WO2005033706A1 - Method for the detection and analysis of protein-protein interactions - Google Patents

Method for the detection and analysis of protein-protein interactions Download PDF

Info

Publication number
WO2005033706A1
WO2005033706A1 PCT/EP2004/010391 EP2004010391W WO2005033706A1 WO 2005033706 A1 WO2005033706 A1 WO 2005033706A1 EP 2004010391 W EP2004010391 W EP 2004010391W WO 2005033706 A1 WO2005033706 A1 WO 2005033706A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
protease
interaction
released
expression
Prior art date
Application number
PCT/EP2004/010391
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Sylvia Grünewald
Original Assignee
Axaron Bioscience Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Axaron Bioscience Ag filed Critical Axaron Bioscience Ag
Publication of WO2005033706A1 publication Critical patent/WO2005033706A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding

Abstract

The invention relates to a method for the detection and quantitative and/or qualitative analysis of protein-protein interactions, characterised in that the proteolytic release of at least one protein is achieved by: a) the expression of a first fusion protein, comprising a first interaction partner and a protease fragment; and b) the expression of a second fusion protein, comprising a second interaction partner and a second protease fragment; c) the transcomplementation of a functional protease by the interaction of the first and second interaction partners, and d) the expression of a third fusion protein, comprising a protein to be released and a domain, which causes the fusion protein to be anchored outside the cell nucleus; and e) the proteolytic splitting of the protein to be released by the complemented protease, whereby optionally at least one of the first two fusion proteins comprises an additional domain, which causes the fusion protein to be anchored outside the cell nucleus.

Description

Verfahren zur Detektion und Analyse von Protein-Protein-Interaktionen Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions
Nahezu alle biologischen Prozesse in lebenden Organismen werden durch die Funktion von spezifisch interagierenden Proteinen gesteuert, von der Liganden-vermittelten Assoziation von Multi-Protein-Komplexen an der Zelloberfläche über intrazelluläre Signaltransduktionskaskaden hin zu Transkriptionskomplexen an den Promotoren spezifischer Gene. Die gezielte Analyse von Protein-Interaktionen ermöglicht die Isolierung und Zuordnung unbekannter Proteine zu Funktionsgruppen und die Aufklärung des molekularen Wirkmechanismus bekannter Proteine. Die zelluläre Signaltransduktion, welche die Übertragung von extrazellulären Signalen in spezifische intrazelluläre Veränderungen beinhaltet, ist der Schlüsselmechanismus zur Steuerung einer Zelle während der Entwicklung und bei der Reaktion auf Umweltveränderungen. Die Übertragung dieser Signale wird durch streng regulierte Kaskaden von spezifisch interagierenden Proteinen gesteuert. Darüberhinaus werden nahezu alle wichtigen zellulären Funktionen, die meist an die Signaltransduktion gekoppelt sind, durch kontrollierte Protein-Interaktionen ausgeführt (Pawson and Scott 1997). Diese umfassen u.a. die Steuerung des Zeil-Zyklus, Proteinsynthese und -abbau, Verhinderung bzw. Einleitung von Apoptose, Transportvorgänge, Reizerkennung und Weiterleitung, Gen-Expression, mRNA-Prozessierung, DNA- Synthese und -Reparatur sowie den gesamten Energiemetabolismus. All diese Prozesse sind sehr dynamisch, d.h. sie unterliegen Veränderungen, die eingebettet sind in den Gesamtzustand der Zelle. Auf Proteinebene wird dies wiedergespiegelt durch die regulierte Veränderung der Zusammensetzung der furiktionsausführenden Komplexe (Ashman, Moran et al. 2001).Almost all biological processes in living organisms are controlled by the function of specifically interacting proteins, from the ligand-mediated association of multi-protein complexes on the cell surface via intracellular signal transduction cascades to transcription complexes on the promoters of specific genes. The targeted analysis of protein interactions enables the isolation and assignment of unknown proteins to functional groups and the elucidation of the molecular mechanism of action of known proteins. Cellular signal transduction, which involves translating extracellular signals into specific intracellular changes, is the key mechanism for controlling a cell during development and in response to environmental changes. The transmission of these signals is controlled by strictly regulated cascades of specifically interacting proteins. In addition, almost all important cellular functions, which are mostly linked to signal transduction, are carried out by controlled protein interactions (Pawson and Scott 1997). These include the control of the Zeil cycle, protein synthesis and degradation, prevention or initiation of apoptosis, transport processes, stimulus detection and transmission, gene expression, mRNA processing, DNA synthesis and repair as well as the entire energy metabolism. All of these processes are very dynamic, i.e. they are subject to changes that are embedded in the overall condition of the cell. At the protein level, this is reflected by the regulated change in the composition of the furcation-carrying complexes (Ashman, Moran et al. 2001).
Bei vielen pathologischen Zuständen, z.B. bei neurologischen Erkrankungen wie der Alzheimerschen Krankheit, spielen Protein-Interaktionen eine wichtige Rolle. Eine Vielzahl pathologischer Abläufe in Zellen wird durch eine Störung in der Kontrolle der Signaltransduktion verursacht und kann zu Stoffwechselerkrankungen, Kanzerogenese, immunologischen Erkrankungen oder zu neurologischen Defiziten führen. Solche pathologischen Abläufe können insbesondere durch spezifische Mutationen in den Genen kodierend für Proteine mit wichtiger Funktion in der neuronalen Signaltransduktion verursacht werden. So verändern beispielsweise bestimmte Mutationen in den Genen der NMDA-Rezeptor-Untereinheiten die Zusammensetzung und die Signaleigenschaften des NMDA-Rezeptor-Proteinkomplexes (Migaud, Charlesworth et al. 1998). Protein- Interaktionen stellen daher attraktive Angriffspunkte für neue Diagnostika oder Therapeutika dar. Folglich besteht ständiger Bedarf an neuen und verbesserten Methoden zur Detektion und Charakterisierung von Protein-Interaktionen sowie zur Identifizierung von Substanzen, die Protein-Interaktionen entweder hemmen oder induzieren können und sich zum Einsatz in Diagnostik und Therapie eignen. Trotz der Bedeutung von Protein-Interaktionen für das Verständnis des Zusammenspiels und der Komplexbildung von Proteinen in biologischen Prozessen sowie ihrer Rolle als Angriffspunkt für therapeutische Intervention sind nur wenige geeignete Methoden zur Analyse von Protein-Interaktionen und der Suche nach Substanzen, die Protein-Interaktionen beeinflussen, in vivo verfügbar.Protein interactions play an important role in many pathological conditions, for example in neurological diseases such as Alzheimer's disease. A large number of pathological processes in cells are caused by a disturbance in the control of signal transduction and can lead to metabolic diseases, carcinogenesis, immunological diseases or neurological deficits. Such pathological processes can be caused in particular by specific mutations in the genes coding for proteins with an important function in neuronal signal transduction. For example, certain mutations in the genes of the NMDA receptor subunits change the composition and signal properties of the NMDA receptor-protein complex (Migaud, Charlesworth et al. 1998). Protein interactions are therefore attractive targets for new diagnostics or therapeutics Consequently, there is a constant need for new and improved methods for the detection and characterization of protein interactions and for the identification of substances which can either inhibit or induce protein interactions and are suitable for use in diagnostics and therapy. Despite the importance of protein interactions for understanding the interplay and complex formation of proteins in biological processes and their role as a target for therapeutic intervention, there are only a few suitable methods for analyzing protein interactions and searching for substances that influence protein interactions , available in vivo.
Im Bereich Proteomics ist die massenspektrometrische Analyse von gereinigten Proteinkomplexen die gängige Methode zur Identifizierung und Analyse von Protein- Interaktionen (Ashman, Moran et al. 2001). So konnte z.B. mit Hilfe einer Tandem-Affinitäts- Aufreinigung (TAP) (Rigaut, Shevchenko et al. 1999), denaturierender eindimensionaler Gelelektrophorese und tryptischem Verdau von Einzelbanden in Kombination mit massenspektrometrischer Analyse eine Vielzahl von Proteinkomplexen aus Hefe isoliert und deren Komponenten bestimmt werden (Gavin, Bosche et al. 2002). Unter Verwendung eines optimierten hnmunpräzipitationsprotokolls, Massenspektrometrie und der "Western Blot"- Technik konnte eine Vielzahl der Komponenten des neuronalen NMDA Rezeptor Signalverarbeitungs-Komplexes charakterisiert werden (Husi, Ward et al. 2000). Allerdings weisen diese biochemisch-biophysikalischen Verfahren einige experimentelle und prinzipielle Nachteile auf. So ist für alle biochemischen Verfahren der experimentelle Aufwand und die Menge an benötigtem biologischen Ausgangsmaterial sehr hoch. Zudem ist es für bereits optimierte Aufreinigungsverfahren (z.b. die TAP -Methode) notwendig, die entsprechenden Fusionsproteine transgen in den Organismen der Wahl stabil zu exprimieren. Bei der Analyse komplexer Gewebe können schwach exprimierte oder zelltyp-spezifisch exprimierte Proteine leicht unter die Detektionsgrenze fallen. Ein grundsätzlicher Nachteil aller biochemischer Methoden ergibt sich aus der Notwendigkeit des Zellaufschlusses bzw. der Solubilisierung großer Membrankomplexe. Schwache oder transiente Interaktionen können im Zuge der meist mehrere Schritte umfassenden biochemischen Aufarbeitung leicht verloren gehen (Ashman, Moran et al. 2001). Diese auf Co-Reinigung und Co-Präzipitation beruhenden Methoden sind nicht Hochdurchsatz-fähig und zum Screening nach Substanzen, die Protein-Interaktionen beeinflussen, nicht geeignet.In the field of proteomics, mass spectrometric analysis of purified protein complexes is the common method for identifying and analyzing protein interactions (Ashman, Moran et al. 2001). For example, Using a tandem affinity purification (TAP) (Rigaut, Shevchenko et al. 1999), denaturing one-dimensional gel electrophoresis and tryptic digestion of single bands in combination with mass spectrometric analysis, a large number of protein complexes are isolated from yeast and their components are determined (Gavin, Bosche et al. 2002). Using an optimized immunoprecipitation protocol, mass spectrometry and the "Western blot" technique, a large number of the components of the neuronal NMDA receptor signal processing complex could be characterized (Husi, Ward et al. 2000). However, these biochemical-biophysical processes have some experimental and fundamental disadvantages. For all biochemical processes, the experimental effort and the amount of biological starting material required is very high. In addition, for already optimized purification processes (e.g. the TAP method), it is necessary to stably express the corresponding fusion proteins transgenically in the organisms of choice. When analyzing complex tissues, weakly expressed or cell type-specific expressed proteins can easily fall below the detection limit. A fundamental disadvantage of all biochemical methods arises from the necessity of cell disruption or the solubilization of large membrane complexes. Weak or transient interactions can easily be lost in the course of the biochemical workup, which usually comprises several steps (Ashman, Moran et al. 2001). These methods, based on co-purification and co-precipitation, are not capable of high throughput and are not suitable for screening for substances that influence protein interactions.
Mikroarrays sind ein weiteres Werkzeug zur systematischen Analyse von Protein-Protein- Interaktionen, Protein-Peptid-Interaktionen oder der Interaktionen von Proteinen mit niedermolekularen Substanzen. Bei dieser Methode werden in vitro translatierte oder rekombinant produzierte Proteine bzw. Peptide, Antikörper, spezifische Liganden oder niedermolekulare Substanzen in Analogie zu DNA-Mikroarrays auf ein Trägermaterial aufgebracht. Komplexe Proteinmischungen oder Substanzbibliotheken können somit simultan u.a. nach spezifischen Interaktionen durchmustert werden (Ashman, Moran et al. 2001)(Xu, Piston et al. 1999). Die vollständig in vitro durchgeführten Analysen mit Protein- oder Substanzarrays haben jedoch ebenfalls große Nachteile. So werden Proteine bei dieser Methode unter vollkommen artifiziellen Bedingungen hergestellt oder analysiert. Weiterhin werden die Anwendungsmöglichkeiten dieser Array-basierten in vitro Analysemethoden zur Detektion und zur Analyse- von Protein-Interaktionen durch das Auftreten von hohen unspezifischen Hintergrundsignalen, durch die begrenzte ' Sensitivität und durch Schwierigkeiten bei der Detektion von Proteinen mit bestimmten physiko-chemischen Eigenschaften stark eingeschränkt (Ashman, Moran et al. 2001).Microarrays are another tool for the systematic analysis of protein-protein interactions, protein-peptide interactions or the interactions of proteins with low-molecular substances. With this method, in vitro translated or recombinantly produced proteins or peptides, antibodies, specific ligands or low-molecular substances are applied to a carrier material in analogy to DNA microarrays. Complex protein mixtures or substance libraries can thus be run simultaneously inter alia, to be screened for specific interactions (Ashman, Moran et al. 2001) (Xu, Piston et al. 1999). However, the completely in vitro analyzes with protein or substance arrays also have major disadvantages. In this method, proteins are produced or analyzed under completely artificial conditions. Furthermore, the application possibilities of this array-based in vitro analytical methods for the detection and analysis of protein interactions as determined by the occurrence of high non-specific background signals due to the limited 'sensitivity and by difficulties in the detection of proteins with physico-chemical properties strongly limited (Ashman, Moran et al. 2001).
Ein weitere Möglichkeit zur Identifizierung von Protein-Interaktionen ist die Phagen-Display- Methode, die es auch erlaubt in großem Maßstab nach Protein-Interaktionen zu suchen (Deshayes, 2002; Sidhu, 2003). Bei dieser Methode werden Peptide oder Proteine an geeignete Capsid- oder Hüllproteine von filamentösen Bakteriophagen fusioniert, so daß sie an der Oberfläche des Bakteriophagen zugänglich sind und mit einem vorgelegten, in der Regel immobilisierten Protein, dem sogenannten Köder (bait) interagieren können. Auf diese Weise können Peptid- oder Proteinbibliotheken exprimiert und auf Interaktion mit dem vorgegebenen Köderprotein untersucht werden. Ein großer Nachteil dieser Methode ist allerdings, dass nur Protein-Interaktionen identifiziert und analysiert werden können, die unter artifiziellen Bedingungen möglich sind, da sie in einer in vitro Umgebung stattfinden. Das Screening nach Antagonisten von Protein-Protein Interaktionen bleibt dabei aufgrund der Verknüpfung von Phänotyp und Genotyp auf Peptide und Proteine als Substanzklassen beschränkt.Another possibility for the identification of protein interactions is the phage display method, which also makes it possible to search for protein interactions on a large scale (Deshayes, 2002; Sidhu, 2003). In this method, peptides or proteins are fused to suitable capsid or coat proteins of filamentous bacteriophages so that they are accessible on the surface of the bacteriophage and can interact with a presented, usually immobilized protein, the so-called bait. In this way, peptide or protein libraries can be expressed and examined for interaction with the predetermined bait protein. A major disadvantage of this method, however, is that only protein interactions can be identified and analyzed that are possible under artificial conditions, since they take place in an in vitro environment. The screening for antagonists of protein-protein interactions remains limited to peptides and proteins as substance classes due to the combination of phenotype and genotype.
Es sind weiterhin diverse Verfahren bekannt, bei denen Protein-Interaktionen in der Zelle - und damit in vivo - durch die indirekte Aktivierung genetischer Reporter detektiert werden. Die meisten der gängigen Verfahren sind auf den Nachweis binärer Proteininteraktionen im Karyoplasma beschränkt und beruhen auf der funktionalen Modularität von Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise das 2-Hybrid-System in Hefen (Fields and Song 1989). Beim 2-Hybrid- System werden in Hefezellen ein oder mehrere Proteine oder Proteinabschnitte als Fusionsproteine mit einem DNA-Bindungsprotein ohne Transaktivierungsfähigkeit exprimiert und als sogenannter Köder (Bait) zur Detektion interagierender Komponenten eingesetzt. Ein zweites Protein oder Proteinfragment wird als Fusionsprotein mit einer transkriptionellen Transaktivierungsdomäne exprimiert und stellt die sogenannte Beute-Komponente (Prey) dar. Die so genannte Beute- bzw. Prey- Komponente ist häufig ein Fusionsprotein, das neben der transkriptionellen Transaktivierungsdomäne ein Genprodukt einer komplexen cDNA-Bibliothek umfasst. Bei Interaktion des bait- und prey- Fusionsproteins kommt es zu einer funktionalen Rekonstituierung des aktivierenden Transkriptionsfaktors. Als Reporter-Gene werden beim 2-Hybrid-System Enzyme verwendet, mit denen die Protein-Interaktion entweder durch eine Wachstumsselektion oder durch einen einfachen kolorimetrischen Test nachgewiesen werden können und die sehr sensitiv sind. Ein beim 2-Hybrid-System häufig verwendetes Reporter-Gen, das eine positive Wachstumsselektion von Zellen mit spezifschen Protein-Protein-Interaktionen ermöglicht, ist das Histidin 3-Gen, welches ein essentielles Enzym zur biosynthetischen Herstellung von Histidin darstellt und dessen Protein-Protein-rnteraktions-abhängige Expression das Wachstum der Zellen auf Histidin-defizientem Medium ermöglicht. Das häufigst verwendete Reporter-Gen, dessen Protein-Protein-Interaktiόns-abhängige Expression durch einen einfachen kolorimetrischen Test nachgewiesen werden kann, ist das beta-Galaktosidase-Gen. Ursprünglich wurde das 2-Hybrid System in Hefe entwickelt, in der Folge wurden jedoch auch Varianten des 2-Hybrid Systems für die Anwendung in E. coli und in höheren eukaryotischen Zellen beschrieben (Luban and Goff 1995) (Karimova, Pidoux et al. 1998) (Fearon, Finkel et al. 1992) (Shioda, Andriole et al. 2000).Various methods are also known in which protein interactions in the cell - and thus in vivo - are detected by the indirect activation of genetic reporters. Most of the common methods are limited to the detection of binary protein interactions in the karyoplasm and are based on the functional modularity of transcription factors, such as the 2-hybrid system in yeasts (Fields and Song 1989). In the 2-hybrid system, one or more proteins or protein segments are expressed as fusion proteins with a DNA binding protein without transactivation ability in yeast cells and used as a so-called bait (bait) for the detection of interacting components. A second protein or protein fragment is expressed as a fusion protein with a transcriptional transactivation domain and represents the so-called prey component (prey). The so-called prey or prey component is often a fusion protein which, in addition to the transcriptional transactivation domain, is a gene product of a complex cDNA Library includes. When the bait and prey fusion proteins interact, the activating transcription factor is functionally reconstituted. Enzymes are used as reporter genes in the 2-hybrid system, with which the protein interaction can be detected either by growth selection or by a simple colorimetric test and which are very sensitive. A reporter gene frequently used in the 2-hybrid system, which enables positive growth selection of cells with specific protein-protein interactions, is the histidine 3 gene, which is an essential enzyme for the biosynthetic production of histidine and its protein protein Interaction-dependent expression enables the growth of the cells on histidine-deficient medium. The most frequently used reporter gene, whose protein-protein interaction-dependent expression can be detected by a simple colorimetric test, is the beta-galactosidase gene. The 2-hybrid system was originally developed in yeast, but subsequently variants of the 2-hybrid system for use in E. coli and in higher eukaryotic cells have also been described (Luban and Goff 1995) (Karimova, Pidoux et al. 1998 ) (Fearon, Finkel et al. 1992) (Shioda, Andriole et al. 2000).
Ein wesentlicher Nachteil der klassischen 2-Hybrid-basierten Systeme liegt u.a. in der relativ hohen Rate an sowohl falsch-negativ wie auch falsch-positiv detektierten Interaktionspartnern. Dies liegt zum einem an der hohen Sensitivität der Reporter, aber auch an der räumlichen Kopplung der Interaktion und der basalen Transkriptionsmaschinerie. Viele in cDNA-Bibliotheken kodierte Proteine bzw. Proteindomänen können mit einer oder mehreren Komponenten des Transkriptions-initiationskomplexes einschließlich Transaktivator-gebundener Promotor-DNA interagieren und so zu einem falsch positiven Signal führen (Bartel, 1993). Desweiteren ist von großem Nachteil, dass die Protein-Protein- Interaktionen konstitutiv sein und im Kern von Hefezellen stattfinden müssen.A major disadvantage of classic 2-hybrid-based systems is in the relatively high rate of both false-negative and false-positive interaction partners. This is due on the one hand to the high sensitivity of the reporters, but also to the spatial coupling of the interaction and the basal transcription machinery. Many proteins or protein domains coded in cDNA libraries can interact with one or more components of the transcription initiation complex, including transactivator-bound promoter DNA, and thus lead to a false positive signal (Bartel, 1993). Another major disadvantage is that the protein-protein interactions must be constitutive and must take place in the core of yeast cells.
Kürzlich wurden Interaktionssysteme für Hefezellen beschrieben, die den Ort der Interaktion räumlich von der Aktivierung der verwendeten Reportergene oder der zur Detektion verwendeten Selektionsmechanismen entkoppeln (Maroun and Aronheim 1999). Verwandte Systeme in Hefe erlauben auch die Analyse zumindest eines Interaktionspartners, der ein integrales oder membran-assoziiertes Protein sein kann (Hübsman, Yudkovsky et al. 2001) (Ehrhard, Jacoby et al. 2000).Interaction systems for yeast cells have recently been described which spatially decouple the location of the interaction from the activation of the reporter genes used or the selection mechanisms used for detection (Maroun and Aronheim 1999). Related systems in yeast also allow the analysis of at least one interaction partner, which can be an integral or membrane-associated protein (Hübsman, Yudkovsky et al. 2001) (Ehrhard, Jacoby et al. 2000).
Eine Methode zur Analyse von Interaktionen in lebenden Zellen und Bakterien ist die funktioneile Komplementation von Proteinen oder Enzymen, die auch die Basis der klassischen 2-Hybrid-basierten Systeme darstellt (Ulimann, Perrin et al. 1965) (Fields and Song 1989) (Mohler and Blau 1996) (Rossi, Charlton et al. 1997) (Pelletier, Campbell- Valois et al. 1998). Unter Transkomplementation versteht man die Trennung eines intakten und funktionalen Proteins oder Proteinkomplexes in zwei künstliche Untereinheiten auf Gen- Ebene. Die beiden Untereinheiten sind hierbei für sich gesehen inaktiv bezüglich der Funktion des Gesamtproteins, jedoch aktiv bezüglich ihrer entsprechenden Untereinheiten-Funktion und sie besitzen keine Fähigkeit zur Selbstrekonstitution. Die Fusion solcher Untereinheiten an Proteine oder Proteindomänen, die miteinander interagieren, führt durch die Protein- Interaktions-abhängige Herstellung großer räumlicher Nähe zwischen den beiden getrennten Untereinheiten zur Komplementation des geteilten Proteins, wobei es wieder funktionell wird. Die Wiedererlangung der Funktion des Proteins (z.B. eines Enzyms) durch eine Protein- Interaktion wird dabei direkt oder indirekt als Nachweis für die Wechselwirkung benutzt (Mohler and Blau 1996) (Rossi, Charlton et al. 1997). Das bekannteste Beispiel ist die Transkomplementation des Transkriptionsfaktors Gal4, welche die Grundlage des klassischen Hefe-2-Hybrid Systems darstellt (Fields and Song 1989).One method for analyzing interactions in living cells and bacteria is the functional complementation of proteins or enzymes, which is also the basis of classic 2-hybrid-based systems (Ulimann, Perrin et al. 1965) (Fields and Song 1989) (Mohler and Blau 1996) (Rossi, Charlton et al. 1997) (Pelletier, Campbell-Valois et al. 1998). Transcomplementation is the separation of an intact and functional protein or protein complex into two artificial subunits at the gene level. The two subunits are in themselves inactive with regard to the function of the total protein, but are active with regard to their corresponding subunit function and they have no self-reconstitution ability. The fusion of such subunits to proteins or protein domains that interact with one another leads to the complementation of the divided protein by the protein interaction-dependent production of a large spatial proximity between the two separate subunits, whereby it becomes functional again. The recovery of the function of the protein (eg an enzyme) through a protein interaction is used directly or indirectly as evidence of the interaction (Mohler and Blau 1996) (Rossi, Charlton et al. 1997). The best known example is the transcomplementation of the transcription factor Gal4, which forms the basis of the classic yeast-2 hybrid system (Fields and Song 1989).
Ein Selektionssystem, das auf einer Protein-Transkomplementation besonderer Art beruht, ist das ursprünglich für Studien in Hefe entwickelte und kürzlich auch in Säugerzellen angewandte „Split Ubiquitin System". Dieses benutzt die Trennung von Ubiquitin, in zwei nicht-funktionelle Anteile, ein N- und ein C-terminales Fragment (NUb und Cub) (Johnsson and Varshavsky 1994) (Rojo-Niersbach, Morley et al. 2000). Ubiquitin ist ein kleines Protein, welches normalerweise an seinen C-Terminus fusionierte Proteine für den zellulären Abbau markiert. Dieser biologische Mechanismus wird im „Split Ubiquitin System" zur Detektion von Protein-Interaktionen eingesetzt. In einer Ausführungsform des „Split Ubiquitin Systems" wird in der Zelle ein erstes Fusionsprotein umfassend das C-terminale Fragment Cub, ein daran gekoppeltes Selektionsmarker-Protein oder fluoreszierendes Protein und einen ersten Interaktionspartner und ein zweites Fusionsprotein umfassend das N-terminale Fragment Nub und den zweiten Interaktionspartner heterolog exprimiert. Bei einer spezifischen Interaktion der entsprechenden Fusionsproteine wird ein korrekt gefaltetes Ubiquitin wiederhergestellt, welches vom Proteasom erkannt und prozessiert werden kann und wobei der gekoppelte zunächst aktive Reporter anschließend degradiert wird. Das System erlaubt demnach eine negative, auf Abwesenheit des Selektionsmarkers gerichtete Wachstumsselektion bzw. die Beobachtung des Verschwindens eines fluoreszierenden Reporters. Diese in wissenschaftlichen Publikationen dargestellten Ausführungen des „Split Ubiquitin Systems" offenbaren somit zwei große Schwachpunkte, erstens erschwert die negative Selektion die schnelle und eindeutige Detektion relevanter Interaktionen und zweitens findet nach erfolgter Interaktion keine Signalverstärkung in der Zelle statt. Letzteres macht es nahezu unmöglich, schwache bzw. transiente Interaktionen zu detektieren.A selection system based on a particular type of protein transcomplementation is the "split ubiquitin system", which was originally developed for studies in yeast and recently also used in mammalian cells. It uses the separation of ubiquitin into two non-functional parts, an N- and a C-terminal fragment (NUb and Cub) (Johnsson and Varshavsky 1994) (Rojo-Niersbach, Morley et al. 2000) Ubiquitin is a small protein that labels proteins fused to its C-terminus for cellular degradation. This biological mechanism is used in the "Split Ubiquitin System" for the detection of protein interactions. In one embodiment of the “split ubiquitin system”, a first fusion protein comprising the C-terminal fragment Cub, a selection marker protein or fluorescent protein coupled thereto and a first interaction partner and a second fusion protein comprising the N-terminal fragment Nub and the In the case of a specific interaction of the corresponding fusion proteins, a correctly folded ubiquitin is restored, which can be recognized and processed by the proteasome and the coupled, initially active reporter is subsequently degraded. The system therefore allows a negative, directed towards the absence of the selection marker Growth selection or the observation of the disappearance of a fluorescent reporter. These explanations of the "Split Ubiquitin System" presented in scientific publications thus reveal two major weaknesses e negative selection the quick and clear detection of relevant interactions and secondly after the interaction there is no signal amplification in the cell. The latter makes it almost impossible to detect weak or transient interactions.
In einer in WO 95/29195 offenbarten Ausführungsform des "Split Ubiquitin Systems" werden zwei unterschiedliche Fusionsproteine in einer Zelle exprimiert, die jeweils einen Interaktionspartner und einen Teil des Ubiquitins umfassen. Eines der beiden Fusionsproteine umfasst hierbei weiterhin ein Reporter-Protein, welches durch eine Ubiquitin-spezifische Protease proteolytisch abspaltbar ist. Dieses Reporter-Protein wird hierbei erst nach dem Auftreten einer spezifischen Protein-Protein-Interaktion durch eine Ubiquitin-spezifische Protease abgespalten und dadurch aktiviert. Ein Nachteil dieser Methode ist ihre Abhängigkeit von zusätzlichen zellulären Faktoren, in diesem Fall Ubiquitinasen, die nur in einem bestimmten zellulären Kompartiment existieren.In one embodiment of the "split ubiquitin system" disclosed in WO 95/29195, two different fusion proteins are expressed in a cell, each of which comprises an interaction partner and part of the ubiquitin. One of the two fusion proteins also comprises a reporter protein which can be proteolytically cleaved by an ubiquitin-specific protease. This reporter protein is only activated after a specific protein-protein interaction by an ubiquitin-specific Protease cleaved and activated. A disadvantage of this method is its dependence on additional cellular factors, in this case ubiquitinases, which only exist in a certain cellular compartment.
Transkomplementationen und daran gekoppelte Nachweismethoden für Protein-Interaktionen wurden ferner für unterschiedliche Proteine mit enzymatischer Aktivität beschrieben, u.a. beta-Galaktosidase (bGal), Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) und beta-Lactamase (bLac) (Michnick and Remy 2001) (Rossi, Charlton et al. 1997) (Michnick and Galarneau 2001). Der indirekte Nachweis von Protein-Interaktionen kann bei diesen Systemen nach Transkomplementation der oben genannten Enzyme durch Wachstumsselektion oder durch fluoreszenz- oder kolorimetrische Enzym-Nachweise erfolgen. Je nach verwendetem Substrat kann der Nachweis meist erst nach Aufschluss der Zellen und Zugabe des Substrates in vitro durchgeführt werden.Transcomplementations and detection methods for protein interactions coupled to them have also been described for different proteins with enzymatic activity, i.a. beta-galactosidase (bGal), dihydrofolate reductase (DHFR) and beta-lactamase (bLac) (Michnick and Remy 2001) (Rossi, Charlton et al. 1997) (Michnick and Galarneau 2001). In these systems, indirect detection of protein interactions can be carried out after transcomplementation of the above-mentioned enzymes by growth selection or by fluorescence or colorimetric enzyme detection. Depending on the substrate used, the detection can usually only be carried out after the cells have been disrupted and the substrate has been added in vitro.
Beim DHFR-basierten System kann die Protein-Interaktion bzw. die Transkomplementation auch direkt in vivo nachgewiesen werden. Dazu wird ein zellpermeabler fluoreszenzmarkierter Antagonist (Methotrexat) zugegeben, der nur an das intakte Protein bindet. Der Nachteil hierbei ist allerdings, daß der Antagonist kein Substrat des Enzyms ist, sondern als kompetitiver Inhibitor das Enzym bindet. Es kommt daher zu keinerlei enzymatischen Verstärkung des Detektionssignals. Dies führt dazu, daß die Sensitivität dieser Detektionsmethode gegenüber der Detektion positiver Klone durch positive Wachstumsselektion unter den entsprechenden Kulturbedingungen stark herabgesetzt ist. Zudem ist das Detektionssignal beim DHFR-basierten System zur Analyse von Protein- Interaktionen nur direkt nach der Zugabe des fluoreszenz-markierten Inhibitors sichtbar, d.h. dynamische Abläufe in Zellen, die häufig mit dynamischen bzw. transienten Protein- Interaktionen einhergehen, können mit diesen nicht permanenten, nur kurzzeitig detektierbaren Signalen nicht nachgewiesen werden. Darüberhinaus ist der beschriebene Inhibitor (Methotrexat) eine stark zytotoxische Substanz, die nach Applikation Zellwachstum, Metabolismus und andere intrazelluläre Prozesse stark beeinträchtigt und verändert und damit die normalen in vivo-Bedingungen verfälscht.With the DHFR-based system, the protein interaction or transcomplementation can also be detected directly in vivo. For this purpose, a cell-permeable fluorescence-labeled antagonist (methotrexate) is added, which only binds to the intact protein. The disadvantage here, however, is that the antagonist is not a substrate of the enzyme, but rather binds the enzyme as a competitive inhibitor. There is therefore no enzymatic amplification of the detection signal. The result of this is that the sensitivity of this detection method to the detection of positive clones is greatly reduced by positive growth selection under the corresponding culture conditions. In addition, the detection signal in the DHFR-based system for analyzing protein interactions is only visible directly after the addition of the fluorescence-labeled inhibitor, i.e. Dynamic processes in cells, which are often associated with dynamic or transient protein interactions, cannot be detected with these non-permanent, only briefly detectable signals. In addition, the described inhibitor (methotrexate) is a highly cytotoxic substance which, after application, severely impairs and changes cell growth, metabolism and other intracellular processes and thus falsifies the normal in vivo conditions.
Eine DHFR-basierte Methode zur Analyse von Protein-Interaktionen, die auf der positiven Wachstumsselektion von Zellen mit transkomplementiertem DHFR - und nicht auf der Applikation von Methotrexat - basiert, bietet zwar eine entsprechend höhere Sensitivität, beansprucht jedoch Zeiträume von mehreren Tagen und Wochen, ein Umstand der diese Methode zur Anwendung in Hochdurchsatzverfahren, so z.B. im Mgh-throughput-Screening, wenig geeignet erscheinen lässt. Eine weitere Anwendung der Transkomplementation zur Analyse von Protein-Protein- Interaktionen basiert auf dem sogenannten Protein-Splicing. Protein-Splicing ist eine posttranslationale Proteinmodifikation, durch welche ein internes Proteinsegment (Intein) aus einem Vorläuferfusionsprotein herausgeschnitten wird, wobei die flankierenden äußeren Proteinfragmente (Exteine) zu einer fortlaufenden Polypeptidkette ligiert werden (Gimble, 1998). Zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen werden in Zellen zwei Fusionsproteine exprimiert, bestehend aus den zwei interagierenden Proteinen, dem N- bzw. C-terminalen Teil eines Inteins und dem C- bzw. N-terminalen Teil eines Reporterproteins wie GFP oder Luziferase als Extein (Umezawa, Ozawa US 2003/0003506A1). Wenn durch die Protein- Protein-Interaktion die beiden Teile des Inteins zusammengebracht werden, wird durch Trans- Splicing der N- und C-terminale Teil des Reporters zu einem funktionellen Reporterprotein zusammengesetzt. Allerdings ist bislang die Effizienz der Trans-Splicing Reaktion noch relativ gering, so dass nur stabile Protein-Protein Interaktionen bei genügend hoher Proteinexpression nachgewiesen werden können (Ozawa, 2001; Ozawa, 2000). US 6562576 beschreibt in einer weiteren Ausführungsform die Verwendung von auxotrophen Proteinen sowie eines Transkriptionsfaktors als Reporterprotein dienendes Extein in Hefezellen.A DHFR-based method for the analysis of protein interactions, which is based on the positive growth selection of cells with transcomplemented DHFR - and not on the application of methotrexate - offers a correspondingly higher sensitivity, but takes time of several days and weeks Circumstances that make this method seem unsuitable for use in high-throughput processes, such as in Mgh throughput screening. Another application of transcomplementation for the analysis of protein-protein interactions is based on so-called protein splicing. Protein splicing is a post-translational protein modification by which an internal protein segment (intein) is cut out of a precursor fusion protein, whereby the flanking outer protein fragments (exteines) are ligated into a continuous polypeptide chain (Gimble, 1998). For the analysis of protein-protein interactions, two fusion proteins are expressed in cells, consisting of the two interacting proteins, the N- or C-terminal part of an inte and the C- or N-terminal part of a reporter protein such as GFP or luciferase Extein (Umezawa, Ozawa US 2003 / 0003506A1). If the protein-protein interaction brings together the two parts of the inte, the N- and C-terminal part of the reporter is assembled into a functional reporter protein by trans-splicing. However, the efficiency of the trans-splicing reaction has so far been relatively low, so that only stable protein-protein interactions can be detected with sufficiently high protein expression (Ozawa, 2001; Ozawa, 2000). In a further embodiment, US 6562576 describes the use of auxotrophic proteins and a transcription factor as the protein serving as reporter protein in yeast cells.
Ein neues Verfahren, das ebenfalls auf der Transkomplementation eines Enzyms beruht, wird in der Patentanmeldung („Neue Verfahren zur Analyse von Protein Interaktionen in vivo") offenbart. Dieses System besteht aus zwei Schaltern, einer transkomplementierten Protease und einer Rekombinase, die es ermöglichen, eine transiente Protein-Interaktion in vivo in ein stabiles, amplifiziertes Signal umzusetzen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dazu ein erstes Fusionsprotein bestehend aus einem ersten Interaktionspartner und dem N- terminalen Teil der Protease und ein zweites Fusionsprotein bestehend aus einem zweiten Interaktions-partner und dem C-terminalen Teil der Protease heterolog in der Zelle exprimiert. Ferner wird ein ausserhalb des Zellkerns verankerter und über eine spezifische Proteaseerkennungsstelle freisetzbarer Transkriptionsfaktor in der Zelle exprimiert. Desweiteren wird eine Rekombinase, deren Gen durch diesen verankerten Transkriptionsfaktor angeschaltet wird und ein durch die Recombinase aktivierbares Reportergen in der Zelle exprimiert. Durch Interaktion der beiden Interaktionspartner wird die Proteaseaktivität rekonstituiert, wodurch der verankerte Transkriptionsfaktor freigesetzt wird. Dieser kann nun unabhängig von der Dauer der Interaktion im Zellkern die Expression des Rekombinasegens induzieren. Die Rekombinase bewirkt ihrerseits die Expression des Reportergens. Ein kritischer Punkt bei diesem Verfahren ist die Verankerung des Transkriptionsfaktors, die so erfolgen muß, daß der Transkriptionsfaktor in möglichst große räumliche Nähe der komplementierten Protease kommt, um effektiv abgespalten werden zu können. Ein weiteres System, für Säugerzellen beschrieben, beruht auf der Aktivierung und Dimerisierung von modifizierten Typ I Cytokine-Rezeptoren (Eyckerman, Verhee et al. 2001). Die Aktivierung des STAT3-Signalweges kann in diesem System nur erfolgen, wenn eine Interaktion zwischen dem Bait-Rezeptorfusionsprotein und dem Prey-Fusionsprotein stattfindet. Das Prey-Protein ist an gpl30 fusioniert, welches STAT-Bindungsstellen trägt. Die Rezeptor assoziierten Janus-Kinasen phosphorylieren gpl30 nur nach Bait-Prey Interaktion, dies führt zu einer Bindung, Phosphorylierung und nachgeschalteter Kerntranslokation von STAT3 -Transkriptionsfaktoren. STAT regulierte Reportergene werden abhängig von der Bait-Prey Interaktion exprimiert. Zur Identifizierung neuer intrazellulärer Interaktionspartner wurde eine Selektionsstrategie etabliert, die Puromycin-Resistenz vermittelt (Eyckerman, Verhee et al. 2001). Die Methode erlaubt zwar die Detektion einer Protein-Protein Interaktion an der Membran durch die Expression eines Reportergens, sie verlangt allerdings die Kopplung mindestens eines Interaktionspartners an besagten Membranrezeptor. Zudem ist die komplexe Quartärstruktur des Rezeptor-Kinase-GP130 Multimers nicht dazu geeignet, schwierige Proteinklassen wie Membranproteine zu analysieren. Das System ist aufgrund mangelnder Amplifikation und Beständigkeit des Signals nicht in der Lage, transiente oder schwache Interaktionen zu analysieren.A new method, which is also based on the trans-complementation of an enzyme, is disclosed in the patent application ("New methods for analyzing protein interactions in vivo"). This system consists of two switches, a trans-complemented protease and a recombinase, which make it possible to convert a transient protein interaction in vivo into a stable, amplified signal In a preferred embodiment, a first fusion protein consisting of a first interaction partner and the N-terminal part of the protease and a second fusion protein consisting of a second interaction partner and the C-terminal part of the protease is heterologously expressed in the cell, a transcription factor anchored outside the nucleus and releasable via a specific protease recognition site is also expressed in the cell, and a recombinase whose gene is switched on by this anchored transcription factor is un d expresses a reporter gene that can be activated by the recombinase in the cell. The protease activity is reconstituted by interaction of the two interaction partners, whereby the anchored transcription factor is released. This can now induce the expression of the recombinase gene regardless of the duration of the interaction in the cell nucleus. The recombinase in turn causes the expression of the reporter gene. A critical point in this method is the anchoring of the transcription factor, which has to be done in such a way that the transcription factor comes as close as possible to the complemented protease in order to be cleaved effectively. Another system, described for mammalian cells, is based on the activation and dimerization of modified type I cytokine receptors (Eyckerman, Verhee et al. 2001). The STAT3 signaling pathway can only be activated in this system if there is an interaction between the bait receptor fusion protein and the prey fusion protein. The Prey protein is fused to gpl30, which carries STAT binding sites. The receptor-associated Janus kinases only phosphorylate gpl30 after bait-prey interaction, which leads to binding, phosphorylation and subsequent nuclear translocation of STAT3 transcription factors. STAT regulated reporter genes are expressed depending on the bait-prey interaction. To identify new intracellular interaction partners, a selection strategy was established that mediates puromycin resistance (Eyckerman, Verhee et al. 2001). Although the method allows the detection of a protein-protein interaction on the membrane by the expression of a reporter gene, it requires the coupling of at least one interaction partner to said membrane receptor. In addition, the complex quaternary structure of the receptor kinase GP130 Multimer is not suitable for analyzing difficult protein classes such as membrane proteins. The system is unable to analyze transient or weak interactions due to insufficient signal amplification and stability.
Verfahren, die auf der Übertragung von Energiequanten eines Donor-Moleküls auf ein Akzeptor-Molekül beruhen, sofern diese in unmittelbare Nähe gebracht werden, sind theoretisch wenig eingeschränkt. Diese Verfahren können verschiedene Varianten des Green Fluorescent Protein (GFP) von Aequorea victoria verwenden, die aufgrund ihrer spezifischen Spektraleigenschaften zu Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) fähig sind (Siegel, Chan et al. 2000). Ein ähnliches Verfahren beruht auf einer Energie-Kopplung der Bioluminiszenz der Luziferase-Luziferin Reaktion als Energie-Donor und GFP als Energie- Akzeptor. Die Energieübertragung wird als Bioluminizenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) Effekt bezeichnet (Xu, Piston et al. 1999). Hierbei ist allerdings die Zugabe von entsprechenden Luziferase- Substraten notwendig. Die wesentlichen Nachteile dieser Methoden liegen in der Sensitivität und der Schwierigkeit des Nachweises begründet. Zur Detektion von FRET-Effekten in vivo ist sowohl eine sehr starke Expression als auch eine aufwendige Analyse notwendig. Starke Überexpression von Proteinen in heterologen Zellen führen oft zur Aggregatbildung, falscher Faltung oder fehlgeleiteter subzellulärer Lokalisation. Die Methode bietet keine Möglichkeit einer Signalverstärkung bzw. - amplifikation, ein entscheidender Nachteil, der die Detektion schwacher Interaktionen oder Interaktionen schwach exprimierter Proteine ausschließt. Um eine Proteininteraktion von spektral kompatiblen GFP -Fusionsproteinen durch FRET-Effekte in der Zelle nachweisen zu können, müssen Hintergrundsubtraktionen und Ausbleichungsanalysen durchgeführt werden (Haj, Verveer et al. 2002). Die Methode eignet sich aufgrund des hohen technischen Aufwandes nicht für Hochdurchsatzverfahren zur Analyse von Protein-Interaktionen, darüberhinaus verlangt sie aufwendige Analysen und große Erfahrung, was einer breiten Anwendung entgegen steht.Methods that are based on the transfer of energy quanta from a donor molecule to an acceptor molecule, provided that they are brought into close proximity, are theoretically not very limited. These methods can use different variants of the Green Fluorescent Protein (GFP) from Aequorea victoria, which due to their specific spectral properties are capable of fluorescence resonance energy transfer (FRET) (Siegel, Chan et al. 2000). A similar process is based on an energy coupling of the bioluminescence of the luciferase-luciferin reaction as an energy donor and GFP as an energy acceptor. The energy transfer is called the bioluminescence resonance energy transfer (BRET) effect (Xu, Piston et al. 1999). However, the addition of appropriate luciferase substrates is necessary. The main disadvantages of these methods lie in the sensitivity and the difficulty of the detection. In order to detect FRET effects in vivo, both a very strong expression and a complex analysis are necessary. Strong overexpression of proteins in heterologous cells often leads to aggregate formation, incorrect folding or misdirected subcellular localization. The method offers no possibility of signal amplification or amplification, a decisive disadvantage which excludes the detection of weak interactions or interactions of poorly expressed proteins. In order to be able to detect a protein interaction of spectrally compatible GFP fusion proteins by FRET effects in the cell, background subtractions and bleaching analyzes must be carried out (Haj, Verveer et al. 2002). Due to the high technical complexity, the method is not suitable for high-throughput methods for the analysis of protein interactions, in addition, it requires extensive analyzes and great experience, which is against wide application.
Die Messung von Protein-Interaktionen und insbesondere das Screening nach Molekülen, die Protein-Interaktionen beeinflussen, erfolgt typischerweise in vitro, insbesondere bei Hochdurchsatz-Screening Verfahren. Dabei stehen verschiedene Methoden, denen unterschiedliche physikalische Prinzipien zugrunde liegen, zur Verfügung. Dazu gehören die Surface Plasmon Resonanz Spektroskopie, Fluoreszenzenergietransfer,The measurement of protein interactions and in particular the screening for molecules which influence protein interactions is typically carried out in vitro, in particular in the case of high-throughput screening methods. Various methods are available, which are based on different physical principles. These include surface plasmon resonance spectroscopy, fluorescence energy transfer,
Fluoreszenzpolarisation, Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, AlphaScreen Assays, Scintillation Proximity Assays, Immunoassays etc. Bei diesen Methoden wird typischerweise mindestens einer der Interaktionspartner rekombinant hergestellt und gereinigt und dann in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von biologischen oder synthetischen Substanzen mit einer der physikalsichen Methoden auf seine Wechselwirkung mit dem zweiten Interaktionspartner, der entweder ebenfalls gereinigt vorliegt oder in geeigneten Zellpräparationen präsentiert wird, hin untersucht. Bei Ko-präzipitationsassays wird zwar der Komplex unter natürlichen Bedingungen gebildet. Jedoch uss er das biochemische Verfahren der Präzipitation überstehen, was i.a. einen Zellaufschluß bzw. Solubilisierung der Proteine beinhaltet, sowie mehrere Inkubations- und Waschschritte. Aufgrund der schon oben skizzierten Nachteile eignet sich dieses Verfahren nicht zum Screening. Auch bei der Phagen-Display Methode erfolgt die Protein-Interaktion in einer in vitro Umgebung. Die in vitro Bedingungen unter denen die Protein- Interaktionen gescreent werden, reflektieren jedoch nicht die komplizierten sich beeinflussenden Parameter und tatsächlichen Bedingungen, die vorliegen, wenn die Protein-Interaktion in der Zelle erfolgt. Für das Screening von Interaktionsmodulatoren und die Entwicklung neuer Therapeutika ist es daher extrem wichtig, die Modulation der Protein- Interaktion in vivo direkt in der Zelle in ihrer nativen Umgebung zu erfassen.Fluorescence polarization, fluorescence correlation spectroscopy, AlphaScreen assays, scintillation proximity assays, immunoassays etc. With these methods, at least one of the interaction partners is typically produced and purified recombinantly and then in the absence or presence of biological or synthetic substances with one of the physical methods for its interaction with the second Interaction partner, which is either also present in purified form or is presented in suitable cell preparations, is examined. In co-precipitation assays, the complex is formed under natural conditions. However, he must survive the biochemical process of precipitation, which is generally includes cell disruption or solubilization of the proteins, as well as several incubation and washing steps. Because of the disadvantages outlined above, this method is not suitable for screening. In the phage display method, too, the protein interaction takes place in an in vitro environment. However, the in vitro conditions under which the protein interactions are screened do not reflect the complicated influencing parameters and actual conditions that exist when the protein interaction takes place in the cell. For the screening of interaction modulators and the development of new therapeutic agents, it is extremely important to detect the modulation of the protein interaction in vivo directly in the cell in its native environment.
Das oben beschriebene Yeast-Two-Hybrid Verfahren und insbesondere das reverse Yeast- Two-Hybrid Verfahren, ermöglichen in vivo das Screening nach Substanzen, die Protein- Protein-Interaktionen beeinflussen. Insbesondere das reverse Yeast-Two-Hybrid System wird eingesetzt, um Substanzen zu finden, die Protein-Protein-Interaktionen hemmen. Beim reversen Yeast-Two-Hybrid System wird als Reportergen ein toxischer Marker verwendet ie z.B. URA3 oder CYH2, so dass die Dissoziation der untersuchten Protein-Protein-Interaktion einen selektiven Wachstumsvorteil bietet (Vidal, 1999). Auch für das Screening nach Substanzen hat das Yeast-Two-Hybrid Verfahren den großen Nachteil, dass nur Protein- Protein-Interaktionen, die im Zellkern stattfinden, untersucht werden können. Das schließt alle Protein-Protein-Interaktionen aus, die Kompartiment-spezifisch außerhalb des Zellkerns erfolgen oder von posttranslationalen Modifikationen abhängig sind. Ferner können Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren nicht untersucht werden. Ein weiterer Nachteil für das Screening von Substanzen in allen Hefesystemen einschließlich den oben beschriebenen Systemen zur Transkomplementation von Ubiquitin oder eines Inteins liegt in der unterschiedlichen Permeabilität von Hefezellmembranen mit umgebender Zellwand im Vergleich zu Säugetierzellen.The above-described yeast two-hybrid method and in particular the reverse yeast two-hybrid method enable in vivo screening for substances which influence protein-protein interactions. In particular, the reverse yeast two-hybrid system is used to find substances that inhibit protein-protein interactions. In the reverse yeast two-hybrid system, a toxic marker is used as the reporter gene ie URA3 or CYH2, so that the dissociation of the protein-protein interaction examined offers a selective growth advantage (Vidal, 1999). The yeast two hybrid method also has the major disadvantage for screening for substances that only protein-protein interactions that take place in the cell nucleus can be investigated. This excludes all protein-protein interactions that occur compartment-specifically outside the cell nucleus or are dependent on post-translational modifications. Furthermore, interactions between transcription factors cannot be examined. Another disadvantage for the screening of substances in all yeast systems, including the above-described systems for transcomplementing ubiquitin or an ink, lies in the different permeability of yeast cell membranes with the surrounding cell wall compared to mammalian cells.
Die verschiedenen beschriebenen Systeme zur Transkomplementation in Säugetierzellen können mit den oben beschriebenen Einschränkungen prinzipiell zum Screening in vivo nach Substanzen, die Protein-Protein-Interaktionen beeinflussen, verwendet werden. Allerdings wurden bislang keine derartigen Anwendungen publiziert.The various systems described for transcomplementation in mammalian cells can, with the restrictions described above, be used in principle for screening in vivo for substances which influence protein-protein interactions. However, no such applications have been published to date.
In der Anmeldung („Neue Verfahren zur Analyse von Protein Interaktionen in vivo") sind neben Verfahren zum cDNA Screening nach Interaktionspartnern eines Proteins auch Ideen zum Finden von Substanzen beschrieben, die Protein-Protein-Interaktionen inhibieren. So erfolgt z.B. ein in obiger Erfindung durch Abbildungen illustriertes Verfahren derart, dass zwei interagierende Proteine X und Y an die intakte TEV-Protease bzw. an einen (noch zu findenden) TEV-Inhibitor fusioniert sind. Solange die beiden Proteine X und Y interagieren, gelangt der an Y fusionierte TEV-Inhibitor in räumliche Nähe der an X fusionierten TEV- Protease und hemmt diese, so dass kein Double Switch Signal ausgelöst werden kann. Wenn eine inhibierende Substanz die Interaktion zwischen X und Y hemmt, kann der an Y fusionierte TEV-Inhibitor die an X fusionierte TEV-Protease nicht mehr hemmen und es wird durch die nun aktive TEV-Protease ein Double Switch Signal ausgelöst. Dieses skizzierte Verfahren hat zwei Nachteile, die ein Gelingen in Frage stellen: Erstens gibt es bisher keinen TEV-Inhibitor der für dieses Verfahren in Frage käme; ein solcher müsste zuerst entwickelt werden. Zweitens würde dieses Verfahren nur funktionieren, wenn die beiden Proteine X und Y vollständig als Komplex in der Zelle vorlägen, so dass jedes an X fusionierte TEV-Molekül auch durch den an Y fusionierten Inhibitor gehemmt würde, denn sonst würde ein Double Switch Signal ausgelöst werden. Dass die exprimierten Proteine X und Y vollständig miteinander interagieren und somit keine Monomere (besonders von X) vorliegen, ist sehr unwahrscheinlich. Insgesamt weisen die vorgeschlagenen Methoden erhebliche Nachteile auf, die die Umsetzung in die Praxis sehr erschweren bzw. unmöglich machen: 1) Neben den interagierenden Proteinen (als Fusion mit TEV Fragmenten) müssen weitere inhibierende und / oder Signal-induzierende Proteine in genau austitrierten Mengen koexprimiert werden (z.B. Rekombinase und deren Inhibitor, Transkriptionsfaktor, etc.) 2) Fast alle beschriebenen- Methoden funktionieren nur unter der Voraussetzung einer stöchiometrischen bzw. vollständigen Komplexbildung zwischen den interagierenden Fusionsproteinen (z.B. Rekombinase-Fusionsprotein und deren Inhibitor, TEV-Fusionsprotein und TEV-Inhibitor- Fusionsprotein, s.o.), da ein monomeres Interaktionsprotein schon das einen Hit anzeigende Signal auslösen würde; es ist unwahrscheinlich, dass die koexprimierten interagierenden Fusionsproteine zu 100% als Komplex vorliegen; das wäre nur bei einer sehr starken Wechselwirkung annähernd der Fall, eine solche Wechselwirkung wäre durch Compounds nur schwer zu stören.In addition to methods for cDNA screening for interaction partners of a protein, the application (“New methods for analyzing protein interactions in vivo”) also describes ideas for finding substances that inhibit protein-protein interactions Illustrated method illustrated in such a way that two interacting proteins X and Y are fused to the intact TEV protease or to a (still to be found) TEV inhibitor. As long as the two proteins X and Y interact, the TEV inhibitor fused to Y arrives in close proximity to the TEV protease fused to X and inhibits it so that a double switch signal cannot be triggered. If an inhibiting substance inhibits the interaction between X and Y, the TEV inhibitor fused to Y can inhibit the TEV fused to X Protease no longer inhibit and a double switch signal is triggered by the now active TEV protease.This method outlined has two disadvantages e who question a success: First, there is no TEV inhibitor that could be used for this procedure; it would have to be developed first. Secondly, this method would only work if the two proteins X and Y were completely in the cell as a complex, so that each TEV molecule fused to X would also be inhibited by the inhibitor fused to Y, otherwise a double switch signal would be triggered , It is very unlikely that the expressed proteins X and Y interact completely with one another and thus there are no monomers (especially of X). Overall, the proposed methods have considerable disadvantages that make their implementation very difficult or impossible: 1) In addition to the interacting proteins (as a fusion with TEV fragments), further inhibiting and / or signal-inducing proteins must be co-expressed in precisely titrated amounts (eg recombinase and its inhibitor, transcription factor, etc.) 2) Almost all of the methods described only work if a stoichiometric or complete complex formation between the interacting fusion proteins (eg recombinase fusion protein and its inhibitor, TEV fusion protein and TEV- Inhibitor fusion protein, see above), since a monomeric interaction protein would already trigger the signal indicating a hit; it is unlikely that the co-expressed interacting Fusion proteins are 100% complex; this would only be approximately the case with a very strong interaction, such an interaction would be difficult to disrupt by compounds.
Eine grundlegender Nachteil, den Yeast-Two-Hybrid- Systeme und das Double Switch System gemeinsam haben, ist, dass aufgrund des transkriptionellen Readouts viele Schritte nötig sind zwischen der Test-Interaktion und der Generierung des selektionierbaren Phänotyps. Jeder dieser Schritte bietet Angriffspunkte für Substanzen, was die Wahrscheinlichkeit für falsch positive Signale erheblich erhöht.A fundamental disadvantage that Yeast Two Hybrid systems and the double switch system have in common is that, due to the transcriptional readout, many steps are required between the test interaction and the generation of the selectable phenotype. Each of these steps provides points of attack for substances, which significantly increases the likelihood of false positive signals.
Ferner wäre es wünschenswert, dass die interagierenden Proteine einer regulierten Expression unterliegen, denn die zu testenden Substanzen müssen vor dem Anschalten der Reportergene zugegeben werden. Möglichkeiten einer regulierten Expression sind in WO02/050259 beschrieben.It would also be desirable for the interacting proteins to be subject to regulated expression, since the substances to be tested must be added before the reporter genes are switched on. Possibilities of regulated expression are described in WO02 / 050259.
Die bisher beschriebenen Methoden zur Analyse oder Detektion der Beeinflussung von Protein-Protein Interaktionen weisen somit mindestens einen oder mehrere der folgenden Nachteile auf:The methods described so far for analyzing or detecting the influencing of protein-protein interactions thus have at least one or more of the following disadvantages:
- Die Interaktionen finden nicht in vivo, oder zumindest nicht in Säugetier-Zellen, statt.- The interactions do not take place in vivo, or at least not in mammalian cells.
- Es werden große Mengen biologischen Materials benötigt.- Large amounts of biological material are required.
- Die Interaktionen müssen dauerhaft sein bzw. die Analyse muß genau zum richtigen Zeitpunkt erfolgen.- The interactions must be permanent or the analysis must be carried out at exactly the right time.
- Die Messung der Interaktion erfordert aufwendige Messungen bzw. Gerätschaften.- The measurement of the interaction requires complex measurements or equipment.
- Die Sensitivität des Nachweises ist sehr beschränkt.- The sensitivity of the detection is very limited.
- Die Analyse endogen sehr schwach exprimierter Gene ist eingeschränkt.- The analysis of endogenously very weakly expressed genes is restricted.
- Es werden nur binäre Interaktionen detektiert.- Only binary interactions are detected.
- Die Rate falsch-positiver oder falsch-negativer Interaktionen ist hoch.- The rate of false positive or false negative interactions is high.
- Die Analyse zelltyp-spezifisch exprimierter Gene ist im komplexen Gewebeverband oder in Zelllinien bei biochemischen Methoden nahezu unmöglich.- The analysis of cell type-specific expressed genes is almost impossible in complex tissue or cell lines with biochemical methods.
- Die Nachweisverfahren sind nur schwer zu automatisieren.- The verification procedures are difficult to automate.
- Es sind zuviele Schritte nötig zwischen der zu testenden Protein-Interaktion und der Generierung des selektionierbaren Phänotyps- Too many steps are required between the protein interaction to be tested and the generation of the selectable phenotype
- Beim Screening nach Substanzen, die Protein-Protein-Interaktionen hemmen, wird ein Hit durch ein abnehmendes bzw. verschwindendes Signal angezeigt - Das Verfahren ist nicht Hochdurchsatz-fähig- When screening for substances that inhibit protein-protein interactions, a hit is indicated by a decreasing or disappearing signal - The process is not capable of high throughput
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Analyse von Proteininteraktionen, bei denen abhängig von einer Proteininteraktion die proteolytische Abspaltung mindestens eines Proteins erfolgt. An Hand einer detektierbaren Eigenschaft können diese freigesetzten Proteine anschließend detektiert und gegebenenfalls quantifiziert werden. Dabei erfolgt die Analyse der Proteininteraktion in vivo, die Detektion und Analyse der freigesetzten Proteine kann aber in vitro erfolgen.The present invention therefore relates to a method for analyzing protein interactions in which, depending on a protein interaction, the proteolytic cleavage takes place at least one protein. Using a detectable property, these released proteins can then be detected and, if necessary, quantified. The protein interaction is analyzed in vivo, but the detection and analysis of the released proteins can be carried out in vitro.
Die räumliche Trennung der Protein-Interaktion vom Ort der Signal-Generierung beim erfindungsgemäßen Verfahren bietet gegenüber einigen Verfahren nach dem Stand der Technik den Vorteil, dass der Hintergrund falsch positiver Signale reduziert ist. Diese Eigenschaften stellen eine deutliche Verbesserung gegenüber den bestehenden Systemen dar. Die Modularität und enorme Flexibilität des System erlaubt es, die Analysen und Experimente sehr fein auf die jeweilige Fragestellung bzw. auf die Stärke der gesuchten Interaktion einzustellen.The spatial separation of the protein interaction from the location of the signal generation in the method according to the invention offers the advantage over some methods according to the prior art that the background of false positive signals is reduced. These properties represent a significant improvement over the existing systems. The modularity and enormous flexibility of the system allows the analyzes and experiments to be fine-tuned to the particular question or the strength of the interaction sought.
Das neue Verfahren überwindet wesentliche Nachteile des Standes der Technik, da es besonders dazu geeignet ist, nach Modulatoren für Protein-Interaktionen zu suchen,The new method overcomes major disadvantages of the prior art, since it is particularly suitable for looking for modulators for protein interactions,
- die von spezifischen Stimuli abhängig sind und nur in vivo stattfinden- which are dependent on specific stimuli and only take place in vivo
- die von den intrinsischen Eigenschaften bestimmter eukaryontischer Zellen abhängig sind- which depend on the intrinsic properties of certain eukaryotic cells
- die von einem bestimmten Zellzustand abhängig sind- which depend on a certain cell state
- die von spezifischen Modifikationen abhängig sind- which depend on specific modifications
- die von einer komplexen Topologie und Umgebung abhängig sind- that depend on a complex topology and environment
- die an die Funktion von Proteinkomplexen gekoppelt sind.- which are linked to the function of protein complexes.
- die in einem positiven Signal resultieren.- which result in a positive signal.
Verschiedene Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens basieren auf die unterschiedliche Generierung der Proteolyse durch die Interaktion verschiedener Fusionsproteine. Diese proteolytische Aktivität kann durcri Transkomplementation von zwei Proteasefragmenten zu einer funktionalen Protease oder durch das Protein-Interaktions- abhängige räumliche Zusammenführen (Proximität) von Enzym und seinem Substrat erfolgen.Different embodiments of the method according to the invention are based on the different generation of proteolysis by the interaction of different fusion proteins. This proteolytic activity can take place by transcomplementing two protease fragments to form a functional protease or by the protein interaction-dependent spatial bringing together (proximity) of the enzyme and its substrate.
Unter Proteasefragmenten sind in diesem Zusammenhang Domänen von Proteasen zu verstehen, welche jeweils für sich keine oder nur geringe Proteaseaktivität aufweisen. Bei Interaktion von zwei unterschiedlichen Proteasefragmenten ergibt sich durch Komplementation eine funktionale Protease. Dabei sind die Fragmente nicht auf Domänen derselben Protease limitiert.In this context, protease fragments are to be understood as domains of proteases which each have no or only little protease activity. When two different protease fragments interact, Complementation of a functional protease. The fragments are not limited to domains of the same protease.
Proteolytische Enzyme, welche besonders geeignet für eine intrazelluläre Verwendung sind, sind die Potyvirus NIa Proteasen, wie insbesondere die 27 kDa NIa Protease des Tobacco Etch Virus (im folgenden als „TEV-Protease" bezeichnet). Die TEV-Protease wird in eukaryontischen Zellen sehr gut toleriert und zeigt im Zytosol spezifische Aktivität (Faber, Kram et al. 2001) (Uhlmann, Wernic et al. 2000). Die TEV-Protease gehört zur C4-Familie der Cystein Proteasen, die Primärstruktur zeichnet sich durch die charakteristische Verteilung der Aminosäuren der katalytischen Triade, Histidin (Position 46), Aspartat (Position 81) und Cystein (Position 151), aus (Ryan and Flint 1997). Über die dreidimensionale Struktur ist hingegen wenig bekannt, eine Sekundärstrukturvorhersage und der Vergleich mit anderen Proteasen, deren 3D-Slxuktur bereits aufgelöst wurde, implizieren jedoch eine große Homologie zu den Trypsin-ähnlichen Serin-Proteasen (Bazan and Fletterick 1988) (Bazan and Fletterick 1989). Deren charakteristisches Strukturmerkmal ist der hohe Anteil von ß- Faltblattdomänen in der Sekundärstrτjktur, die sich zu einer typischen bilobalen Gesamtstruktur falten. Dabei verteilen sich die katalytischen Aminosäuren Histidin und Arginin auf den N-terminalen Lobus und das Serin (bzw. Cystein) liegt auf dem C-terminalen Lobus.Proteolytic enzymes which are particularly suitable for intracellular use are the Potyvirus NIa proteases, such as in particular the 27 kDa NIa protease of the Tobacco Etch Virus (hereinafter referred to as "TEV protease"). The TEV protease becomes very important in eukaryotic cells well tolerated and shows specific activity in the cytosol (Faber, Kram et al. 2001) (Uhlmann, Wernic et al. 2000) The TEV protease belongs to the C4 family of cysteine proteases, the primary structure is characterized by the characteristic distribution of the amino acids the catalytic triad, histidine (position 46), aspartate (position 81) and cysteine (position 151), from (Ryan and Flint 1997) Little is known about the three-dimensional structure, however, a secondary structure prediction and comparison with other proteases, their 3D Structure has already been resolved, however, implies great homology to the trypsin-like serine proteases (Bazan and Fletterick 1988) (Bazan and Fletteric k 1989) whose characteristic structural feature is the high proportion of ß-sheet domains in the secondary structure, which fold into a typical bilobal overall structure. The catalytic amino acids histidine and arginine are distributed over the N-terminal lobe and the serine (or cysteine) lies on the C-terminal lobe.
Diese Verteilung der drei katalytischen Aminosäuren auf die beiden „Hemisphären" der Protease dient als Grundlage für die Transkomplementations- Strategie. Hierbei sind mehrere Varianten denkbar, bei denen das Protein in zwei Fragmente geteilt wird, auf denen sich dann jeweils eine oder zwei der Aminosäuren der Triade finden. Entscheidend für die funktionelle Transkomplementation ist die unabhängige Faltung der Fragmente. Um diese zu gewährleisten, ist es u.U. notwendig, überlappende Fragmente zu generieren und diese auf Aktivität zu testen. Ziel der Transkomplementation ist es, die Fragmente so zu wählen, dass sie für sich gesehen keine Aktivität besitzen und diese Aktivität nur dann wiedererlangen, wenn sie an interagierende Proteine, interagierende Proteindomänen oder andere interagierende Moleküle fusioniert werden.This distribution of the three catalytic amino acids over the two "hemispheres" of the protease serves as the basis for the transcomplementation strategy. Several variants are conceivable in which the protein is divided into two fragments, on which one or two of the amino acids of the Finding the triad The independent folding of the fragments is crucial for the functional transcomplementation. To ensure this, it may be necessary to generate overlapping fragments and test them for activity. The aim of the transcomplementation is to select the fragments in such a way that they have no activity per se and can only regain this activity if they are fused to interacting proteins, interacting protein domains or other interacting molecules.
Aufgrund ihrer großen strukturellen Homologie (Auflistung in (Barrett-AJ, Rawlings-ND et al. 1998)) eignen sich für das Verfahren prinzipiell alle Proteasen. Vorraussetzung ist allerdings, dass ihre Anwesenheit in den entsprechenden Zellen oder Zellkompartimenten toleriert wird. Aufgrund ihrer stringenten Spezifität eignet sich insbesondere auch die Rhinovirus 3C Protease und andere 3C-type Proteasen.Due to their great structural homology (listed in (Barrett-AJ, Rawlings-ND et al. 1998)), all proteases are suitable in principle for the process. The prerequisite is, however, that their presence in the corresponding cells or cell compartments is tolerated. Due to its stringent specificity, the rhinovirus 3C protease and other 3C-type proteases are particularly suitable.
In einer bevorzugten Ausfür-rungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bewirkt zunächst das Auftreten einer spezifischen Protein-Interaktion eine Transkomplementation einer Protease. Die interagierenden Proteine sind Fusionsproteine, die jeweils aus einem Interaktionspartner und einem Proteasefragment bestehen. In einem weiteren Verfahrensschritt wird von der Protease ein Protein mit einer detektierbaren Eigenschaft abgespalten, welches zuvor über eine Protease-Schnittstelle mit einer Domäne verbunden war, die zur Verankerung des Fusionsproteins außerhalb des Zellkern führte.In a preferred embodiment of the method according to the invention, the occurrence of a specific protein interaction first causes a transcomplementation of a Protease. The interacting proteins are fusion proteins, each consisting of an interaction partner and a protease fragment. In a further process step, a protein with a detectable property is split off from the protease, which protein was previously connected via a protease interface to a domain which led to the anchoring of the fusion protein outside the cell nucleus.
Vorzugsweise ist dies eine Domäne, welche zu einer Verankerung an der Zellmembran führt. Darüber hinaus kann die Struktur außerhalb des Zellkerns, die der Verankerung des Fusionsproteins dient, jedoch auch jedes andere von einer Membran umschlossene Zellorganell, mit Ausnahme des Zellkerns sein. Auch bestimmte proteolytisch abspaltbare Protein-Targeting-Domänen, die ein Targeting des Trägerproteins in das Lumen eines bestimmten Zellorganells bewirken, können zur Fixierung des Fusionsproteins außerhalb des Zellkerns dienen. Auch die Fusionsproteine, die die Interaktionspartner enthalten, können in dieser oder weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ebenfalls eine solche Verankerungsdomäne aufweisen.This is preferably a domain which leads to anchoring to the cell membrane. In addition, however, the structure outside the cell nucleus, which serves to anchor the fusion protein, can also be any other cell organelle enclosed by a membrane, with the exception of the cell nucleus. Certain proteolytically cleavable protein targeting domains, which target the carrier protein into the lumen of a particular cell organelle, can also be used to fix the fusion protein outside the cell nucleus. The fusion proteins containing the interaction partners can also have such an anchoring domain in this or further embodiments of the method according to the invention.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können als Protease-Schnittstellen generell alle bekannten spezifischen Protease-Schnittstellen eingesetzt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Man wird jeweils die Protease-Schnittstelle einsetzen, deren zugehörige Protease- Aktivität im Rahmen des Verfahrens erzeugt wird oder durch die verfahrensgemäße Protein- Interaktion in räumliche Nähe (Proximität) zum entsprechenden Substrat gelangt.In the context of the present invention, all known specific protease interfaces which are known to the person skilled in the art can generally be used as protease interfaces. In each case, the protease interface will be used, the associated protease activity of which is generated in the course of the method or is brought into spatial proximity (proximity) to the corresponding substrate by the method-specific protein interaction.
Anwendungsabhängig können die durch die proteolytische Spaltung freigesetzten Proteine beispielsweise folgende sein: ein Antikörper ein Antikörperfragment ein Antigen Streptavidin oder Avidin eine Biotinylierungsdomäne ein Transkriptionsfaktor ein proteolytisch sensitives Enzym ein Enzym, welches in der Zelle kein zelleigenes Substrat vorfindet - FKBPDepending on the application, the proteins released by the proteolytic cleavage can be, for example, the following: an antibody an antibody fragment an antigen streptavidin or avidin a biotinylation domain a transcription factor a proteolytically sensitive enzyme an enzyme that does not find a cell-own substrate in the cell - FKBP
Entsprechende Methoden zur Detektion der freigesetzten Proteine sind dem Fachmann geläufig. Am häufigsten kommen dabei kompetitive Assays zur Anwendung. So kann das abgespaltene Protein durch einen Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay (AlphaScreen, BioSignal Packard) nachgewiesen werden. Bei diesem Assay werden ein Donor- und ein Akzeptor-Kügelchen mit einem Durchmesser von je etwa 250 um durch spezifische Interaktion in räumliche Nähe gebracht. Bei Bestrahlung der Donor-Kügelchen mit 680 nm Licht wird Singulett Sauerstoff generiert, der die Strecke eines Kugeldurchmessers diffundieren kann bevor er zerfallt und somit bei spezifischer Interaktion das Akzeptorkügelchen erreichen kann, wo er Chemilumineszenz auslöst, was zu einem detektierbaren Fluoreszenzsignal führt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das durch proteolytische Spaltung freigesetzte Protein Streptavidin. In diesem Fall wird die Interaktion zwischen den Beads durch Biotin, welches an das Donor-Kügelchen gekoppelt ist und Streptavidin das an das Akzeptor-Kügelchen gebunden ist, bewirkt. Im kompetitiven Assay konkurriert nun das freigesetzte Strepavidin mit dem Akzeptor-Kügelchen um die Bindung an das Donor-Kügelchen und verringert das generierte Fluoreszenzsignal. Bei Hemmung der in vivo zu testenden Protein-Interaktion wird weniger Strepavidin freigesetzt und somit im nachgeschalteten AlphaScreen Assay durch geringere Kompetition ein höheres Fluoreszenzsignal erhalten, so daß das Finden von Screening Hits mit einem positiven Signal korreliertAnstelle von Streptavidin kann auch Avidin verwendet werden. Ebenso kann eine Biotinylierungsdomäne verwendet werden, z.B. von der Transcarboxylase aus Propionibacterium shermanii. diesem Fall wird das Donor-Kügelchen mit Sreptavidin gekoppelt und das Akzeptor-Kügelchen mit Biotin. In gleicher Weise kann ein Antigen oder ein Antikörper bzw. ein Antikö erfragment als proteolytisch abspaltbares Protein verwendet werden. Im ersten Fall ist dann das Donor-Kügelchen mit dem zugehörigen Antikörper bzw. ein Antikörperfragment gekoppelt und das Akzeptor-Kügelchen mit dem Antigen. Im zweiten Fall ist es umgekehrt.Appropriate methods for detecting the released proteins are known to the person skilled in the art. Competitive assays are used most frequently. The cleaved protein can be detected by an Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay (AlphaScreen, BioSignal Packard). In this assay, a donor and an acceptor beads, each about 250 µm in diameter, are run through specific interaction brought into spatial proximity. When the donor spheres are irradiated with 680 nm light, singlet oxygen is generated, which can diffuse the distance of a sphere diameter before it decays and can thus reach the acceptor sphere with specific interaction, where it triggers chemiluminescence, which leads to a detectable fluorescence signal. In a preferred embodiment, the protein released by proteolytic cleavage is streptavidin. In this case, the interaction between the beads is caused by biotin, which is coupled to the donor bead and streptavidin, which is bound to the acceptor bead. In the competitive assay, the released strepavidin competes with the acceptor bead for binding to the donor bead and reduces the generated fluorescence signal. If the protein interaction to be tested in vivo is inhibited, less strepavidin is released and thus a higher fluorescence signal is obtained in the downstream AlphaScreen assay due to less competition, so that the finding of screening hits correlates with a positive signal. Avidin can also be used instead of streptavidin. A biotinylation domain can also be used, for example from the transcarboxylase from Propionibacterium shermanii. in this case the donor bead is coupled with sreptavidin and the acceptor bead with biotin. In the same way, an antigen or an antibody or an antibody fragment can be used as a proteolytically cleavable protein. In the first case, the donor bead is then coupled to the associated antibody or an antibody fragment and the acceptor bead is coupled to the antigen. In the second case it is the other way around.
Weitere geeignete kompetitive Assays sind Scintillation Proximity Assays (SPA, Amersham Biosciences; FlashPlate Plus, DuPont-NEN). SPA basiert darauf, daß relativ schwache beta- Strahler wie 3H beta Teilchen und 125 1 Auger Electronen, in räumlicher Nähe zum Szintillator sein müssen um Licht zu produzieren. Auf diesem Prinzip basieren eine Reihe von homogenen Affinitätsassays. Dabei wird z.B. Streptavidin an Szintillator-Kügelchen gekoppelt bzw. Streptavidin-beschichtete Microszintülationsplatten verwendet. Zugegebenes 3H-Biotin bindet an Streptavidin und gelangt so in räumliche Nähe zum Szintillator um die darin befindlichen fluoresziierenden Substanzen aktivieren zu können. Zugabe von abgespaltenem Streptavidin aus dem Test der in vivo Interaktionen bindet kompetitiv an 3H- Biotin. Zugabe von abgespaltenem Streptavidin aus dem Test der in vivo Interaktionen fangt das 3H-Biotin ab und verringert wie bei dem oben beschriebenen AlphaScreen Assay das Signal. Alternativ kann die freigesetzte Biotin-enthaltende Biotinylierungsdomäne an das an den Szintillator gebundene Streptavidin binden und dabei das 3H-Biotin kompetitiv verdrängen. Alternativ können auch Antikörper, Antikörperfragmente Protein A oder G oder Antigene an die Szintillator-Kügelchen bzw. die Microszintillationsplatten gebunden werden. Die entsprechenden freigesetzten Bindungspartner müssen dann als radioaktive Form vorgelegt werden. Sie werden dann von den freigesetzten Versionen kompetitiv von der Bindung an Szintillatorkügelchen verdrängt. Alternativ können die freigesetzten Bindungspartner als Fusionsprotein mit einem Protein, das Substanzen bindet die radioaktiv erhältlich sind, verwendet werden. So könnte z.B. ein Antigen-Streptavidin Fusionsprotein verwendet werden. Dieses würde kompetitiv zu dem Streptavidin der Szintillator-Kügelchen bzw. der Microszintillationsplatten radioaktives 3H-Biotin binden und so das Signal verringern.Other suitable competitive assays are scintillation proximity assays (SPA, Amersham Biosciences; FlashPlate Plus, DuPont-NEN). SPA is based on the fact that relatively weak beta emitters, such as 3 H beta particles and 125 1 Auger electrons, must be in close proximity to the scintillator in order to produce light. A number of homogeneous affinity assays are based on this principle. For example, streptavidin is coupled to scintillator beads or streptavidin-coated microscintulation plates are used. Added 3 H-biotin binds to streptavidin and thus comes close to the scintillator in order to be able to activate the fluorescent substances contained therein. Addition of cleaved streptavidin from the test of in vivo interactions competitively binds to 3 H-biotin. Addition of cleaved streptavidin from the test of the in vivo interactions intercepts the 3H-biotin and reduces the signal as in the AlphaScreen assay described above. Alternatively, the released biotin-containing biotinylation domain can bind to the streptavidin bound to the scintillator and thereby competitively displace the 3 H-biotin. Alternatively, antibodies, antibody fragments protein A or G or antigens can also be bound to the scintillator beads or the microscintillation plates. The corresponding released binding partners must then be presented as a radioactive form. You will then be competitive by the released versions of the Binding to scintillator beads displaced. Alternatively, the released binding partners can be used as a fusion protein with a protein that binds substances that are available radioactively. For example, an antigen-streptavidin fusion protein could be used. This would bind competitively to the streptavidin of the scintillator beads or the microscintillation plates of radioactive 3 H-biotin and thus reduce the signal.
Weitere Assays zur Detektion der freigesetzten Proteine sind immunologische Affinitätsassays. In einer bevorzugten Ausführungsform, insbesondere beim Screening nach Substanzen, die Protein-Interaktionen hemmen, kommen kompetitive Assay- Verfahren zur Anwendung, so daß ein erfolgreicher Antagonist ein positives Signal ergibt. Dabei konkurrieren das freigesetzte Protein und ein Derivat davon um die Bindungsstellen eines Antikörpers. Markiert wird das Derivat, z.B. mit einem radioaktiven Isotop, einem Chromophor, einem Fluorophor, mit Biotin, mit Edelmetallkolloiden oder Enzymen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, insbesondere beim Screening nach Substanzen, die Protein-Interaktionen induzieren, kommen direkte Assay-, Verfahren zur Anwendung, so daß ein erfolgreicher Agonist ein positives Signal ergibt. In diesem Fall wird das freigesetzte Protein direkt mittels ELIS A durch die Bindung an einen Antikörper bestimmt.Further assays for the detection of the released proteins are immunological affinity assays. In a preferred embodiment, in particular when screening for substances that inhibit protein interactions, competitive assay methods are used so that a successful antagonist gives a positive signal. The released protein and a derivative thereof compete for the binding sites of an antibody. The derivative is marked, e.g. with a radioactive isotope, a chromophore, a fluorophore, with biotin, with precious metal colloids or enzymes. In a further preferred embodiment, in particular when screening for substances which induce protein interactions, direct assay methods are used so that a successful agonist gives a positive signal. In this case, the protein released is determined directly by means of ELIS A by binding to an antibody.
Weiterhin können zur Detektion der freigesetzten Proteine Proteinarrays verwendet werden.Protein arrays can also be used to detect the released proteins.
Desweiteren kann es sich bei den freigesetzten Proteinen um Enzyme handeln, die sich leicht nachweisen lassen aber in der untersuchten Zelle nicht vorkommen. Dies können Hydrolasen wie z.B. Phosphatasen, Glykosidasen und Esterasen oder Oxidasen wie Peroxidasen sein.Furthermore, the released proteins can be enzymes that are easy to detect but do not occur in the cell under investigation. This can be hydrolases such as Phosphatases, glycosidases and esterases or oxidases such as peroxidases.
Bei den oben genannten Ausführungsformen muß das freigesetzte Protein von dem nicht freigesetzten Protein abgetrennt werden. Dies geschieht durch milde Lyse der Zellen, so daß die freigesetzten Proteine im Cytosol aus den Zellen heraustreten können und ein Teil des Zelllysats nach einem nicht zwingenden aber möglichen Zentrifügationssschritt zur in vitro Analyse abpipettiert werden kann, so daß die nicht freigesetzten Proteine nicht solubilisiert werden sondern bei den Zellresten verbleiben.In the above-mentioned embodiments, the released protein must be separated from the unreleased protein. This is done by mild lysis of the cells so that the released proteins in the cytosol can emerge from the cells and a part of the cell lysate can be pipetted off after a non-mandatory but possible centrifuge step for in vitro analysis, so that the unreleased proteins are not solubilized but instead remain with the cell remnants.
Bei weiteren Ausführungsformen ist diese Abtrennung des freigesetzten Proteins nicht nötig. Dies gilt für den Fall, daß das abgespaltene Protein erst nach seiner Abspaltung von einem Bindungspartner, z.B. einem Antikörper erkannt wird, indem z.B. durch die Abspaltung ein Epitop zugänglich wird. In einer weiteren Ausführungsform wird das freigesetzte Protein erst nach seiner Abspaltung posttranslational in der Zelle modifiziert, z.B. myristoyliert, palmityliert oder phosphoryliert und kann dann mit einem für diese Modifikationen spezifischen Antikörper direkt detektiert werden. In einer weiteren Ausführungsform ist das freigesetzte Protein ein Transkriptionsfaktor, der im Kern ein Reportergen anschaltet.In further embodiments, this separation of the released protein is not necessary. This applies in the event that the cleaved protein is only recognized after its cleavage by a binding partner, for example an antibody, for example by making an epitope accessible through the cleavage. In a further embodiment, the released protein is only post-translationally modified in the cell after its cleavage, for example myristoylated, palmitylated or phosphorylated and can then be detected directly with an antibody specific for these modifications. In a further embodiment, the released protein is a transcription factor that switches on a reporter gene in the core.
Das freigesetzte Protein kann prinzipiell in jedem Kompartiment der Zelle und auch außerhalb der Zelle freigesetzt werden.In principle, the released protein can be released in every compartment of the cell and also outside the cell.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die interagierenden Proteine Fusionsproteine, die jeweils aus einem Interaktionspartner, einem Proteasefragment und einem freizusetzenden Protein bestehen. Zunächst bewirkt das Auftreten einer spezifischen Protein-Interaktion der Interaktionspartner eine Transkomplementation der Protease. Da die freizusetzenden Proteine über Proteaseschnittstellen spezifisch für die transkomplementierte Protease an die restlichen Fusionsproteine fusioniert sind, werden diese Proteine in einem weiteren Verfahrensschritt proteolytisch abgespalten. Die abgespaltenen Proteine können gegebenenfalls isoliert werden. Auf Grund einer detektierbaren Eigenschaft können die freigesetzten Proteine detektiert, quantifiziert und analysiert werden.In a further preferred embodiment of the method according to the invention, the interacting proteins are fusion proteins which each consist of an interaction partner, a protease fragment and a protein to be released. First of all, the occurrence of a specific protein interaction of the interaction partners causes a transcomplementation of the protease. Since the proteins to be released are fused to the remaining fusion proteins specifically for the transcomplemented protease via protease interfaces, these proteins are cleaved proteolytically in a further process step. The cleaved proteins can optionally be isolated. Due to a detectable property, the released proteins can be detected, quantified and analyzed.
In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst eins der Fusionsproteine einen ersten Interaktionspartner und ein Proteasefragment und das zweite Fusionsprotein einen zweiten Interaktionspartner, ein zweites Proteasefragment und ein freizusetzendes Protein. Durch die Interaktion des ersten und zweiten Interaktionspartners miteinander kommt es zur Transkomplementation der Protease. Das freizusetzende Protein ist über eine für die transkomplementierte Protease spezifische Proteaseschnittstelle mit dem übrigen Fusionsprotein verbunden und wird in einem weiteren Verfahrensschritt proteolytisch abgespalten. Das so freigesetzte Protein kann (gegebenenfalls isoliert) in weiteren Verfahrensschritten auf Grund einer detektierbaren Eigenschaft identifiziert, quantifiziert und analysiert werden.In another embodiment of the method according to the invention, one of the fusion proteins comprises a first interaction partner and a protease fragment and the second fusion protein comprises a second interaction partner, a second protease fragment and a protein to be released. The interaction of the first and second interaction partners with one another leads to the trans-complementation of the protease. The protein to be released is connected to the rest of the fusion protein via a protease interface specific for the transcomplemented protease and is cleaved proteolytically in a further process step. The protein released in this way (if necessary isolated) can be identified, quantified and analyzed in further process steps on the basis of a detectable property.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht das erste Fusionsprotein aus einem Interaktionspartner und einer funktionalen Protease. Das zweite Fusionsprotein weist neben einem zweiten Interaktionspartner eine Domäne auf, die mit dem Interaktionspartner über eine Proteaseschnittstelle, spezifisch für die Protease des ersten Funktionsproteins, verbunden ist. Diese Domäne besteht aus einem Protein mit einer detektierbaren Eigenschaft. In einem weiteren Verfahrensschritt kommt es zur proteolytischen Abspaltung des Proteins, vermittelt durch die Interaktion der Fusionsproteine. Das so freigesetzte Protein kann (gegebenenfalls isoliert) in weiteren Verfahrensschritten auf Grund seiner detektierbaren Eigenschaft identifiziert, quantifiziert und analysiert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich nicht nur zur reinen Detektion von Protein- Interaktionen, sondern auch zur Näheren Charakterisierung von Protein-Interaktionen. So können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens insbesondere auch solche Substanzen identifiziert werden, die eine definierte Protein-Interaktion in der Zelle inhibieren, bzw. abschwächen oder aktivieren.In a further preferred embodiment of the method according to the invention, the first fusion protein consists of an interaction partner and a functional protease. In addition to a second interaction partner, the second fusion protein has a domain which is connected to the interaction partner via a protease interface, specifically for the protease of the first functional protein. This domain consists of a protein with a detectable property. In a further process step, the protein is cleaved off proteolytically, mediated by the interaction of the fusion proteins. The protein released in this way (if necessary isolated) can be identified, quantified and analyzed in further process steps on the basis of its detectable property. The method according to the invention is suitable not only for the pure detection of protein interactions, but also for the more detailed characterization of protein interactions. Thus, with the aid of the method according to the invention, in particular those substances can be identified which inhibit, weaken or activate a defined protein interaction in the cell.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Screeningverfahren zur Identifizierung oder zur Charakterisierung von Substanzen, die definierte Protein-Protein-Interaktionen in der Zelle beeinflussen können.The invention therefore also relates to a screening method for identifying or characterizing substances which can influence defined protein-protein interactions in the cell.
Wird eine der Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens in einem ersten Versuchsansatz in Abwesenheit und in einem zweiten Versuchsansatz in Anwesenheit einer oder mehrerer Test-Substanzen, die potentiell Inhibitor- oder Aktivator-Eigenschaften bezüglich einer bestimmten Protein-Interaktion haben könnten, durchgeführt; so kann das durch die Menge des freigesetzten Proteins generierte Signal als Intensitätsmaß für die Protein-Interaktion und somit für die Inhibitor- oder Aktivator-Eigenschaften der Test- Substanzen dienen.If one of the embodiments of the method according to the invention is carried out in a first test batch in the absence and in a second test batch in the presence of one or more test substances which could potentially have inhibitor or activator properties with regard to a specific protein interaction; the signal generated by the amount of protein released can serve as an intensity measure for the protein interaction and thus for the inhibitor or activator properties of the test substances.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Nukleinsäure, die für mindestens eines der folgenden Fusionsproteine codiert: ein Fusionsprotein, umfassend einen Interaktionspartner und ein Proteasefragment ein Fusionsprotein, umfassend einen Interaktionspartner und ein Proteasefragment und ein freizusetzendes Protein ein Fusionsprotein, umfassend einen Interaktionspartner und eine funktionale Protease ein Fusionsprotein, umfassend einen Interaktionspartner und ein freizusetzendes Protein ein Fusionsprotein, umfassend ein freizusetzendes Protein und eine Domäne, die zur Verankerung des Fusionsproteins außerhalb des Zellkerns führtThe invention also relates to a nucleic acid which codes for at least one of the following fusion proteins: a fusion protein comprising an interaction partner and a protease fragment a fusion protein comprising an interaction partner and a protease fragment and a protein to be released a fusion protein comprising an interaction partner and a functional protease Fusion protein comprising an interaction partner and a protein to be released a fusion protein comprising a protein to be released and a domain which leads to anchoring of the fusion protein outside the cell nucleus
wobei gegebenenfalls eines der Fusionsproteine eine weitere Domäne besitzt, die zur Verankerung des Fusionsproteins außerhalb des Zellkerns führt.where optionally one of the fusion proteins has a further domain which leads to the anchoring of the fusion protein outside the cell nucleus.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Expressionskasette, die eine der oben genannten Nukleinsäuren unter der Kontrolle eines Promotors umfasst. Der Promotor kann hierbei jeder bekannte Promotor sein, der in der Wirtszelle, in die die Expressionskasette eingebracht werden soll, aktiv ist, d.h. in dieser Wirtszelle die Transkription des nachgeschalteten Fusionskonstruktes aktiviert Der Promotor kann hierbei ein konstitutiver Promotor sein, welcher das nachgeschaltete Fusionkonstrukt ständig exprimiert, oder ein nicht-konstitutiver Promotor, der nur zu definierten Zeitpunkten im Laufe der Entwicklung oder unter bestimmten Umständen exprimiert.Another object of the invention is an expression cassette which comprises one of the above-mentioned nucleic acids under the control of a promoter. The promoter can be any known promoter that is active in the host cell into which the expression cassette is to be inserted, ie that activates the transcription of the downstream fusion construct in this host cell. The promoter can be a constitutive promoter that constantly expresses the downstream fusion construct , or a non-constitutive promoter that only expresses at defined times in the course of development or under certain circumstances.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann gegebenenfalls weitere Kontrollsequenzen enthalten. Unter einer Kontrollsequenz wir eine beliebige Nukleotidsequenz verstanden, die die Expression des Fusionskonstrukts beeinflusst, wie insbesondere der Promotor, eine Operatorsequenz, d.h. die DNA-Bindungsstelle für einen Transkriptionsaktivator oder einen Transkriptionsrepressor, eine Terminator-Sequenz, eine Polyadenylierungssequenz oder eine Ribosomenbindungsstelle.The expression cassette according to the invention can optionally contain further control sequences. A control sequence is understood to mean any nucleotide sequence which influences the expression of the fusion construct, such as in particular the promoter, an operator sequence, i.e. the DNA binding site for a transcription activator or a transcription repressor, a terminator sequence, a polyadenylation sequence or a ribosome binding site.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein rekombinanter Expressionsvektor, der eine der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Expressionskasetten enthält.The present invention also relates to a recombinant expression vector which contains one of the expression cassettes according to the invention described above.
Ein solcher rekombinanter Vektor kann zusätzlich eine Nukleotidsequenz enthalten, durch die der Vektor sich in der betreffenden Wirtszelle replizieren kann. Solche Nukleotidsequenzen werden in der Regel „origin of replication" (deutsch: Replikationsursprung) genannt. Beispiele für solche Nukleotidsequenzen sind der SV40-Replikationsursprung, der in Säugetier- Wirtszellen zum Einsatz kommt, und in Hefe- Wirtszellen die Hefe-Plasmid 2 μ Replikationsgene REP 1-3. ,Such a recombinant vector can additionally contain a nucleotide sequence through which the vector can replicate in the host cell in question. Such nucleotide sequences are generally called “origin of replication”. Examples of such nucleotide sequences are the SV40 origin of replication, which is used in mammalian host cells, and the yeast plasmid 2 μ replication genes REP in yeast host cells 1-3.,
Der rekombinante Vektor kann weiterhin einen oder mehrere Selektionsmarker enthalten. Unter einem Selektionsmarker versteht man ein Gen, welches unter der Kontrolle eines Promotors steht und welches für ein Protein codiert, das einen physiologischen Defekt der Wirtszelle komplementiert. Selektionsmarker stellen insbesondere das Gen codierend für die Dihydrofolat Reduktase (DHFR) dar, oder auch ein Gen, welches die Resistenz gegen Antibiotika, wie insbesondere Ampicillin, Kanamycin, Tetracyclin, Blasticidin, Gentamycin, Chloramphenicol, Neomycin oder Hygromycin bewirkt.The recombinant vector can also contain one or more selection markers. A selection marker is a gene which is under the control of a promoter and which codes for a protein which complements a physiological defect in the host cell. Selection markers represent in particular the gene coding for dihydrofolate reductase (DHFR), or also a gene which brings about resistance to antibiotics, such as, in particular, ampicillin, kanamycin, tetracycline, blasticidin, gentamycin, chloramphenicol, neomycin or hygromycin.
Eine große Anzahl von rekombinanten Vektoren zur Expression eines Zielproteins in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen sind nach dem Stand der Technik bekannt und viele sind auch kommerziell erhältlich.A large number of recombinant vectors for expressing a target protein in prokaryotic or eukaryotic host cells are known in the art and many are also commercially available.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen die Zellen dar, in die die bei den verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen erforderlichen Proteinkomponenten auf DNA-Ebene in Form von Expressionsvektoren heterolog eingebracht wurden.The invention further relates to the cells into which the protein components required in the various embodiments according to the invention have been heterologously introduced at the DNA level in the form of expression vectors.
Alle erforderlichen Protein-Komponenten der erfindungsgemäßen Verfahren können hierbei sowohl durch transiente als auch durch stabile Transfektion oder Infektion in die Test-Zellen eingebracht werden. Das Einbringen in die Test-Zellen kann durch entsprechende Expressionsvektoren sowohl durch sämtliche dem Fachmann bekannten Techniken der Transformation und Transfektion erfolgen, kann jedoch auch alternativ durch die Infektion mit Retroviren oder anderen viral-basierten Verfahren durchgeführt werden.All necessary protein components of the method according to the invention can be introduced into the test cells both by transient and by stable transfection or infection. The introduction into the test cells can be done by appropriate Expression vectors occur both by all transformation and transfection techniques known to the person skilled in the art, but can alternatively also be carried out by infection with retroviruses or other viral-based methods.
Die Zellen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind entweder Hefezellen, Bakterienzellen oder Zellen höherer eukaryontischer Organismen (insbesondere neuronale Zellen und Säuger-Zelllinien [z.B. Embryonale Karzinomazellen, Embryonale Stammzellen, P19-, F9-, PC12-, HEK293-, HeLa-, Cos-, BHK-, CHO-, NT2-, SHSY5Y- Zellen]).The cells used for the methods according to the invention are either yeast cells, bacterial cells or cells of higher eukaryotic organisms (in particular neuronal cells and mammalian cell lines [eg embryonic carcinoma cells, embryonic stem cells, P19, F9, PC12, HEK293, HeLa -, Cos, BHK, CHO, NT2, SHSY5Y cells]).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Kit zur Detektion und zur Analyse von Protein-Interaktionen umfassend mindestens einen der oben beschriebenen Expressionsvektoren. Gegebenenfalls umfasst der Kit auch Zellen, die bereits mit einem der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren transformiert, transfiziert oder infiziert wurden. Der Kit kann auch Zellen enthalten, die sich mit den Expressonsvektoren transformieren, transfizieren oder infizieren lassen, während die Expressionvektoren zusätzlich in Form von Expresionsplasmiden bereitgestellt werden.The invention further relates to a kit for the detection and analysis of protein interactions comprising at least one of the expression vectors described above. The kit may also include cells that have already been transformed, transfected or infected with one of the expression vectors according to the invention. The kit can also contain cells which can be transformed, transfected or infected with the expression vectors, while the expression vectors are additionally provided in the form of expression plasmids.
Der Kit kann weiterhin auch Expressionsvektoren umfassen, die anstelle der oben genannten Nukleinsäurekonstrukte auch modifizierte Varianten dieser Konstrukte enthalten. Diese modifizierten Expressionvektoren codieren nicht für bestimmte Domänen der Fusionsproteine wie die Proteasefragmente, die funktionale Protease, die Interaktionspartner der Protein- Interaktion bzw. das freizusetzende Protein sondern weisen Klonierungsstellen auf, um die jeweiligen Domänen im Leseraster des Fusionsproteins einzuklonieren.The kit can furthermore also comprise expression vectors which also contain modified variants of these constructs instead of the nucleic acid constructs mentioned above. These modified expression vectors do not code for specific domains of the fusion proteins, such as the protease fragments, the functional protease, the interaction partners of the protein interaction or the protein to be released, but instead have cloning sites in order to clone the respective domains in the reading frame of the fusion protein.
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden durch die Zeichnungen näher erläutert:The methods according to the invention are explained in more detail by the drawings:
Zur Verdeutlichung der molekularen Mechanismen sind in den schematischen Zeichnungen die unterschiedlichen Komponenten wie folgt dargestellt:In order to clarify the molecular mechanisms, the different components are shown in the schematic drawings as follows:
Die interagierenden Proteine werden durch runde Zylinder repräsentiert, dabei ist ein Interaktionspartner weiß und der zweite Interaktionspartner schwarz unterlegt. Die beiden Proteasefragmente sind jeweils als schraffierte Halbmonde abgebildet und mit Pl bzw. P2 bezeichnet. Eine aus der Transkomplementation beider Proteasefragmente entstehende funktionale Protease ist analog als zwei schraffierte Halbmonde dargestellt und wird in den Zeichnungen mit P gekennzeichnet. Entsprechende Proteaseschnittstellen sind als gestreifte breite Linie abgebildet und mit PS bezeichnet. Die proteolytisch freizusetzenden bzw. bereits freigesetzten Proteine sind als graue Dreiecke dargestellt. Das große, ovale Kompartiment, in dem die Reaktionen stattfinden, stellt die Zelle dar. Das kleine, grau unterlegte und mit K bezeichnete Kompartiment repräsentiert den Zellkern.The interacting proteins are represented by round cylinders, with one interaction partner highlighted in white and the second interaction partner highlighted in black. The two protease fragments are each shown as hatched half-moons and denoted by P1 and P2. A functional protease resulting from the transcomplementation of both protease fragments is shown analogously as two hatched half-moons and is identified with P in the drawings. Corresponding protease interfaces are depicted as a striped broad line and labeled PS. The proteins to be released or already released by the proteolytic method are shown as gray triangles. The large oval compartment, in The cell represents the reactions. The small compartment, which is highlighted in gray and labeled K, represents the cell nucleus.
Es zeigtIt shows
Fig. 1 ein Ablaufschema eines erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem eine Inhibierung einer Proteininteraktion durch einen kompetetiven Assay detektiert wird.1 shows a flow diagram of a method according to the invention, in which an inhibition of a protein interaction is detected by a competitive assay.
Fig. 2 die schematische Darstellung einer Interaktion von Fusionsproteinen als Schritt eines weiteren erfindungsgemäßen Verfahrens.2 shows the schematic representation of an interaction of fusion proteins as a step of a further method according to the invention.
Fig. 3 die schematische Abbildung einer Interaktion von Fusionproteinen als Teil einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.3 shows the schematic illustration of an interaction of fusion proteins as part of another embodiment of the method according to the invention.
Fig. 4 die schematische Darstellung einer Interaktion von Fusionsproteinen als Verfahrensschritt in einem erfindungsgemäßen Verfahren.4 shows the schematic representation of an interaction of fusion proteins as a process step in a process according to the invention.
Im Detail verdeutlichen die Abbildungen folgende Verfahrensschritte und Ausführungsformen:The figures illustrate the following process steps and embodiments in detail:
Fig. 1 Dargestellt sind zwei Arten von Fusionsproteinen, bei denen das erste Fusionsprotein aus einem Interaktionspartner (schwarzer Zylinder) und einer funktionalen Protease (zwei schraffierte Halbmonde) besteht. Das zweite Fusionsprqtein weist neben dem Interaktionspartner (weißer Zylinder) eine Domäne auf, die mit dem Interaktionspartner über eine Proteaseschnittstelle (PS) verbunden ist. Diese Domäne (graues Dreieck) besteht aus einem Protein mit einer detektierbaren Eigenschaft. Ohne Zugabe eines Inhibitors kommt es zur proteolytischen Abspaltung des Proteins, vermittelt durch die Interaktion der Fusionsproteine (1). In einem zweiten Schritt können die abgespaltenen Proteine isoliert, und darin in einem kompetetiven Assay detektiert werde (2). Die Abbildungen 3 und 4 zeigen die zu 1 und 2 analogen Verfahrensschritte bei vorliegen eines Inhibitors der Proteininteraktion. Die Interaktion der Fusionsproteine wird unterbunden bzw. vermindert, es liegen somit weniger durch Proteolyse freigesetzte Proteine vor. Entsprechend ist das durch den kompetetiven Assay generierte Signal schwächer, als bei dem in den Abbildungen 1 und 2 dargestellten Fall ohne Inhibitor. Fig. 2 Dargestellt sind zwei Arten von Fusionsproteinen, bei denen das erste Fusionsprotein aus einem Interaktionspartner (schwarzer Zylinder) und einem Proteasefragment (schraffierter Halbmond, P2) besteht. Das zweite Fusionsprotein weist neben einem Interaktionspartner (weißer Zylinder) und einem Proteasefragment (schraffierter Halbmond, Pl) eine Domäne auf, die mit dem übrigen Fusionsprotein durch eine Proteaseschnittstelle (PS) verbunden ist. Diese Domäne (graues Dreieck) besteht aus einem Protein mit einer detektierbaren Eigenschaft. In einem der erfindungsgemäßen Verfahren kann nun durch eine Interaktion der beiden Fusionsproteine, und dadurch bedingter Komplementation der Protease, die Proteindomäne abgespalten und in nachfolgenden Verfahrensschritten an Hand ihrer detektierbaren Eigenschaft identifiziert werden.1 shows two types of fusion proteins in which the first fusion protein consists of an interaction partner (black cylinder) and a functional protease (two hatched half-moons). In addition to the interaction partner (white cylinder), the second fusion protein has a domain which is connected to the interaction partner via a protease interface (PS). This domain (gray triangle) consists of a protein with a detectable property. Without the addition of an inhibitor, proteolytic cleavage of the protein occurs, mediated by the interaction of the fusion proteins (1). In a second step, the cleaved proteins can be isolated and detected in a competitive assay (2). Figures 3 and 4 show the process steps analogous to 1 and 2 when an inhibitor of the protein interaction is present. The interaction of the fusion proteins is prevented or reduced, so there are fewer proteins released by proteolysis. Accordingly, the signal generated by the competitive assay is weaker than in the case without inhibitor shown in Figures 1 and 2. 2 shows two types of fusion proteins in which the first fusion protein consists of an interaction partner (black cylinder) and a protease fragment (hatched half moon, P2). In addition to an interaction partner (white cylinder) and a protease fragment (hatched half-moon, PI), the second fusion protein has a domain which is connected to the rest of the fusion protein by a protease interface (PS). This domain (gray triangle) consists of a protein with a detectable property. In one of the methods according to the invention, the interaction of the two fusion proteins, and the resulting complementation of the protease, can now split off the protein domain and identify it in subsequent method steps on the basis of its detectable property.
Fig. 3 Dargestellt sind zwei Arten von Fusionsproteinen. Das erste Fusionsprotein enthält neben einem Interaktionspartner (schwarzer Zylinder) und einem Proteasefragment (schraffierter Halbmond, P2), eine Domäne, die mit dem übrigen Fusionsprotein durch eine Proteaseschnittstelle (PS) verbunden ist. Diese Domäne (graues Dreieck) besteht aus einem Protein mit einer detektierbaren Eigenschaft. Das zweite Fusionsprotein weist neben einem Interaktionspartner (weißer Zylinder) ebenfalls ein Proteasefragment (schraffierter Halbmond, Pl) und eine Domäne wie das erste Fusionsproteine auf. In einem der erfindungsgemäßen Verfahren können nun durch eine Interaktion der beiden Fusionsproteine, und dadurch bedingter Komplementation der Protease, die Proteindomänen abgespalten und in nachfolgenden Verfahrensschritten an Hand ihrer detektierbaren Eigenschaft identifiziert werden.Fig. 3 shows two types of fusion proteins. In addition to an interaction partner (black cylinder) and a protease fragment (hatched half moon, P2), the first fusion protein contains a domain which is connected to the rest of the fusion protein by a protease interface (PS). This domain (gray triangle) consists of a protein with a detectable property. In addition to an interaction partner (white cylinder), the second fusion protein also has a protease fragment (hatched half-moon, PI) and a domain like the first fusion protein. In one of the methods according to the invention, the protein domains can be cleaved by an interaction of the two fusion proteins and the resulting complementation of the protease and identified in subsequent method steps on the basis of their detectable property.
Fig. 4 Dargestellt sind zwei Arten von Fusionsproteinen, bei denen das erste Fusionsprotein aus einem Interaktionspartner (schwarzer Zylinder) und einem Proteasefragment (schraffierter Halbmond, P2) besteht. Das zweite Fusionsprotein weist neben dem Interaktionspartner (weißer Zylinder) ein zweites Proteasefragment (schraffierter Halbmond, Pl) auf. Ein dritte Art von Fusionsprotein besteht aus einem Protein mit einer detektierbaren Eigenschaft (graues Dreieck), welches über eine Proteaseschnittstelle (PS) mit einer Domäne verbunden ist, die das Fusionsprotein in der Zelle verankert. Bei einer Interaktion der beiden ersten Fusionsproteine, und dadurch bedingter Komplementation der Protease, kann das Protein von seiner Verankerung abgespalten und in nachfolgenden Verfahrensschritten an Hand seiner detektierbaren Eigenschaft identifiziert werden. 4 shows two types of fusion proteins in which the first fusion protein consists of an interaction partner (black cylinder) and a protease fragment (hatched half moon, P2). In addition to the interaction partner (white cylinder), the second fusion protein has a second protease fragment (hatched half moon, Pl). A third type of fusion protein consists of a protein with a detectable property (gray triangle), which is connected via a protease interface (PS) to a domain that anchors the fusion protein in the cell. When the first two fusion proteins interact and the protease is complemented as a result, the protein can be removed from its anchoring and identified in subsequent process steps on the basis of its detectable property.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Detektion und quantitativen und/oder qualitativen Analyse von Protein-Protein-Interaktionen, umfassend die Verfahrensschritte a) proteolytische Freisetzung mindestens eines Proteins mit mindestens einer detektierbaren Eigenschaft aus einer Protein-Protein-Interaktion b) Detektion und gegebenenfalls Quantifizierung des mindestens einen freigesetzten Proteins an Hand seiner detektierbaren Eigenschaften.1. A method for the detection and quantitative and / or qualitative analysis of protein-protein interactions, comprising the method steps a) proteolytic release of at least one protein with at least one detectable property from a protein-protein interaction b) detection and optionally quantification of the at least one released protein based on its detectable properties.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Verfahrensschritt a) in vivo und Verfahrensschritt b) in vivo oder in vitro durchgeführt werden.2. The method according to claim 1, characterized in that process step a) in vivo and process step b) are carried out in vivo or in vitro.
3. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die proteolytische Freisetzung des mindestens einen Proteins durch a) die Expression eines ersten Fusionsproteins, umfassend einen ersten Interaktionspartner und ein Proteasefragment, und b) die Expression eines zweiten Fusionsproteins, umfassend einen zweiten Interaktionspartner und ein zweites Proteasefragment, und c) die Transkomplementation einer funktionalen Protease durch die Interaktion des ersten und des zweiten Interaktionspartners miteinander, und d) die Expression eines dritten Fusionsproteins, umfassend ein freizusetzendes Protein und eine Domäne, die zur Verankerung des Fusionsproteins außerhalb des Zellkerns führt, und e) die proteolytische Abspaltung des freizusetzenden Proteins durch die komplementierte Protease erfolgt, wobei gegebenenfalls mindestens eines der beiden ersten Fusionsproteine eine weitere Domäne besitzt, die zur Verankerung des Fusionsproteins außerhalb des Zellkerns führt.3. The method according to claims 1 or 2, characterized in that the proteolytic release of the at least one protein by a) the expression of a first fusion protein comprising a first interaction partner and a protease fragment, and b) the expression of a second fusion protein comprising a second interaction partner and a second protease fragment, and c) the transcomplementation of a functional protease by the interaction of the first and second interaction partners with one another, and d) the expression of a third fusion protein comprising a protein to be released and a domain which leads to the anchoring of the fusion protein outside the cell nucleus , and e) the proteolytic cleavage of the protein to be released is carried out by the complemented protease, at least one of the first two fusion proteins optionally having a further domain which leads to the anchoring of the fusion protein outside the cell nucleus.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die proteolytische Freisetzung des Proteins durch a) die Expression eines ersten Fusionsproteins, umfassend einen ersten Interaktionspartner und eine funktionale Protease, und b) die Expression eines zweiten Fusionsproteins, umfassend einen zweiten Interaktionspartner und ein freizusetzendes Protein, und c) die proteolytische Abspaltung des freizusetzenden Proteins durch die funktionale Protease erfolgt, wobei gegebenenfalls mindestens eines der beiden Fusionsproteine eine weitere Domäne besitzt, die zur Verankerung des Fusionsproteins außerhalb des Zellkerns führt.4. The method according to claims 1 to 2, characterized in that the proteolytic release of the protein by a) the expression of a first fusion protein comprising a first interaction partner and a functional protease, and b) the expression of a second fusion protein comprising a second interaction partner and a protein to be released, and c) the proteolytic cleavage of the protein to be released by the functional protease takes place, with at least one of the two fusion proteins optionally having a further domain which leads to the anchoring of the fusion protein outside the cell nucleus.
5. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die proteolytische Freisetzung des Proteins durch a) die Expression eines ersten Fusionsproteins, umfassend einen ersten Interaktionspartner und ein Proteasefragment, und b) die Expression eines zweiten Fusionsproteins, umfassend einen zweiten Interaktionspartner und ein zweites Proteasefragment und ein freizusetzendes Protein, und c) die Transkomplementation einer funktionalen Protease durch die Interaktion des ersten und des zweiten Interaktionspartners miteinander, und d) die proteolytische Abspaltung des freizusetzenden Proteins durch die komplementierte Protease erfolgt, wobei gegebenenfalls mindestens eines der beiden ersten Fusionsproteine eine weitere Domäne besitzt, die zur Verankerung des Fusionsproteins außerhalb des Zellkerns führt.5. The method according to claims 1 or 2, characterized in that the proteolytic release of the protein by a) expression of a first fusion protein comprising a first interaction partner and a protease fragment, and b) expression of a second fusion protein comprising a second interaction partner and second protease fragment and a protein to be released, and c) the transcomplementation of a functional protease by the interaction of the first and the second interaction partner with one another, and d) the proteolytic cleavage of the protein to be released is carried out by the complemented protease, optionally at least one of the first two fusion proteins has another domain that leads to the anchoring of the fusion protein outside the cell nucleus.
6. Verfahren nach Ansprüchen , 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die proteolytische Freisetzung des Moleküls durch a) die Expression eines ersten Fusionsproteins, umfassend einen ersten Interaktionspartner und ein Proteasefragment und ein erstes freizusetzendes Protein, und b) die Expression eines zweiten Fusionsproteins, umfassend einen zweiten Interaktionspartner und ein zweites Proteasefragment und ein zweites freizusetzendes Protein, und c) die Transkomplementation einer funktionalen Protease durch die Interaktion des ersten und des zweiten Interaktionspartners miteinander, und d) die proteolytische Abspaltung der freizusetzenden Proteine durch die komplementierte Protease erfolgt, wobei gegebenenfalls mindestens eines der beiden Fusionsproteine eine weitere Domäne besitzt, die zur Verankerung des Fusionsproteins außerhalb des Zellkerns führt. 6. A method according to claims 1 or 2, characterized in that the proteolytic release of the molecule by a) expressing a first fusion protein comprising a first interaction partner and a protease fragment and a first freizusetzendes protein, and b) the expression of a second fusion protein, comprising a second interaction partner and a second protease fragment and a second protein to be released, and c) the transcomplementation of a functional protease by the interaction of the first and the second interaction partner with one another, and d) the proteolytic cleavage of the proteins to be released by the complemented protease, optionally taking place at least one of the two fusion proteins has a further domain which leads to the anchoring of the fusion protein outside the cell nucleus.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich als Verfahrenschritt die Abtrennung des freigesetzten Proteine von den nicht freigesetzten Proteinen vor der Detektion und gegebenenfalls der Quantifizierung und/oder Qualifizierung der freigesetzten Proteine durchgeführt wird.7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that in addition as a process step, the separation of the released proteins from the unreleased proteins is carried out before the detection and, if appropriate, the quantification and / or qualification of the released proteins.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion und gegebenenfalls Quantifizierung und/oder Qualifizierung der freigesetzten Proteine durch einen kompetetiven Assay erfolgt.8. The method according to claim 7, characterized in that the detection and optionally quantification and / or qualification of the released proteins is carried out by a competitive assay.
9. Screeningverfahren zur Identifizierung einer Substanz die eine Protein-Interaktion beeinflusst, insbesondere inhibiert oder aktiviert, unter Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8.9. Screening method for identifying a substance which influences a protein interaction, in particular inhibits or activates, by performing the method according to one of claims 1 to 8.
10. Screeningverfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Protein- Interaktionen beeinflussende Substanz durch die zusätzlichen Schritte a) in Kontakt bringen der Fusionsproteine mit der Substanz b) Vergleich des generierten Signals dieser Probe mit einer Probe, die nicht mit der Substanz in Kontakt gebracht wurde. identifiziert wird.10. Screening method according to claim 9, characterized in that a substance influencing protein interactions by the additional steps a) bringing the fusion proteins into contact with the substance b) comparing the generated signal of this sample with a sample that is not in contact with the substance was brought. is identified.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Protease um die Tev Protease handelt.11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the protease is the Tev protease.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem freigesetzten Molekül um Streptavidin handelt.12. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that it is streptavidin in the released molecule.
13. Nukleinsäure, die für ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert.13. Nucleic acid coding for a fusion protein according to one of claims 1 to 6.
14. Expressionskassette, die eine Nukleinsäure für ein Fusionsprotein nach Anspruch 13 unter der Kontrolle eines Promoters umfasst.14. Expression cassette comprising a nucleic acid for a fusion protein according to claim 13 under the control of a promoter.
15. Rekombinanter Expressions vektor, umfassend eine Expressionskassette nach Anspruch 14.15. Recombinant expression vector, comprising an expression cassette according to claim 14.
16. Zelle, die mit mindestens einem Expressions vektor nach Ansprüche 15 stabil oder transient transformiert, transfiziert oder infiziert wurde. 16. A cell which has been transformed or transiently or transiently transformed or infected with at least one expression vector according to claims 15.
17. Zelle nach Ansprüche 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Zelle ausgewählt aus der Gruppe Bakterienzelle, Hefezelle oder Zellen höherer Eukaryonten, insbesondere um neuronale Zellen oder Säugerzelllinien, handelt.17. Cell according to claim 16, characterized in that it is a cell selected from the group of bacterial cells, yeast cells or cells of higher eukaryotes, in particular neuronal cells or mammalian cell lines.
18. Kit zur Detektion und Analyse von Protein-Interaktionen umfassend mindestens einen Expressionsvektor nach Anspruch 15.18. Kit for the detection and analysis of protein interactions comprising at least one expression vector according to claim 15.
19. Kit nach Ansprüche 18, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich Zellen auswählt aus der Gruppe Bakterienzelle, Hefezelle oder Zellen höherer Eukaryonten, insbesondere neuronale Zellen oder Säugerzellinien, bereitgestellt werden, die sich mit den in Anspruch 15 definierten Expressionsvektoren ttansformieren, transfizieren oder infizieren lassen.19. Kit according to claim 18, characterized in that cells are additionally selected from the group of bacterial cells, yeast cells or cells of higher eukaryotes, in particular neuronal cells or mammalian cell lines, which can be transformed, transfected or infected with the expression vectors defined in claim 15.
20. Kit nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die zusätzlich bereitgestellten Zellen mit mindestens einem der in Anspruch 15 definierten Expressionsvektoren transformiert, transfiziert oder infiziert sind, und dass lediglich die in Anspruch 15 definierten Expressionsvektoren, mit denen die Zellen nicht transformiert, transfiziert oder infiziert sind, zusätzlich in Form von Expressionsplasmiden bereitgestellt werden.20. Kit according to claim 19, characterized in that the additionally provided cells are transformed, transfected or infected with at least one of the expression vectors defined in claim 15, and that only the expression vectors defined in claim 15 with which the cells are not transformed, transfected or infected, are also provided in the form of expression plasmids.
21. Kit nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionsvektoren nicht für einen Interaktionspartner codieren, aber dafür eine Klonierungsstelle enthalten, die sich zur Einklonierung einer für einen Interaktionspartner codierenden Sequenz im Leseraster des Proteins eignet.21. Kit according to one of claims 18 to 20, characterized in that the expression vectors do not code for an interaction partner, but instead contain a cloning site which is suitable for cloning a sequence coding for an interaction partner in the reading frame of the protein.
22. Kit nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionsvektoren nicht für ein Proteasefragment oder eine funktionale Protease codieren, aber dafür eine Klonierungsstelle enthalten, die sich zur Einklonierung einer für ein Proteasefragment oder eine funktionale Protease codierenden Sequenz im Leseraster des Proteins eignet.22. Kit according to one of claims 18 to 20, characterized in that the expression vectors do not code for a protease fragment or a functional protease, but instead contain a cloning site which is for cloning a sequence coding for a protease fragment or a functional protease in the reading frame of the Protein.
23. Kit nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionsvektoren nicht für ein freizusetzendes Protein codieren, aber dafür eine Klonierungsstelle enthalten, die sich zur Einklonierung einer für ein freizusetzendes Protein codierenden Sequenz im Leseraster des Proteins eignet. 23. Kit according to one of claims 18 to 20, characterized in that the expression vectors do not code for a protein to be released, but instead contain a cloning site which is suitable for cloning in the reading frame of the protein a sequence coding for a protein to be released.
PCT/EP2004/010391 2003-09-17 2004-09-16 Method for the detection and analysis of protein-protein interactions WO2005033706A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2003143375 DE10343375A1 (en) 2003-09-17 2003-09-17 Method for the detection and analysis of protein-protein interactions
DE10343375.9 2003-09-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005033706A1 true WO2005033706A1 (en) 2005-04-14

Family

ID=34398805

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2004/010391 WO2005033706A1 (en) 2003-09-17 2004-09-16 Method for the detection and analysis of protein-protein interactions

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE10343375A1 (en)
WO (1) WO2005033706A1 (en)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8027030B2 (en) 2007-06-15 2011-09-27 Historx, Inc. Method and system for standardizing microscope instruments
US8417015B2 (en) 2007-08-06 2013-04-09 Historx, Inc. Methods and system for validating sample images for quantitative immunoassays
US8655037B2 (en) 2007-05-14 2014-02-18 Historx, Inc. Compartment segregation by pixel characterization using image data clustering
US9240043B2 (en) 2008-09-16 2016-01-19 Novartis Ag Reproducible quantification of biomarker expression

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102014203266B4 (en) 2014-02-24 2018-07-19 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Composition with FRET pair in defined geometry
DE102015006187B4 (en) * 2015-05-15 2018-12-13 Eberhard Karls Universität Tübingen Cloning system and method for the identification of interaction partners in protein complexes

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5468614A (en) * 1990-01-24 1995-11-21 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
US5585245A (en) * 1994-04-22 1996-12-17 California Institute Of Technology Ubiquitin-based split protein sensor
WO2000001831A2 (en) * 1998-07-07 2000-01-13 The Procter & Gamble Company Proteases fused with variants of streptomyces subtilisin inhibitor
US6333154B1 (en) * 1997-12-04 2001-12-25 Institut Pasteur Bacterial multi-hybrid system and applications thereof
US20020081570A1 (en) * 2000-04-18 2002-06-27 Jack Lilien System to detect protein-protein interactions
US20020146701A1 (en) * 2000-05-12 2002-10-10 Hamilton Andrew D. Methods of detecting interactions between proteins, peptides or libraries thereof using fusion proteins
EP1319954A1 (en) * 2001-12-12 2003-06-18 Centre National de Genotypage Methods for protein analysis using protein capture arrays
WO2003076932A2 (en) * 2002-03-13 2003-09-18 Axaron Bioscience Ag Novel method for detecting and analyzing protein interactions in vivo

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5468614A (en) * 1990-01-24 1995-11-21 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
US5585245A (en) * 1994-04-22 1996-12-17 California Institute Of Technology Ubiquitin-based split protein sensor
US6333154B1 (en) * 1997-12-04 2001-12-25 Institut Pasteur Bacterial multi-hybrid system and applications thereof
WO2000001831A2 (en) * 1998-07-07 2000-01-13 The Procter & Gamble Company Proteases fused with variants of streptomyces subtilisin inhibitor
US20020081570A1 (en) * 2000-04-18 2002-06-27 Jack Lilien System to detect protein-protein interactions
US20020146701A1 (en) * 2000-05-12 2002-10-10 Hamilton Andrew D. Methods of detecting interactions between proteins, peptides or libraries thereof using fusion proteins
EP1319954A1 (en) * 2001-12-12 2003-06-18 Centre National de Genotypage Methods for protein analysis using protein capture arrays
WO2003076932A2 (en) * 2002-03-13 2003-09-18 Axaron Bioscience Ag Novel method for detecting and analyzing protein interactions in vivo

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1995, JOHN WILEY & SONS, INC., USA, XP002308806 *
JOHNSSON N ET AL: "SPLIT UBIQUITIN AS A SENSOR OF PROTEIN INTERACTIONS INV VIVO", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 91, 1 October 1994 (1994-10-01), pages 10340 - 10344, XP002064564, ISSN: 0027-8424 *
KOLDAMOVA RADOSVETA P ET AL: "An evolutionarily conserved cysteine protease, human bleomycin hydrolase, binds to the human homologue of ubiquitin-conjugating enzyme 9", MOLECULAR PHARMACOLOGY, vol. 54, no. 6, December 1998 (1998-12-01), pages 954 - 961, XP002307186, ISSN: 0026-895X *
RIGAUT G ET AL: "A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration", NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING, US, vol. 17, no. 10, October 1999 (1999-10-01), pages 1030 - 1032, XP002179540, ISSN: 1087-0156 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8655037B2 (en) 2007-05-14 2014-02-18 Historx, Inc. Compartment segregation by pixel characterization using image data clustering
US8027030B2 (en) 2007-06-15 2011-09-27 Historx, Inc. Method and system for standardizing microscope instruments
US8120768B2 (en) 2007-06-15 2012-02-21 Historx, Inc. Method and system for standardizing microscope instruments
US8417015B2 (en) 2007-08-06 2013-04-09 Historx, Inc. Methods and system for validating sample images for quantitative immunoassays
US9240043B2 (en) 2008-09-16 2016-01-19 Novartis Ag Reproducible quantification of biomarker expression

Also Published As

Publication number Publication date
DE10343375A1 (en) 2005-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1483576B1 (en) Novel method for detecting and analyzing protein interactions in vivo
Kim et al. Time-gated detection of protein-protein interactions with transcriptional readout
EP0907750B1 (en) Three-hybrid screening assay
DE69928255T2 (en) BIOLUMINESCENT RESONANCE ENERGY TRANSFER SYSTEM (BRET) AND ITS APPLICATION
US7062219B2 (en) Protein fragment complementation assays for high-throughput and high-content screening
EP2400030B1 (en) Detection of protein translocation by beta-galactosidase reporter fragment complementation
US20100112602A1 (en) Protein-Protein Interaction Biosensors and Methods of Use Thereof
DE60033551T2 (en) PROBE FOR ANALYZING PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS AND CORRESPONDING METHOD THEREFOR
WO2002068698A2 (en) Use of nucleic acid libraries to create toxicological profiles
EP1360501A2 (en) Method of identifying conformation-sensitive binding peptides and uses thereof
US11325952B2 (en) Light-gated signaling modulation
WO2000017221A9 (en) Method of measuring protein-protein interactions in living cells
US20040229240A1 (en) In vivo screening of protein-protein interactions with protein-fragment complementation assays
JP2015156859A (en) Fluorescent two-hybrid (f2h) assay for direct visualization of protein interactions in living cells
WO2005033706A1 (en) Method for the detection and analysis of protein-protein interactions
US20090123954A1 (en) Multicolor bioluminescent visualization probe set, or single-molecule-format multicolor bioluminescent visualization probe
JP2008504820A (en) Analysis of intracellular modifications
KR101190157B1 (en) A visualizing method for monitoring intracellular protein-protein interaction using Rab5
Wintgens et al. Characterizing dynamic protein–protein interactions using the genetically encoded split biosensor assay technique split TEV
DE60125783T2 (en) METHOD FOR DETECTING ACETYLASE OR DEACETYLASE ACTIVITY IN AN IMMUNOASSAY
EP0983377B1 (en) Method for detecting environmental pollution using 14-3-3 proteins as biomarkers
KR102018249B1 (en) A probe for analyzing the protease activity and detection method of protease using the same
EP1141716B1 (en) Method for the cellular high-throughput-detection of receptor ligand interactions
KR102597698B1 (en) A method for analysis of protein-protein interaction in cell based on p-body
DE10318048A1 (en) Non-fluorescent reporter proteins that can be activated by proteolysis for fluorescence and their use for the detection of protease-dependent events

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase