2種以上を有効成分として含む毛成長促進剤は、クリーム剤、噴霧剤、塗布用の溶液剤、又は貼付剤などとして外用剤として適用できるが、注射剤として患部に直接投与してもよく、毛成長促進剤としての使用目的に好適な形態の製剤として提供することが可能である。

例えば、シャンプーゃリンスに有効成分である上記のオリゴぺプチドを配合してもよく、上記のオリゴペプチドをリボソームなどに封入して製剤を調製してもよい。このような形態の組成物も本発明の医薬に包含される。皮膚のケラチン層を通して有効成分であるオリゴペプチドを効率的に経皮吸収させるために、適宜の界面活性剤や脂溶性物質などをクリーム剤などに配合することも好適である。哺乳動物への局所投与のためには、本発明の組成物は、ローション剤、タリーム剤、ゲル剤、スティック剤、スプレー剤、軟膏、ペースト剤などを含む（但し、これらに限定されない）多様な剤形として提供することができる。これらの剤形は、溶液、乳濁液、ゲル、固体及ぴリポソームなどを含む多様な調合形態を含む。溶液として調剤した本発明の組成物の局所投与に有用な組成としては、一般的には、薬学的に許容可能な水性又は有機溶媒が挙げられる。「薬学的に許容可能な有機溶媒」とは、本発明のオリゴペプチドを分散または溶解することができ、許容可能な安全性（例えば、刺激性及び感受性など）を有する溶媒のことを言う。好適な有機溶媒の具体例としては、プロピレンダリコール、ポリエチレンダリコール（2 0 0〜 6 0 0 )、ポリプロピレングリコーゾレ（4 2 5〜 2 0 2 5 )、グリセロール、 1 , 2， 4一ブタントリオール、ソルビトールエステル、 1， 2， 6 一へキサントリオ一ノレ、エタノーノレ、イソプロパノーノレ、ブタンジオール、及ぴそれらの混合物などが挙げられる。

局所用組成物をエアロゾルとして調剤し、スプレーオンとして皮膚に投与する場合、推進剤を溶液組成物に添加する。推進剤の具体例としてほ、塩素化、フッ素化または塩フッ素化した低分子量の炭化水素が挙げられるが、これに限定されるものではない。

局所用組成物は、緩和剤を含む溶液として調剤してもよい。緩和剤とは、乾燥の防止または緩和、並びに皮膚の保護のために使用される物質を言う。多様な好適な緩和剤が公知であり、本発明において使用することができる。

本発明のオリゴぺプチドを含む組成物から調剤することができる別の剤形としては、クリーム剤及びローション剤がある。

本発明のオリゴぺプチドを含む組成物から調剤することができる別の剤形としては、軟膏がある。軟膏は、動物又は植物の油あるいは半固体炭化水素（油性）の基剤を含むことができる。軟膏はまた、水を吸収して乳濁物を形成する吸収軟膏基剤を含むことができる。軟膏は水溶性でもよレ、。

別の剤形は、乳濁剤である。乳化剤は、非イオン性、ァユオン性又はカチオン性の何れでもよく、乳化剤の例としては、例えば、米国特許第 3， 755, 560号及び 4， 421, 769号に記載されている。

ローション剤及ぴクリーム剤は、乳濁剤及び溶液として調剤することができる。水中油型及び油中水型のローション剤及ぴクリーム剤等の局所調製物のための単一乳濁剤は周知である。水中油中水型などの多相乳濁組成物も公知であり、例えば、米国特許第 4， 254, 105号に記載されている。 3重乳濁剤も本発明の局所投与のためには有用であり、シリコン中水中油型の液体乳濁物などが挙げられ、例えば、米国特許第 4， 960, 764号に記載されている。

局所組成物に有用な他の乳濁剤は、マイクロエマルジヨン系である。例えば、約 9〜約 1 5 %のスクアレン、約 2 5〜約 4 0 %のシリコン油、約 8〜約 2 0 % の脂肪アルコール、約 1 5〜約 3 0 %のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸（商品名 T WE E N Sで市販）または他の非イオン性剤、及び約 7〜約 2 0 % の水を含む系が挙げられる。

本発明のオリゴぺプチドを含む組成物にはリボソーム製剤も有用である。リポソーム組成物は、本発明のオリゴペプチドを含む組成物を、ジパルミトイルホスファチジルコリン等のリン脂質、コレステロール及ぴ水と定法に従って混合することによって調製できる。リポソーム形成用の好適な組成物の表皮脂質をリン脂質の代わりに使用してもよい。リボソーム調製物を上記局所調剤の一つ（例えば、ゲル剤又は水中油型乳濁剤）に取り込んで、リポソ一ム製剤とすることができる。局所投与されるィポソームの他の組成及ぴ薬学的用途については、例えば、 Mezei (1985) Topics in Pharmaceutical Sciences, Bremer et a丄. eds.， Elsevier Science, New York, N. Y. , pp345- 358に記載されている。

上記の毛成長促進剤の投与量は使用目的、製剤形態、有効成分の種類などに応じて適宜選択可能であるが、例えば、本明細書の実施例に具体的に示した投与量を参考にして選択することが可能である。例えば、例えば、成人一日当たり有効成分の投与量としては、 l ju g Zk g Z日〜 l O m g Zk g 日、好ましくは 1

日〜 l m g / k g /日程度の範囲内である。

なお、本発明の実施に当っては、分子生物学（遺伝子組み換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、及び免疫学の慣用技術を使用することができ、これらは当業者の知識の範囲内である。このような技術は、例えば、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook et al.， 1989)； Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. , 1984)； Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed.， 1987)； Methods in Enzymology (Academic Press, Inc. )； Handbook of Experimental Immunology (D, M. Wei & C. C. Blackwell, eds. ) ; Gene Transfer Vectors for Mammalial Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds. , 1987) ; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. , eds. , 1987 and annual updates)； PCR： The Polymerase Chain Reaction (Mull is et al. , eds. , 1994)； Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al. , eds. , 1991 and annual updates)等に記載されている。実施例

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されることはなレ、。

実施例 1 ：修飾ォリゴぺプチドの作製

下記のァミノ酸配列で表されるオリゴぺプチドを Fmoc を用いた固相法により合成した。

Ser- Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala-Gln-Glu (配列番号 4 )

Ser- Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Glu-Gln-Glu (配列番号 5 )

Ser- Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Glu-Gln-Glu-Ala (配列番号 6 )

次に、合成したオリゴペプチドと以下の修飾試薬とを、同試薬の使用説明書に従って反応させた。オリゴペプチドと修飾試薬との比率は、モル比で正確に 1 ： 1で反応を行った。

EMC A (N— ε —マレイミドカプロン酸）：ピアス社製

KMUA (Ν— κ—マレイミドウンデカン酸）：ピアス社製

B M P A (Ν— —マレイミドプロピオン酸）：ピアス社製

フエ二ノレマレイミド：シグマ社製

合成したォリゴぺプチド、並びに修飾試薬との反応産物を、液体ク口マトダラフィーを用いて解析した結果を図 1から図 3に示す。液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。注入サンプル： 20 1

溶離条件 T F Α、ァセトニトリル 20→ 75 %

210 nmの吸収でぺプチドの溶出位置を見る。

図 1から 3では、オリゴぺプチドと修飾試薬（EMC A) とをモル比で正確に 1 ： 1の比率で反応させ、その前後の逆相液体クロマトグラムを示す。

図 1の左図は配列番号 1の合成オリゴぺプチドの結果を示し、図 1の右図は、そのシスティン残基を EMC Aで修飾したオリゴぺプチドの結果を示す。

図 2の左図は配列番号 2の合成オリゴぺプチドの結果を示し、図 2の右図は、そのシスティン残基を EMC Aで修飾したオリゴぺプチドの結果を示す。

図 3の左図は酉 S列番号 3の合成オリゴぺプチドの結果を示し、図 3の右図は、そのシスティン残基を EMC Aで修飾したオリゴぺプチドの結果を示す。実施例 2 ：新生毛包に特異的なモノクローナル抗体の作製

B 57BLマウスの成長期（48から 50日目）の皮膚から毛を切り取り、 8 M尿素、 2%SDS、 10 OmMの DTTを含む P B S中で 37。Cでー晚インキュペートし、タンパク質を抽出した。また、 B 57 B Lマウスのヒゲの毛包（毛球部に色素がついているもの；成長期）を実体顕微鏡で採取し、 PBS中にホモジナイズした。上記 2種類の試料（タンパク質量として 0. 5mg) を混合し、等量のコンプリートアジュパンドと混合してミセルを作製した。

上記で得たミセル（0. 2mg) をラット（Wister) の皮下（ 3箇所）に分けて投与して免疫した。初回免疫の 1力月後に上記と同様に追加免疫を行なった。さらに 2週間後に上記と同様に 2回目の追加免疫を行なった。 2回目の追加免疫の 3日後に、免疫ラットから脾臓を取り出し、メッシュ'にて血球成分を回収した。この血球成分の中には抗体産生細胞が含まれている。上記で回収した血球成分 (全量）とマウスミエローマ P3U1とをポリエチレングリコール 1500を用いて混合し、ダルベッコハム F12混合培地中に懸濁し、 96ゥエルプレートに各ゥエル 100 μ 1ずつ播いた。翌日、等量（Ι Ο Ο μ Ι) の HAT培地（シグマ社）を各ゥエルに添カ卩した。 2日後に各ゥエルから 150 μ 1ずつを吸引廃棄し、 150 1の新培地を各ゥエルに添加した。 96ゥエルプレートを 37°Cの CO ₂ィンキュベータ一内に静置した。

成長期の B 57 BLマウスのヒゲの毛包を 8M尿素中に超音波粉粋機を用いて溶解した。この溶液にニトロセルロースメンプレンを 5分間浸し、 PB Sで十分に洗浄したものを Biorad ドットブロッターに装着したものを用いて、上記の 9 6ゥエルプレートの各ゥエルから回収したハイブリドーマ上清を一次スクリー二ングした。先ず、上記で作製したニトロセルロースメンプレンを 5%スキムミルクを溶解したトリスバッファー（TB ST) でブロッキングした後、当該ニトロセルロースメンブレンを底とする各ゥエルにハイプリドーマ上清 100 μ 1を添加した。 1時間インキュベートした後、トリスバッファーで洗浄し、二次抗体であるホースラディッシュパーォキシダーゼ標識抗ラット I gG (1 μ g/m 1 T Β ST) を添加した。発色基質である EC L試薬（アマシャムフアルマシア社製）を添加して、発色の有無により成長期のヒゲの毛包と反応する抗体（全部で 50 種類）を選出した（一次スクリーニング)。

上記の一次スクリーニングで選出した抗体（50種類）について、成長期ヒゲ毛包の凍結切片（Ι Ο μπι) を用いて特異的に反応にするものを選出した（二次スクリーニング)。具体的には、スライドガラス上に成長期ヒゲ毛包の凍結切片を置き、一次スクリーニングで選出されたハイプリドーマ上清を添加し、二次抗体で発色させた。具体的には、クライオスダト（ブライト社）で作成した成長期ヒゲ毛包の凍結切片を一 20°Cメタノールで処理し、 TB STで 1時間ブロッキングを行つた後、ハイブリドーマ上清を 1時間反応させた。トリスバッファ一で洗浄後、 F I TC標識抗ラット I gG (TB STに 100 μ _g( m 1で溶解したもの）を反応させた。トリスバッファーで洗浄後、カバーガラスをかけて、蛍光顕微鏡にて観察を行った。

二次スクリーユングの結果、全部で 8種類の抗体を選出した。これらの抗体は表皮とは反応せず、毛包に特異的に反応するものであった。これら 8種類の抗体を限界希釈法でクローユングした。

これら 8種類の抗体について、成長期ヒゲ毛包又は休止期ヒゲ毛包をサンプルとしたウェスタンプロットで反応性を調べ、さらに毛包が形成されている 1 4日齢マウス胎児皮膚の切片試料を用いて反応性を調べた。その結果、成長期ヒゲ毛包及ぴ形成途中毛包（新生毛包）と特異的に反応し、休止期ヒゲ毛包とは反応しないモノクローナル抗体として mAb 2 7を取得した。モノクローナル抗体 m A b 2 7を産生するハイプリドーマは、受託番号 FERM P— 1 8 5 7 8として平成 1 3年 1 1月 2日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番地 1 中央第 6) に寄託されており、平成 1 4年 7月 2 2日付けで受託番号 FERM B P— 8 1 2 1として国際寄託に移管された。実施例 3 ：各種オリゴぺプチドの毛成長促進作用の評価

実施例 1で作成した各種のオリゴぺプチドを用いて毛成長促進作用を評価した。使用したオリゴぺプチドを以下に示す。

Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Asp (配列番号 7 )

上記式中、 Xaa は、 EMCA (N— ε —マレイミドカプロン酸）、 KMUA (Ν ― κ—マレイミドウンデカン酸）、 BMP A (Ν- β—マレイミドプロピオン酸）またはフエ-ルマレイミドに由来する修飾基が結合しているシスティン（Cys) 残基を示す。

Ser— lie— Glu— Gln_Ser— Xaa— Asp— Gin— Asp- Glu (配列番号 8 )

Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Ala-Gln-Glu (配列番号 9 )

Ser— lie— Glu_Gln_Ser— Xaa— Glu— Gin— Glu (配列番号 1 0)

(上記式中、 Xaa は、 EMCA (Ν— ε —マレイミドカプロン酸）に由来する修飾基が結合している Cysのアミノ酸残基を示す。）

1 2日目の I CRマウス胎児の上ァゴ皮膚組織を実体顕微鏡で採取し、左と右に分けて 5頭分を回収した。回収した 5頭分の皮膚を左（コントロール用）と右 (被験オリゴペプチド用）を別々に 5個ずつ一枚のヌクレポアメンブレン（孔径 8 μ πι、直径 1 3 mm) の上に載せ、実体顕微鏡で観察して外側が上になるようにした。 1 %B S Aを含むダルベッコ MEMZハム F 1 2培地 5 0 0 μ 1を 24 ゥェルディッシュの 2ゥエルに添加し、片方には被験オリゴぺプチド溶液（溶媒は P B S) を最終濃度 20 となるように添加し、他方には溶媒（P B S) を対照として同量入れた。被験オリゴペプチドとしては、上記（1) で作製した未修飾オリゴぺプチド及ぴ修飾オリゴぺプチドを使用した。

皮膚,袓織を載せたメンブレン 1枚ずつを上記のゥエル中の溶液に浮かべ、 3 7°C で 6日間培養した。メンブレンから 5個の組織片を SD Sサンプルバッファ（S D S 0. 0 2 g /m 1、グリセ口ール 0. 2 g /m 1、 H6. 8) 1 00 μ 1中に回収し、超音波粉砕器により溶解した。対照も同様に処理した。上記処理で得た溶液を S D S— P A G Ε (アクリルアミド 4〜 2 0 %) にて電気泳動後 (3 5mA, 1. 5時間）、 P VD F膜にトランスファーし、 5%スキムミルクを含むトリス緩衝液（TB S T) 中で 1時間インキュベートした。実施例 2で取得した mAb 2 7 (TB S T中 1 0 μ gZm 1 ) と 1時間反応後、 TB Sにて十分に洗浄し、ペルォキシダーゼ標識抗ラット I g G (アマシャム社）を TB S Tで 1 1 0 0 0に希釈したものを二次抗体として反応させ、十分に洗浄後、 E C L キット（アマシャム社）を用いて mAb 2 7の反応の強さを調べた。

得られた結果を図 4及び図 5に示す。図 4およぴ図 5における AHFは、モノクローナル抗体 _m A b 2 7が認識する抗原（具体的には、配列番号 1 1に示す 1 4 3 9アミノ酸残基からなるタンパク質）を示す。

図 4の結果から分かるように、左から 1番目、 2番目及び 3番目のレーンのバンドはそれぞれ左から 4番目及び 5番目のレーンのバンドよりも濃かった。これらの結果は、オリゴペプチド中のシスティン残基にカルボ二ル基を含有する修飾基（EMCA、 KMUA、または BMP A) が結合しているオリゴペプチドは強い発毛活性を有すること、特に、対応する未修飾のオリゴペプチドやカルボニル基を含有しない修飾基（フエエルマレイミド）が結合しているオリゴペプチドよりも強い発毛活性を有することを実証するものである。上記の中でも EMCAの活性が特に強かった。

また、図 5の結果は、

Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Asp-Gln-Asp-Glu (配列番号 8 )

Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Ala-Gln-Glu (配列番号 9 )

Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Glu-Gln-Glu (配列番号 10)

(上記式中、 Xaa は、 EMCA (N— ε—マレイミドカプロン酸）に由来する修飾基が結合している Cysのアミノ酸残基を示す。）

で表されるオリゴペプチドが強い発毛活性を有することを実証している。上記の中でも配列番号 8と 9で表されるオリゴペプチドが特に強い発毛活性を示した。実施例 4 ：環状オリゴぺプチドの作製

下記のアミノ酸配列で表される環状オリゴペプチドを化学合成した。また、化合物 1 1において一 CO (CH₂) ₅NH—を—CONH—に置換して化合物も合成した。

Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala-Gln-Glu (11 ) LcO(CH₂)₅NH-Cys— I

Ser-Ile- Glu- Gin- Ser - Cys-Ala-Gln-Glu (12) し CO(CH₂)7NH-Cys ~ I

Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala (】 ₃)

LcO(CH₂)₅NH-Cys ~ I

Ser- lie - Glu - Gin - Ser- Cys (14)

合成は以下の手順で行なった。

Applied Biosystem社のぺプチド自動合成機（43 OAモデノレ Foster city, CA、 USA) を使用し、プログラムに従って C端より逐次 BOC法によりぺプチド鎖を延長し、目的の保護ペプチド樹脂の合成を行なった。出発アミノ酸樹脂担体は、 B o c— A 1 a - P AM (0. 25mmo 1) を使用し、 Cy s (Me B z l )、 S e r (B z l)、 G l u (c Hx) など通常のアミノ酸誘導体を使用した。

樹脂上へのペプチドの構築が終了した後、保護ペプチド樹脂を乾燥した。得られた保護ぺプチドの脱保護基とぺプチドの樹脂担体からの切り離しは、無水フッ化水素処理によって行なった。チオール基遊離の粗ぺプチドは酢酸水溶液によつて抽出した後、凍結乾燥粉末として得た。続いて、チオール基遊離の粗ペプチドを酢酸溶液中でのヨウ素酸化により環化反応を行い、上記に示した環状オリゴぺプチドを合成した。得られた粗ペプチドを逆相高速クロマトグラフィー（島津製作所、分取装置モデル L C 8 A) によりァセトニトリル一 0. 1 %トリフルォ口酢酸水の系を用いて分取精製を行なって目的とする環状オリゴペプチドを得た。得られた精製物を、分析用 HPLC、質量分析ならびにアミノ酸分析により検定した。上記で合成した化合物の同定データを以下に示し、また H P LCの結果を図 6〜図 9に示す。化合物（1 1)

外観：白色凍結乾燥体

アミノ酸分析値：

加水分解条件： 6N HC 1、 1 1 0°C、 22時間

S e r (2) 1. 78、 G l u (4) 4. 00、 A l a (1) 0. 9 6 l i e (1) 0. 98、 NH₃ (2) 2. 05、 C y s (2) 1. 8 6

ε -A c p (1) 1. 05

純度（HP LC) : 9 8. 4%

E S I— MS ：分子量 1 20 7. 7 (理論値 1 208. 3) 化合物（1 2)

外観：白色凍結乾燥体

アミノ酸分析値：

加水分解条件： 6N HC 1、 1 1 0 °C、 22時間

S e r (2) 1. 80、 G l u (4) 4. 00、 A l a (1) 1. 00 l i e (1) 0. 9 9、 NH₃ (2) 2. 08、 C y s (2) 1. 9 1

8 -Ao a (1) N. D. (通常分析条件下、溶出されないため、定量できない) 純度（HPLC) ： 9 7. 8%

E S I—MS ：分子量 1 23 5. 8 (理論値 1 23 6. 4) 化合物（1 3) 外観：白色凍結乾燥体

アミノ酸分析値：

加水分解条件： 6 N HC 1、 1 10°C、 22時間

S e r (2) 1. 79、 G l u (2) 2. 01、 Al a

l i e (1) 0. 97、 NH₃ (1) 1. 20、 C y s

ε -A c p (1) 1. 01

純度（HPLC) : 99. 0%

E S I— MS ：分子量 950. 5 (理論値 951· 1) 化合物（14)

外観：白色凍結乾燥体

アミノ酸分析値：

加水分解条件： 6 N HC I、 1 10°C、 22時間

S e r (2) 1. 79、 G l u (2) 2. 00、 l i e

NH₃ (1) 1. 18、 C y s (2) 1. 92、 ε— A

純度（HPLC) ： 97. 9%

ES I—MS ：分子量 879. 6 (理論値 880. 0) 実施例 5 ：各種オリゴぺプチドの毛成長促進作用の評価

実施例 4で合成した環状ォリゴぺプチドを 30 %ァセトニトリル、 0. 1 %トリフルォロ酢酸で処理し、乾燥した。この環状オリゴぺプチドを 0. 00002 重量％となるようにリン酸緩衝生理食塩水（PB S) に溶解し、この溶液に等容量の 100 %ェタノールを加えて 0. 00001重量⁰ /₀の 50 %エタノール · P B S溶液を調製した。コントロール溶液としては、 PBSを用いた。

C 3H C 57BL/6マウスは生後 45日から 95日前後まで約 50日間休止期が続くことが知られている。また、休止期ではピンク、成長期ではグレー又はクロと皮膚の色が変化するため、毛周期の判定が容易である。このマウスを使 ― 用し、本発明の環状オリゴペプチドの投与により、成長期への移行が促進されるか否か評価した。 C57BL/6マウスの 7週齢（48〜50日齢、雌）を購入し、背中（約 3 X 2. 5 cm²) を動物用電気バリカンで傷が付かないように注意深く刈毛し、皮膚の色から毛周期が休止期であることを確認した。上記で調製した環状オリゴペプチド溶液（0. 00001重量⁰ /₀) を 0. 2mlずつ毎日 1 回、週 5日間、実験開始後 38日まで各群 10匹ずつ塗布を行った。塗布は針の付いていない注射器を用いて行った。

評価は週 2回マウスを観察し、毛を刈った面積に対する再生した面積の割合に応じてスコアを 6段階に設定し、複数人（2人）が肉眼判定することにより行つた。また、写真撮影も行った。発毛スコアは以下の要領で計算した。毛を刈った部分のうち、皮膚の色がグレー又はクロになった部分の割合により下記のようにスコアを付けた。 0〜20% : 1、 20〜40% : 2、 40〜 60% : 3、 60 〜80% : 4、 80〜100%： 5。各群における上記スコアの合計を発毛スコァとした。判定者 1人あたり発毛スコアの各群の最大値は 50であり、判定者を 2人としたので発毛スコアの最大値は 100である。

環状オリゴぺプチドを塗布した群では、コントロール群に比べて毛の再生が促進されていた。結果を図 10及び図 11に示す。これらの結果から、本発明の環状オリゴぺプチドは毛成長促進作用を有することが実証された。実施例 6 ：本発明の環状オリゴぺプチドとミノキシジルとの併用

製剤 1 ：実施例 4で製造した式（13) の環状オリゴペプチド（0. 0000 1 %) とミノキシジル（ 1 %) との混合液

製剤 2 ：ミノキシジル（1%) 液（市販品であるリアップ（大正製薬株式会社) をそのまま使用）

製剤 1と製剤 2をそれぞれ実施例 5と同様にして、毛包が休止期にある C 57 BLZ6マウスの背中に投与して毛包の成長期への移行が促進されるかどうかを評価した。結果を図 12に示す。ミノキシジルのみを投与した場合と比較して、本発明の環状ぺプチドとミノキシジルとを併用して投与した場合には、毛包の成長期への移行が飛躍的に促進された。両者の間で、ウィルコキソンの検定で棄却率 5 %未満の p値で有意差があつた。実施例 7 ：細胞障害性の評価

実施例 4で製造した式（1 3 ) の環状オリゴペプチドの 0 . 1重量％液、 0 . 0 1重量％液、 0 . 0 0 1重量％液、 0 . 0 0 0 1重量％液、 0 . 0 0 0 0 1重量％液、及ぴ 0 . 0 0 0 0 0 1重量％液のそれぞれについて細胞障害性試験を行つた。被験細胞としては皮膚由来細胞 H S C— 5 (財団法人ヒューマンサイェンス振興財団の下部組織であるヒユーマンサイエンス研究資源バンク

(http： //www. jhsf. or. jp/index一 b. html) から入手）を 2 4穴培養プレートに 1 0 0， 0 0 0細胞ゥエルで播種した。培地としては、 1 0 % F C Sを含む I S C O V変法 DMEM培地を使用し、培養は 2日間行った。培養終了後、生細胞の割合をカウントした。その結果、何れの場合も細胞は生存しており、細胞障害性は認められなかった。産業上の利用可能性

本発明のオリゴペプチドは毛成長促進作用を有しており、毛成長促進剤などの医薬の有効成分として有用である。本発明では、修飾基を特定のものとすることにより、国際公開 W001/094382号に記載のぺプチドょりも毛成長促進作用が向上している。さらに、 X 7及び X 9を Asp以外の別のアミノ酸に置換することで収率を向上させることができる。また、本発明の環状オリゴペプチドは、分子内に環構造を有し、有機溶媒に露出しても安定であるため、逆相クロマトグラフィーなどの厳しい条件下でも安定であり、特に精製効率が高いという利点を有している。

Claims

請求め範囲

1. 下記の式（I) から（IV) の何れかのアミノ酸配列を含む 5から 100 アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって、毛成長促進作用を有するオリゴぺプチドまたはその修飾オリゴぺプチド。

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (I)

X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7 (II)

X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7 (III)

X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7 (IV)

(式中、 X Iは、 Ser、 Ala, Tyr_s Thr、 Pro, Phe、 Val、 Gly、 Leu、 lie または Metのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X2は、 Ile、 Gly、 Asn、 Thr、 Val、 Ser、 Phe、 Leu、 Ala、 Pro, Cysまたは Met のアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X3は、 Glu、 Lys、 Gln、 Arg、 Ala、 Val、 Trp、 Cysまたは Aspのアミノ酸残基を示し、

X4は、 Gln、 Pro、 Glu、 Thr、 Arg、 Ser、 His、 Cysまたは Lysのアミノ酸残基を示し、

X 5は、 Ser、 Trp、 Phe、 Thr、 Cys、 Tyr、 Pro、 Ala, Gly、 Val、 Leu, lie または Metのアミノ酸残基を示し、

X6は、カルボ二ル基を含有する修飾基が結合している Cys のアミノ酸残基、または力ルポ二ル基を含有する修飾基が結合している Lysのアミノ酸残基を示し、そして

X7は、 Asp_s Glu、 His、 Sei\ Ala, Gly、 Asn、 Tyr、 Argまたは Leuのァミノ酸残基を示すか、あるいは欠失している。）

2. X 1が Serアミノ酸残基を示し、 X 2が lieのアミノ酸残基を示し、 X 3が Gluのアミノ酸残基を示し、 X 4が Ginのアミノ酸残基を示し、 X 5が Ser のアミノ酸残基を示し、 X 6がカルボ二ル基を含有する修飾基が結合している Cysのアミノ酸残基を示し、そして X 7が Gluまたは Alaのアミノ酸残基を示す、請求項 1に記載のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチド。

3. 式（I) から（IV) の何れかのアミノ酸配列から成る 5から 7アミノ酸残基から成るオリゴペプチドである、請求項 1又は 2に記載のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴぺプチド。

4. 下記の式（XI) から（XIV) の何れかのアミノ酸配列を含む 6から 10 0アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって、毛成長促進作用を有するオリゴぺプチドまたはその修飾オリゴぺプチド。

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (XI)

X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7-X8-X9 (XII)

X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7-X8-X9 (XIII)

X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7-X8-X9 (XIV)

X3は、 Glu、 Lys、 Gin, Arg、 Ala、 Val、 Trp、 Cysまたは Aspのアミノ酸残基を示し、

X 5は、 Ser、 Trp、 Phe、 Thr、 Cys, Tyr、 Pro, Ala, Gly、 Val、 Leu、 lie または Metのアミノ酸残基を示し、

X6は、カルボ二ル基を含有する修飾基が結合している Cys のアミノ酸残基、またはカルボ二ル基を含有する修飾基が結合している Lysのアミノ酸残基を示し、

X7は、 Asp、 Glu、 His、 Ser、 Ala、 Gly、 Asn、 Tyr、 Argまたは Leuのァミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X8は、 Ginのアミノ酸残基を示し、そして X 9は、 Asp、 Glu、 His, Ser、 Ala、 Gly、 Asn、 Tyr、 Argまたは Leuのァミノ酸残基を示す。）

5 . X 7及ぴ X 9の少なくとも片方が Aspのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である、請求項 4に記載のオリゴぺプチドまたはその修飾オリゴぺプチド。

6 . X Iが Serアミノ酸残基を示し、 X 2が lieのアミノ酸残基を示し、 X 3が Gluのアミノ酸残基を示し、 X 4が Ginのアミノ酸残基を示し、 X 5が Ser のァミノ酸残基を示し、 X 6がカルボ二ル基を含有する修飾基が結合している Cysのアミノ酸残基を示し、 X 7が Gluまたは Alaのアミノ酸残基を示し、 X 8 が Ginのアミノ酸残基を示し、そして X 9が Gluのアミノ酸残基を示す、請求項 4又は 5に記載のォリゴぺプチドまたはその修飾ォリゴぺプチド。

7 . 式（XI) から（XIV) の何れかのアミノ酸配列から成る 7から 9ァミノ酸残基から成るオリゴぺプチドである、請求項 4から 6の何れかに記載のオリゴぺプチドまたはその修飾オリゴぺプチド。

8 . X 6が、末端にカルボキシル基を有する修飾基が結合している Cysのァミノ酸残基、または末端にカルボキシル基を有する修飾基が結合している Lysのアミノ酸残基を示す、請求項 1から 7の何れかに記,載のオリゴペプチドまたはその修飾ォリゴぺプチド。

9 . 修飾基内においてカルボニル基が炭素数 2から 1 0の炭化水素鎖に結合している、請求項 1から 8の何れかに記載のオリゴぺプチドまたはその修飾オリゴぺプチド。

1 0 . 修飾基内においてカルボニル基が炭素数 3から 7の炭化水素鎖に結合している、請求項 1から 9の何れかに記載のオリゴぺプチドまたはその修飾オリゴぺプチド。.

1 1 . 修飾基が、 N— —マレイミドプロピオン酸に由来する修飾基、 Ν— ε—マレイミドカプロン酸に由来する修飾基、または Ν— _κ—マレイミドウンデカン酸に由来する修飾基である、請求項 1から 1 0の何れかに記載のオリゴぺプチドまたはその修飾オリゴぺプチド。

1 2 . 以下の何れかのオリゴぺプチドまたはその修飾オリゴぺプチド。

Ser— He— Glu— Gin— Ser— Xaa— Ala— Gin— Glu

Ser一 lie一 Glu_Gln— Ser一 Xaa一 Glu一 Gin— Glu

Ser— lie— Glu— Gin— Ser— Xaa— Glu— Gin— Glu - Ala

(式中、 Xaa は、 N— ε一マレイミドカプロン酸に由来する修飾基が結合している Cysのァミノ酸残基を示す。）

1 3 . 請求項 1カゝら 1 2の何れかに記載のオリゴぺプチドまたはその修飾ォリゴぺプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む医薬。

1 4 . 請求項 1カゝら 1 2の何れかに記載のオリゴぺプチドまたはその修飾ォリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む毛成長促進剤。

1 5 . 下記の式（1 ) のアミノ酸配列から成り、毛成長促進作用を有する環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチド。

X1一 X2— X3— X4— X5— X6— X7—丫 (1 ) I ~ L一 Cys '

(式中、 X Iは、 Ser、 Ala、 Tyr、 Thr、 Pro, Phe、 Val、 Gly、 Leu、 He または Metのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X 3は、 Glu、 Lys、 Gln、 Arg、 Ala, Val_N Trp、または Aspのアミノ酸残基を示し、

X 4は、 Gln、 Pro、 Glu、 Thr、 Arg、 Ser、 His、または Lys のアミノ酸残基を示し、

X 5は、 Ser、 Trp、 Phe、 Thr、 Tyr、 Pro, Ala、 Gly、 Val、 Leu、 lieまたは Met のアミノ酸残基を示し、 X 6は、 Cysのアミノ酸残基を示し、

X 7は、 Aspヽ. Glu、 His、 Ser、 Ala、 Gly、 Asn、 Tyr、 Argまたは Leuのァミノ酸残基を示すか、あるいは欠失し、

Yは、欠失している力、 1〜9 0個のアミノ酸配列を示し、

Lは連結基を示す。;）

1 6 . X 1が Serアミノ酸残基を示し、 X 2が lieのアミノ酸残基を示し、 X 3が Gluのァミノ酸残基を示し、 X 4が Ginのァミノ酸残基を示し、 X 5が Ser のアミノ酸残基を示し、 X 6が Cysのアミノ酸残基を示し、そして X 7が Gluまたは Alaのァミノ酸残基を示す、請求項 1 5に記載の環状ォリゴぺプチド又はその修飾ォリゴぺプチド。

1 7 . Yが欠失している、請求項 1 5又は 1 6に記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴぺプチド。

1 8 . Yが、 1〜1 2個のアミノ酸配列を示す、請求項 1 5又は 1 6に記載の環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチド。

1 9 . 下記の式（2 ) 力ら成るアミノ酸配列を有し、毛成長促進作用を有する環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチド。

X1— X2—X3— X4— X5— X6— X7— X8— X9 (2)

(式中、 X 1は、 Ser、 Ala、 Tyr、 Thr、 Pro, Phe、 Val、 Gly、 Leu、 lie または Metのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X 3は、 Glu、 Lys、 Gln、 Arg、 Ala、 Val、 Trp、または Asp のアミノ酸残基を示し、

X 4は、 Gln、 Pro、 Glu、 Thr、 Arg、 Ser、 His, または Lys のアミノ酸残基を示し、 X 5は、 Ser、 Trp、 Phe、 Thr、 Tyr、 Pro、 Ala、 Gly、 Val、 Leu、 lieまたは Met のアミノ酸残基を示し、

X 6は、 Cysのァミノ酸残基を示し、

X 7は、 Asp, Glu、 His、 Ser、 Ala, Gly、 Asn、 Tyr、 Argまたは Leuのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失し、

X 8は、 Ginのアミノ酸残基を示し、そして

X 9は、 Asp、 Glu、 His、 Ser、 Ala、 Gly、 Asn、 Tyr, Argまたは Leuのァミノ酸残基を示し、

Lは連結基を示す。）

2 0 . X 7及び X 9の少なくとも片方が Aspのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である、請求項 1 9に記載の環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチド、。

2 1 . X 1が Serアミノ酸残基を示し、 X 2が lieのアミノ酸残基を示し、 X 3が Gluのァミノ酸残基を示し、 X 4が Ginのァミノ酸残基を示し、 X 5が Ser のァミノ酸残基を示し、 X 6が Cysのァミノ酸残基を示し、 X 7が Gluまたは Ala のアミノ酸残基を示し、 X 8が Ginのアミノ酸残基を示し、そして X 9が Gluのァミノ酸残基を示す、請求項 1 9又は 2 0に記載の環状ォリゴぺプチド又はその修飾ォリゴぺプチド。

2 2 . 下記の式（3 ) のアミノ酸配列から成り、毛成長促進作用を有する環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチド。

X1 -X2 -X3 -X4-X5 -X6 -X7 -Y (3)

(式中、 X 1は、 Ser、 Ala, Tyr、 Thr、 Pro、 Phe、 Val、 Gly、 Leu、 lie または Metのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、

X 2は、 Ile、 Gly、 Asn、 Thr、 Val、 Ser、 Phe、 Leu、 Ala、 Pro、または Metのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、 X 3は、 Glu、 Gln、 Arg、 Ala、 Val、 Trp、または Aspのアミノ酸残基を示し、 X 4は、 Gln、 Pro, Glu、 Thr、 Arg、 Ser、または Hisのアミノ酸残基を示し、

X 5は、 Ser、 Trp、 Phe、 Thr、 Tyr、 Pro, Ala、 Gly、 Val、 Leu、 lieまたは Met のアミノ酸残基を示し、

X 6は、' Lysのァミノ酸残基を示し、

Yは、欠失しているか、 1〜9 0個のアミノ酸配列を示し、

Lは連結基を示し、 -

Zは、 Lysと反応して結合できる基を示す。）

2 3 . X 1が Serアミノ酸残基を示し、 X 2が lieのアミノ酸残基を示し、 X 3が Gluのァミノ酸残基を示し、 X 4が Ginのァミノ酸残基を示し、 X 5が Ser のアミノ酸残基を示し、 X 6が Cysのアミノ酸残基を示し、そして X 7が Gluまたは Alaのァミノ酸残基を示す、請求項 2 2に記載の環状ォリゴぺプチド又はその修飾ォリゴぺプチド。

2 4 . Yが欠失している、請求項 2 2又は 2 3に記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴぺプチド。

2 5 . Yが、 1〜1 2個のアミノ酸配列を示す、請求項 2 2又は 2 3に記載の環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチド。

2 6 . 下記の式（4 ) から成るアミノ酸配列を有し、毛成長促進作用を有する環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチド。

X1— X2— X3— X4— X5— X6— X7— X8— X9 (4) I _ し一 Z 1

X 3は、 Glu、 Gln、 Arg、 Ala, Val、 Trp、または Aspのアミノ酸残基を示し、 X 4は、 Gln、 Pro、 Glu、 Thr、 Arg、 Ser、または Hisのアミノ酸残基を示し、

X 5は、 Ser、 Trp、 Phe、 Thr、 Tyr、 Pro, Ala, Gly、 Val、 Leu、 lieまたは Met のアミノ酸残基を示し、

X 6は、 Lysのアミノ酸残基を示し、

X 8は、 Ginのアミノ酸残基を示し、そして

X 9は、 Asp、 Glu、 His、 Ser、 Ala, Gly、 Asn、 Tyr、 Argまたは Leuのァミノ酸残基を示し、

Lは連結基を示し、

Zは、 Lysと反応して結合できる基を示す。）

2 7 . X 7及ぴ X 9の少なくとも片方が Aspのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である、請求項 2 6に記載の環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチド、。

2 8 . X 1が Serァミノ酸残基を示し、 X 2が lieのァミノ酸残基を示し、 X 3が Gluのァミノ酸残基を示し、 X 4が Ginのァミノ酸残基を示し、 X 5が Ser のァミノ酸残基を示し、 X 6が Cysのァミノ酸残基を示し、 X 7が Gluまたは Ala のアミノ酸残基を示し、 X 8が Ginのアミノ酸残基を示し、そして X 9が Gluのァミノ酸残基を示す、請求項 2 6又は 2 7に記載の環状ォリゴぺプチド又はその修飾オリゴペプチド。

2 9 . 連結基 Lの炭素数が 6から 8である、請求項 1 5から 2 8の何れかに記載の環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチド。

3 0 . 連結基 L内においてカルボニル基が炭素数 5から 7の炭化水素鎖に結合している、請求項 1 5から 2 9の何れかに記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。

31. 連結基が、 _CO_ (CH₂) _n-NH- (式中、 nは 5〜7の整数を示す）である、請求項 15から 30の何れかに記載の環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチド。

32. 連結基 L中の一COが X 1と結合し、連結基 L中の NH—が、 X6に結合している Cys残基又は Zで表される基と結合している、請求項 31に記載の環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチド。

33. 以下の何れかの環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチド。

Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala-Gln-Glu (11 ) LcO(CH₂)₅NH-Cys ~ I

Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala-Gln-Glu (12) L〇0(CH2)7NH - Cys ~ I

Ser - lie - Glu - Gin - Ser- Cys - Ala (i 3)

Ser - lie - Glu - Gin - Ser-Cys (14)

34. 請求項 15カゝら 33の何れかに記載の環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む医薬。.

35. 請求項 15から 33の何れかに記載の環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴぺプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む毛成長促進剤。

36. 請求項 15カゝら 33の何れかに記載の環状オリゴぺプチド又はその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩、並びにミノキシジルを有効成分として含む毛成長促進剤。