WO2005092910A1 - Réactifs de marquage, procédés de synthèse de tels réactifs et procédés de détection de molécules biologiques - Google Patents

Réactifs de marquage, procédés de synthèse de tels réactifs et procédés de détection de molécules biologiques Download PDF

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WO2005092910A1
WO2005092910A1 PCT/FR2005/050192 FR2005050192W WO2005092910A1 WO 2005092910 A1 WO2005092910 A1 WO 2005092910A1 FR 2005050192 W FR2005050192 W FR 2005050192W WO 2005092910 A1 WO2005092910 A1 WO 2005092910A1
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hedge
alkyl
labeling
arm
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PCT/FR2005/050192
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Ali Laayoun
Eloy Bernal-Mendez
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Biomerieux
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
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    • Y10T436/13—Tracers or tags
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    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to new reagents for labeling biological molecules, a method for synthesizing said markers as well as applications for labeling biological molecules, in particular in the field of diagnostics using nucleic acid analysis.
  • a first method consists in fixing the marker on the base, whether the latter is natural or modified.
  • a second method proposes to fix the marker on the sugar, again whether it is natural or modified.
  • a third method relates to the attachment of the marker to the phosphate. Labeling on the base has been used in particular in the approach of labeling nucleic acids by incorporating directly labeled nucleotides. The labeling on sugar is often used in the case of nucleic acid probes prepared by chemical synthesis. Labeling on phosphate has also been used to introduce functionalized arms and markers during the chemical synthesis of oligonucleotides.
  • the fixing of the marker on the phosphate is a more complex technique than the technique consisting in functionalizing the base or the sugar and has been much less used in particular because of the low reactivity of the phosphate (see for example Jenc s WP et al J. Amer Chem Soc, 82, 1778- 1785, 1960).
  • O'Donnel and Me Laughlin Reporter groups for the analysis of nucleic acid structure”, p 216-243, in “Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids”, Ed Hecht SM, Oxford University Press, 1996) bearing on the methods of introducing probes into oligonucleotide fitments, effective ylation of the intemucleotide phosphodiester is considered to be impossible.
  • Patent application WO-A-99/65926 describes a method for labeling a synthetic or natural ribonucleic acid (RNA) which consists in fragmenting the RNA and in labeling at the terminal phosphate.
  • RNA synthetic or natural ribonucleic acid
  • This document describes a certain number of functions which can be used for labeling in connection with the fragmentation such as the hydroxyl, amine, hydrazine, alkoxyamine, alkyl halide, alkyl halide of benzyl type and in particular the derivative 5- ( bromomethyl) fl.uorescéine.
  • These functions make it possible to label the nucleic acids, but a fragmentation step must be associated in order to have effective labeling because this labeling occurs on the phosphate released during the fragmentation.
  • this method does not work effectively on double strand
  • the reagents incorporating at least one diazo function in general are unstable by themselves, which poses problems for the use of these reagents in a labeling Mt, which is prohibitive if the labeled product has the function of demonstrating the presence of a biological target molecule in a any sample.
  • the reagents carrying the diazomethyl function and associated with certain markers, such as biotin are not very soluble in water, which leads to the use of organic solvents which are water-missible for coupling with biological molecules, which are only soluble in water or aqueous buffers, but these solvents, present in high concentration in the labeling reaction, slow down the reaction rate and therefore affect the efficiency of the coupling.
  • the invention consists in the use of polyamine arms which, like the ethylene glycol arms, allow the biotin to be moved away from the reactive center (diazo function).
  • polyamine arms which, like the ethylene glycol arms, allow the biotin to be moved away from the reactive center (diazo function).
  • these new molecules allow the implementation of processes that can operate in acidic medium, which is particularly interesting for molecules incorporating diazo functions.
  • selectivity of the reagents carrying a diazo function is therefore greater in an acid medium.
  • the solubility provided to the polyamide chains therefore facilitates washing while reducing the background noise during subsequent detection, or even outright elimination of the purification step.
  • the latter provides a labeling reagent stable at the temperature of formula (0):
  • R 1 represents H or an alkyl, aryl or substituted aryl group
  • R 2 represents a detectable marker or at least two detectable markers linked together by at least one multimeric structure
  • L is a link arm comprising a linear chain of at least two covalent bonds and n an integer equal to 0 or 1
  • A is a link arm comprising at least one covalent double bond allowing the conjugation of the diazo function with the aromatic ring and u is an integer between 0 and 2, preferably 0 or 1, • -YX- represents -CONH-, -NHCO-, -CH 2 O-, -CH 2 S-,
  • m is an integer between 1 and 10, preferably between 1 and 3, and
  • p is an integer between 1 and 10, preferably between 1 and 3. According to a second embodiment of the invention, it relates to a labeling reagent, according to claim 1, of formula (1):
  • R 1 represents H or an alkyl, aryl or substituted aryl group
  • R 2 represents a detectable marker or at least two detectable markers rehes together with at least one multimeric structure
  • L is a hedge arm comprising a linear sequence of at least two covalent bonds and n an integer equal to 0 or 1,
  • -YX- represents -CONH-, -NHCO-, -CH 2 O-, -CH 2 S-,
  • m is an integer between 1 and 10, preferably between 1 and 3, and
  • the present invention provides a reagent, according to any one of claims 1 to 4, of formula (2): in which :
  • R 1 represents H or an alkyl, aryl or substituted aryl group
  • R 2 represents a detectable marker or at least two detectable markers rehesed together by at least one multimeric structure
  • L is a hedge arm comprising a linear sequence of at least two covalent hedges and n an integer equal to 0 or 1,
  • the present invention describes a reagent, according to any one of claims 1 to 4, of formula (3):
  • R 1 represents H or a substituted alkyl, aryl or aiyl group
  • R 2 represents a detectable marker or at least two detectable markers rehesed together by at least one multimeric structure
  • L is a hedge arm comprising a linear sequence of at least two covalent hedges and n an integer equal to 0 or 1, and
  • R 2 is constituted by a D-Biotin residue of formula (4):
  • R 1 is constituted by: CH 3 , and R 3 and R 4 each represent: H
  • the structure - (L) n - consists of:
  • R 1 represents H or an alkyl, aryl or substituted aryl group
  • R 2 represents a detectable marker or at least two detectable markers rehesed together by at least one multimeric structure
  • A is a hedge arm comprising at least one double covalent hedge allowing the conjugation of the diazo function with the aromatic cycle and u is an integer between 0 and 2, preferably 0 or 1,
  • -YX- represents -CONH-, -NHCO-, -CH 2 O-, -CH 2 S-,
  • the invention provides a reagent stable marking at the temperature of formula (7):
  • R 1 represents H or an alkyl, aryl or substituted aryl group
  • R 2 represents a detectable marker or at least two detectable markers rehesed together by at least one multimeric structure
  • L is a hedge arm comprising a linear chain of at least two covalent hedges and n an integer equal to 0 or 1
  • -YX- represents -CONH-, -NHCO-, -CH 2 O-, -CH 2 S-,
  • • -Z- represents -NH-, -NHCO-, -CONH- or -O-, • m is an integer between hehe 1 and 10, preferably between 1 and 3, and
  • L comprises a motif - (O-CH 2 -CH 2 ) -, repeated from 1 to 20 times, preferably from 1 to 10 times, and even more preferably from 2 to 5 times, -Z- then being represented by -NH-, -NHCO- or -CONH-.
  • the invention also relates to a process for the synthesis of a labeling reagent, according to the preceding embodiments, comprising the following steps: a) a marker or a marker precursor having a reactive function R 6 is available , b) there is a hedge arm of formula (8): R * - (Z— (CH- j -) ⁇ - R. in which:
  • • m is an integer between 1 and 10, preferably between 1 and 3
  • • p is an integer between 1 and 10, preferably between 1 and 3
  • R 7 and R 8 represent two identical or different reactive functions, c) reacting together the reactive function R 6 of said marker or marker precursor with the function R 7 of the hedge arm of formula (8) in the presence of at at least one coupling agent to form a covalent hedge, R 6 and R 7 being complementary, d) a derivative of formula (9) is available:
  • R 1 represents H or an alkyl or aryl or substituted aryl group
  • L is a hedge arm comprising a linear sequence of at least two covalent hedges and n an integer equal to 0 or 1
  • A is a hedge arm comprising at least one double covalent hedge allowing the conjugation of the diazomethyl function with the aromatic cycle and u is an integer equal to 0 or 1, and • R 9 represents a complementary reactive function of R 8 , e) reactive function F is reacted together? of the derivative of formula (9) with the function R 8 of the hedge arm of formula (8) in the presence of at least one coupling agent to form a covalent hedge, f) reacting the hydrazine or one of its derivatives on the ketone or aldehyde function to form a hydrazone, and g) the hydrazone is transformed into a diazomethyl function using an appropriate treatment.
  • the synthesis process can also include:
  • the invention also relates to a method for labeling a biological molecule, in particular a nucleic acid, comprising bringing into contact in homogeneous solution, in a substantially aqueous buffer, a biological molecule and a reagent, according to the rehsation modes previously mentioned.
  • the invention also relates to a labeled biological molecule capable of being obtained by the method, according to the labeling claim above.
  • the labeling and fragmentation process is carried out using a labeling reagent which is chosen from the compounds of formula (3):
  • R 1 represents H or an alkyl, aryl or substituted aryl group
  • R 2 represents a detectable marker or at least two detectable markers rehes together with at least one multimeric structure
  • L is a hedge arm comprising a linear sequence of at least two covalent hedges and n an integer equal to 0 or 1, and
  • the fragmentation and the marking are carried out in two stages.
  • the fragmentation and marking are carried out in one step.
  • the marking is carried out in a substantially aqueous homogeneous solution.
  • fragmentation takes place by enzymatic, physical or chemical route.
  • the present invention also relates to any labeled nucleic acid capable of being obtained by the preceding labeling and fragmentation process.
  • the present invention also relates to a t for detecting a target nucleic acid comprising a labeled nucleic acid, as defined above.
  • the present invention always relates to a solid support on which is fixed at least one reagent, as defined above.
  • the present invention finally relates to a method for capturing nucleic acids comprising the following steps: • there is a solid support on which is directly or indirectly attached at least one biological molecule, defined previously or a nucleic acid, also defined previously biological molecule or nucleic acid comprising a diazomethyl function, • a biological sample capable of containing hbre nucleic acids is brought into contact, and • the solid support where the molecule (s) are (are) fixed covalently to at least one nucleic acid.
  • multimeric structure is meant a polymer formed from repeated units of chemical or biological synthons.
  • An example is cited in example 34.2 of the description of patent application WO-A-02/090319. Those skilled in the art are invited to refer to this document if it finds the information developed below insufficient for their complete understanding on this subject. Many variants of such structures which can be used in the present invention are known, such as for example:
  • detectable marker at least one marker capable of directly or indirectly generating a detectable signal. A non-exhaustive list of these markers follows:
  • the enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase,
  • chromophores such as fluorescent, luminescent, dye compounds
  • the marker is not a radioactive marker in order to avoid the security problems associated with these markers.
  • the marker is electrochemically detectable and in particular the marker is a derivative of an iron complex, such as a ferrocene.
  • Indirect systems can also be used, such as for example ligands capable of reacting with an anti-hgand.
  • the hgand / anti-hgand couples are well known to those skilled in the art, which is the case for example of the following couples: biotin streptavidin, hapten antibody, antigen / antibody, peptide / antibody, sugar / lectin, polynucleotide / complementary to the polynucleotide.
  • the ligand which carries the reactive diazomethyl function is the ligand which carries the reactive diazomethyl function.
  • the anti-hgand can be directly detectable by the markers described in the preceding paragraph or be itself detectable by another hgand / anti-hgand pair.
  • This stacking system is illustrated in the examples.
  • Another example of indirect systems uses a specific covalent hedge between the ligand and the anti-ligand, for example methyl ketone and alkoxyamine. Examples of this system are described in patent applications WO-A-00/40590 and WO-A-98/05766.
  • At least two labels are present on the labeling reagent.
  • the tracer is a fluorescent compound with a small steric hindrance such as fluorescein, hexachlorofluorescein (HEX), dansyl (edans), rhodamine, tetramethyhhodamine (5 or 6-TAMRA), carbo ⁇ y-X-rhodamine (ROX), N1R-type chromophores (LI-COR Inc, Lincoln NE, USA), cyanine derivatives such as Cy5 and Cy3 (Randolph JB and al, Nucleic Acids Res., 25 (14) , p2923-2929, 1997) and in particular the derivatives of Cy5 or else the tracer is a hapten of small steric hindrance such as biotin, dinitrohenyl, or a derivative of abietane (see application WO-A-00/07982 ).
  • a small steric hindrance such as fluorescein, hexachlorofluorescein (HEX),
  • small steric hindrance is meant a molecular weight of less than 1000 g / mole.
  • fluorophores whose excitation wavelength is greater than 450 nm, preferably greater than 600 nm.
  • the detection is carried out by the recognition of an anti-hgand labeled as described above.
  • biotin preferably streptavidin or an anti-biotin antibody coupled to a fluorescent compound such as fluorescein, Cy5 or phycoerythrin is used.
  • a monoclonal antibody is used as described in patent application WO-A-00/07982.
  • the labeling reagents of the invention are soluble in polar solvents such as DMF, DMSO, CH 3 CN, THF, DMA (dimethylacetamide), NMP (N-methylpyrrohdone), DME (dimethoxyethane).
  • polar solvents such as DMF, DMSO, CH 3 CN, THF, DMA (dimethylacetamide), NMP (N-methylpyrrohdone), DME (dimethoxyethane).
  • the labeling reagents are soluble in DMSO or water.
  • solvent miscible with water is meant a solvent which is miscible in a proportion of at least 5% by volume with water or an aqueous buffer containing salts.
  • the arm L comprises an ethylene glycol or polyethylene glycol unit to increase the solubility of the reagent in water.
  • A is a hedge arm comprising at least one double ethylene type hedge allowing the conjugation of the diazomethyl function with the aromatic cycle.
  • the function of the hedge arm A is to move the diazomethyl function away from the cyle to reduce the steric hindrance while retaining the stability of the diazomethyl function.
  • conjugation is meant the electronic delocalization of the aromatic cycle along the carbon chain of the hedge arm AA as an example, the arm A can have the following structure:
  • v is an integer between 1 and 10, preferably v is 1 or 2, and
  • R 10 is H or an alkyl group, preferably R 10 is H, methyl or ethyl.
  • R 10 is H or an alkyl group, preferably R 10 is H, methyl or ethyl.
  • nucleic acid means a chain of at least two deoxyribonucleotides or ribonucleotides optionally comprising at least one modified nucleotide, for example at least one nucleotide comprising a modified base, such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxy ⁇ ridine or any other modified base allowing hybridization.
  • a modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxy ⁇ ridine or any other modified base allowing hybridization.
  • This polynucleotide can also be modified at the level of the intemucleotide hedge such as for example phosphorothioates, H-phosphonates, alkyl-phosphonates, at the level of the skeleton such as for example alpha-ohgonucleotides (FR 2 607 507) or PNA (M Egholm et al., J. Am. Chem. Soc, 114, 1895-1897, 1992 or 2 'O-alkyl ribose.
  • the nucleic acid can be natural or synthetic, an ohgonucleotide, a polynucleotide, a fragment of nucleic acid, a ribosomal RNA, a messenger RNA, a transfer RNA, a nucleic acid obtained by an enzymatic amplification technique such as:
  • polypeptide is meant a chain of at least two amino acids.
  • amino acids is meant:
  • hapten designates non-immunogenic compounds, that is to say incapable by themselves of promoting an immune reaction by production of antibodies, but capable of being recognized by antibodies obtained by immunization of animals in known conditions, in particular by immunization with a hapten-protein conjugate.
  • These compounds generally have a molecular mass of less than 3000 Da, and most often less than 2000 Da and can be, for example, glycosyl peptides, metabohtes, vitamins, hormones, prostaglandins, toxins or various drugs, nucleosides and nucleotides.
  • antibody includes polyclonal or monoclonal antibodies, antibodies obtained by genetic recombination, and antibody fragments such as Fab or F (ab ') 2 fragments.
  • antiigen denotes a compound capable of generating antibodies.
  • protein includes holoproteins and heteroproteins such as nucleoproteins, lipoproteins, phosphoproteins, metalloproteins and glycoproteins, both fibrous and globular in their characteristic conformation form.
  • the biological molecule has a phosphate group, that is to say having at least one motif: which is either naturally present in the biological molecule or can be introduced for example by chemical or enzymatic modification. Examples of chemical modification for proteins are given in "Chemistiy of protein conjugation and cross linking", SS Wong, CRC Press, 1991.
  • the biological molecule is a nucleic acid.
  • R 1 represents H or an alkyl or aryl or substituted aryl group
  • R 2 represents a detectable marker or at least two detectable markers rehesed together by at least one multimeric structure
  • L is a hedge arm comprising a linear chain of at least two covalent hedges
  • the labeling reagent has the: a) formula (13):
  • R 1 represents a methyl or phenyl group.
  • L can comprise a motif - (NH-CH2-CH2) -, repeated from 1 to 20 times, preferably from 1 to 10 times, and even more preferably from 2 to 5 time.
  • hydrazine derivative is meant a molecule having the NH 2 -NH- function. Tosylhydrazine is an example of such a derivative.
  • the transformation of hydrazone into diazomethyl is carried out by the usual methods, in particular the oxidation with MnO 2 . Other methods are useful as described in X. Creary, Organic Syntheses, Wiley: New York, Coll. Flight. NE, p438-443, 1990; H.
  • said method comprises: • an additional step of protection of the ketone or aldehyde function (in the case where R 1 is H) of compound (9), and • a step additional subsequent deprotection of said ketone or aldehyde function.
  • This protection is achieved by an acetal group, for example.
  • Deprotection is carried out by an appropriate means such as in acid for the acetal group.
  • the precursor of the marker can have the formula (17) below.
  • GPi and GP 2 represent two protective groups of identical or different a ine function and p is an integer between 1 and 10, advantageously 2 and 6 preferably 4.
  • GPi and GP 2 are different in order to be able to add several patterns as is explained below.
  • protective groups GP1 or GP2 which can be used in the present invention are given in TW Greene and PGM Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2 nd edition, John Wiley and Sons, New York, 1991, preferably those commonly used in peptide synthesis such as Boc (tert-butyloxycarbonyl), Fmoc (9-fluorenylmethyleneoxycarbonyl), Cbz (carboxybenzyl) or A oc (ahyloxycarbonyl).
  • GP1 and GP2 are the protective groups Boc and Fmoc respectively.
  • the reaction between this precursor which has a carboxyhque function and the derivative of formula (18), below takes place in the presence of a coupling agent to form the amide hedge.
  • the hberated amine function is used to couple another molecule of formula (17). This process is repeated as many times as necessary to obtain a multitude of NH 2 functions protected by a protective group, for example a Boc function.
  • the pattern is added between one (1) and one hundred (100) times, preferably between one (1) and twenty (20) times. Hydrazine is reacted on the ketone function originating from the phenylketone derivative to form a hydrazone and then oxidized in the presence of MnO 2 to form a diazomethyl residue.
  • a tracer for example a biotin activated by an N-hydroxysuccinimide group
  • a tracer for example a biotin activated by an N-hydroxysuccinimide group
  • This solution preferably contains salts such as a buffer solution.
  • a monophasic solution such as a DMSO water solution as opposed to a biphasic solution such as a chloroform water solution.
  • the specific conditions for labeling reactions vary depending on the biological molecules and the label. With regard to nucleic acids, a pH between 5 and 8 allows efficient labeling. In particular, a pH of between 5.5 and 7.0 is preferred for all of the reagents of the invention. With the reagent of formula (11), the pH range is wider for labeling. Good labeling efficiency is obtained for a pH between 3 and 8 for this reagent.
  • DNA chip is meant a sohde support of reduced size where a multitude of capture probes are fixed at predetermined positions.
  • density of the nucleic acids attached to the solid support imposes significant steric constraints during hybridization and the fragmentation allows this stage of hybridization to be overcome. Examples of these DNA chips are given, for example, in the publications of G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, ⁇ 40-44, 1998; F. Ginot, Hu an Mutation, 10, pl-10, 1997; J.
  • the fragmentation and the labeling are carried out in one step or in two steps and the labeling can be carried out either before, after or simultaneously with the fragmentation.
  • the labeling and the fragmentation take place simultaneously, that is to say that the reagents necessary for these two stages are put together in substantially homogeneous solution.
  • aqueous with nucleic acid for example.
  • labeling and fragmentation being carried out simultaneously means that the physical means is applied to a homogeneous substantially aqueous solution containing at least the nucleic acids and the labeling reagent.
  • the nucleic acid is fragmented by enzymatic, chemical or physical means.
  • the enzymatic fragmentation of the nucleic acid is carried out for example by nucleases.
  • Fragmentation of the nucleic acid by physical means is carried out for example by sonication or by radiation.
  • Fragmentation by chemical means, if the nucleic acid is an RNA is carried out by the usual methods (see for example Chem. Rev, 98, 961-990, 1998 by Oivanen M. et al).
  • Metal complexes as described in the review by G. Pratviel et al, Adv. Qrg. Chem., 45, p251-312, 1998 or the review G. Pratviel et al, Angew. Chem. Int.
  • the chemical fragmentation of RNA is carried out by metal cations associated or not with a chemical catalyst.
  • the metal cations are Mg + , Sr 2 *, Ba 2+ , Pb 2+ , Zn 2+ , Cd 2+ , Mn 2+ , Fe 2+ , Co 2+ , Ni 2+ , Ru ions.
  • the chemical catalyst consists of imidazole, a substituted analog, for example Nmethyl-imidazole, or any chemical molecule having an affinity for RNA and carrying an imidazole nucleus or a substituted analogue.
  • the conditions for fragmentation using metals are well described in patent application WD-A-99/65926.
  • the metals are M + , Mn 2+ , Zn 2+ , Tb 3+ or Ce 3+ , preferably Mg 2+ , Mn 2+ , Zn 2+ .
  • Effective fragmentation conditions are obtained with a concentration of metal cation such as Mn ++ between 2 and 100 mM, a concentration of imidazole between 2 and 100 mM. Especially effective conditions are obtained with a cation concentration such as Mn ++ between 3 and 15 mM, and an imidazole concentration between 20 and 50 mM, in particular 30 mM.
  • the pH of the reaction should be slightly basic.
  • the pH is between 8.5 and 9, which represents a very interesting compromise for achieving the combination of labeling and fragmentation with RNA.
  • the chemical fragmentation of RNA is carried out by the action of a polyamine, such as spermine, putescein or cadaverine.
  • RNA Concentrations of 5 to 100 mM allow fragmentation. This is total from 10 mM polyamine.
  • chemical fragmentation of RNA is carried out by the action of an artificial nuclease (see G. Pratviel et al, Adv. Inorg. Chem., 45, p251-312, 1998; DS Sigman et al Chem. Rev., 93, p2295-2316, 1993), such as 1,10-phenanthroline associated with a metal cation such as iron, copper or zinc. These cations come respectively from FeSO or CuCt or ' ZnQ. in solution. Concentrations between 2 and 50 mM of 1,10-phenanthroline are used for the fragmentation of RNA in particular between 4 and 10 mM.
  • the chemical fragmentation of DNA is carried out by bringing the nucleic acid into contact with a chemical means for creating an abasic site.
  • the formation of an abasic site results from the cleavage of the N-glycosidic hedge which he 2-deoxyribose sugar at the nucleic base.
  • DNA incorporating uracyls The abasic site obtained by depurination or depyrimidation is very unstable. The fragmentation at this site is obtained at room temperature in basic miheu. In acid miheu, the high temperature also accelerates this fragmentation. The use of molecules capable of initiating the phenomenon of ⁇ -elimination also accelerates fragmentation.
  • a preferred mode of reahsation of the fragmentation is obtained by the use of an acidic pH, that is to say a pH below 5.
  • the pH is 3.
  • a sodium formate buffer at pH 3 makes it possible to fragment effectively according to the invention. This buffer is compatible with the one-step marking conditions as will be demonstrated in the examples. Even more advantageously an acid miheu (HCl, carbonate, H 2 SO) is used.
  • the deoxyribonucleic acid contains at least one modified base capable of generating an abasic site more easily
  • modified bases can be used such as N7-alkyl purines, N3-alkyl purines, O6-alkyl purines, 8-bromopurines, 8-thiopurines, 8-alkylthiopurines, 8 azidopurines or 8-alkylsulfonylpurines.
  • the use of an 8-bromopurine makes it possible to have effective incorporation during the amplification, which facilitates all the more the fragmentation and labeling process according to the invention, while retaining an exceptional sensitivity for the enzymatic amplification step.
  • the present invention describes a labeled biological molecule and in particular a labeled nucleic acid, capable of being obtained by any of the methods according to the invention.
  • the present invention also relates to a kit for detecting a biological molecule, in particular a target nucleic acid comprising a labeling reagent according to the invention.
  • a kit for detecting a biological molecule in particular a target nucleic acid comprising a labeling reagent according to the invention.
  • other elements such as, for example, lysis means (microorganisms and / or cells) and / or concentration means (such as sihce or magnetic particles) and / or means of enzymatic amplification are incorporated into the kit.
  • the invention relates to the use of a labeled biological molecule, in particular a labeled nucleic acid as defined above, as a probe for detecting a target biological molecule, and in particular a target nucleic acid.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid as defined above, as a labeled target which can be fixed on a capture probe.
  • the labeled biological molecule is capable of forming a complex with the target biological molecule.
  • the labeled nucleic acid is sufficiently complementary to the target to hybridize specifically according to the reaction conditions, and in particular the temperature or the salinity of the reaction medium.
  • the detection method is suitable for sequencing, the expression profile of messenger RNAs or the screening of mutations for research purposes as well as the screening of drugs in the pharmaceutical industry, the diagnosis of infectious or genetic diseases, the control food or industrial.
  • the trend in diagnostics and especially for infectious diseases is to lower the level of sensitivity, until the detection of a single molecule in a sample which can represent several milliliters in the case of a liquid sample such as blood or urine or cerebrospinal fluid.
  • This level of sensitivity can only be obtained if all the steps from sampling the sample to rendering the result are optimized.
  • the various means of the invention allow this optimization without difficulty because the reagents, methods and methods of the invention can be applied very widely to different biological molecules.
  • a labeling and / or fragmentation process allows not to affect the sensitivity of the amplification technique, either because it is not no need to replace the deoxyribonucleotides or ribonucleotides used in the enzymatic amplification technique, either because the ribonucleotides or deoxyribonucleotides incorporated do not alter the sensitivity.
  • the grafting chemistry described in the present invention has such characteristics, from the reactivity and specificity point of view, that other applications are described below: • In a first mode of reahsation, this grafting chemistry is applied to the fixation covalent of nucleic acids on a solid support.
  • a precursor of the diazomethyl function such as a ketone or hydrazine as described above, is introduced during the chemical synthesis and the diazomethyl function is introduced on the nucleic acids in a second step.
  • the diazomethyl functions are introduced on the sohde support and the nucleic acids are fixed on the sohde support by means of the phosphates of the nucleic acids and in particular of the terminal phosphates (5 ′ or 3 ′) .
  • the introduction of phosphate at the 3 'or 5' end of nucleic acids is well known
  • a labeling reagent carrying a hgand in particular a hapten such as biotin or abietane, is fixed on the sohde support on which is fixed covalently or by adsorption a anti-ligand, such as steptavidin or an antibody for example.
  • a anti-ligand such as steptavidin or an antibody for example.
  • the derivatives of formula (13), (14), (15) or the PDAM derivative are examples of reagents which can be used for the manufacture of such a solid support.
  • the monoclonal antibody technique makes it possible to prepare antibodies against a large number of markers such as fluorescein or a derivative of Cy5.
  • the skilled person can implement a sohde support with the labeling reagents of the present invention without undue difficulty by this indirect mode of preparation of the sohde support in which a hgand / anti-hgand reaction is used to fix the diazomethyl function on the sohde support.
  • a second mode of reahsation of the solid support relates to particulate supports such as latexes.
  • Different modes of polymerization can be used to prepare the particles carrying a diazomethyl function from a functional polymerizable monomer carrying either a diazomethyl function or preferably a precursor function of the diazomethyl function such as an aldehyde or a ketone and in particular: • Reactor polymerization closed called “batch”: the monomers are introduced into the reactor before the start of the reaction with the other ingredients and without subsequent addition. Due to the difference in reactivity of the monomers, this process often leads to the appearance of a drift in composition. This is manifested by obtaining macromolecules having compositions which vary considerably depending on the conversion.
  • a third mode of reahsation of the sohde support consists in having a sohde support comprising a first reactive nucleophilic or electrophilic function, such as for example NH 2 , SH, OH, O ⁇ NH 2 , alkylketone, aldehyde, isocyanate, isothiocyanate, maleimide, alkyl halide, N-hydroxysuccinimide ester, tosylate, then reacting a fixing intermediate, comprising a reactive function complementary to the first reactive function of the support sohde.
  • This reaction between the solid support and the fixing medium is carried out in the presence, optionally of a coupling agent to form a covalent hedge.
  • Such a sohde support comprising at least one diazomethyl function is also an object of the present invention as well that the sohde support comprising nucleic acids attached to the sohde support via the diazomethyl functions.
  • a first application of such a sohde support is the manufacture of DNA chips. Methods exist for distributing nucleic acids on the solid support in discrete and predetermined positions. US-A-6,110,426 proposes a method for producing these DNA chips using a capillary which is brought into contact on a solid surface to deliver a controlled volume of liquid.
  • US-A-6,083,763 describes a set of capillaries sliding in a device so as to compensate for the differences in height of each of them. They are brought into contact with a flat surface for the deposition by capillarity of specific ohgonucleotides.
  • US-A-6,083,762 proposes a drop distribution system comprising a microdispenser coupled to a piezoelectric transducer to eject drop volumes lower than the nanohtre on a solid surface. A similar result is obtained by applying a hot source to the wall of a capillary to form a nozzle which ejects a defined volume of solution (see T.
  • the diazomethyl function thus makes it possible to graft the nucleic acids covalently onto the support.
  • the grafting is simple, the hedge is stable, in particular with respect to adsorption and the selectivity of the reaction with respect to the terminal phosphate makes it possible to carry out an oriented coupling of the nucleic acid on the sohde support, which facilitates all the more the subsequent hybridization steps by reducing steric hindrance.
  • a second application of a sohde support according to the invention is the purification of nucleic acids.
  • this purification is either direct (the sohde support carrying diazomethyl functions reacts with the nucleic acids to be purified) or indirect (capture nucleic acids are fixed on the sohde support).
  • These capture nucleic acids are sufficiently complementary to the target to be captured to hybridize with the degree of specificity desired and it is the “capture nucleic acids / sohde support” complex which allows the purification of the target nucleic acids.
  • the solid support is preferably in dispersed form for use in purification, such as latex particles, for example magnetic particles.
  • purification step is meant in particular the separation between the nucleic acids of the microorganisms and the cellular constituents released in the lysis step which precedes the purification of the nucleic acids.
  • lysis steps are well known by way of indicative example, it is possible to use the lysis methods as described in the patent applications:
  • lysis methods such as thermal or osmotic shocks or treatments with chaotropic agents, such as guanidium salts (US Pat. No. 5,234,809).
  • This step generally makes it possible to concentrate the nucleic acids.
  • magnetic particles see on this subject the patents US-A-4,672,040 and US-A-5,750,338, and thus to purify the nucleic acids, which are fixed on these magnetic particles, by a washing step.
  • This nucleic acid purification step is particularly interesting if it is desired to subsequently amplify said nucleic acids.
  • a particularly interesting mode of reahsation of these magnetic particles is described in patent applications WO-A-97/45202 and WO-A-99/35500.
  • sihde support includes all materials to which a nucleic acid can be attached. Synthetic materials or natural materials, optionally chemically modified can be used as a solid support, in particular polysaccharides, such as materials based on cehulose, for example paper, derivatives of cehulose such as acetate of cehulose and nitrocellulose, or dextran; polymers, copolymers, in particular based on monomers of the styrene type, natural fibers such as cotton, and synthetic fibers tehes than nylon; mineral materials such as silicon, quartz, glasses, ceramics; latexes; magnetic particles; metal derivatives, gels, etc.
  • the solid support can be in the form of a microtiter plate, a membrane, a particle or a substantially flat plate of glass or silicon or derivatives.
  • the invention relates to a method for capturing nucleic acids comprising the following steps: • there is a solid support on which is fixed directly or indirectly at least one molecule comprising a diazomethyl function, • a biological sample is brought into contact likely to contain hbre nucleic acids, and • the sohde support is washed where the molecule (s) are (are) covalently attached to at least one nucleic acid. Additional information can be found in another patent application of the Applicant, WO02 / 090584, filed under priority of May 4, 2001.
  • FIG. 1 represents the developed formulas of various reagents used in the present invention as well as the abbreviation designating them (o- signifies ortho, m-meta and p-para).
  • FIG. 2 represents the mean value of the signal and the percentage similarity of the m bio-TETA-PMDAM as a function of its concentration for rpoB.
  • Biotin meta-acetophenone compound The D-biotin (1.0 gram (g), 4.1 milhmol (mmol)) is dissolved in 45 milliliters (mL) of hot anhydrous DMF. Cool to 0 ° C under argon, then add N-methylmorpholine (590 microliters ( ⁇ L), 5.33 mmol) and isobutyl chloroformate (840 ⁇ L, 6.60 mmol) successively. The mixture is left stirring for 30 minutes (min), then the 3-aminoacetophenone (824 mg, 6.10 mmol) and the N-methylmorpholine (480 ⁇ L, 4.35 mmol) are added in 10 ml of DMF.
  • N-methylmorpholine 590 microliters ( ⁇ L), 5.33 mmol
  • isobutyl chloroformate 840 ⁇ L, 6.60 mmol
  • the D-biotin (2.80 g, 11.40 mmol) is dissolved in 30 ml of anhydrous DMF.
  • the addition of carbonyldiimidazole (1.5 eq .; 2.78 g) causes a precipitate to form after a few minutes.
  • the product is purified by flash chromatography on sihce gel with as eluent
  • ACBA (2) (1.03 g; 4.39 mmol) is dissolved in 20 ml of anhydrous DMF under argon. The miheu is cooled in ice, and N-methylmorpholine (1.25 eq .; 725 ⁇ L) and isobutyl chloroformate (1 eq .; 690 ⁇ L) are successively added: the miheu becomes cloudy after 30 min.
  • Bio-TETA (1) 0.8 eq.; 1.94 g
  • Ehe is added to the activated ACBA at 0 ° C, for 30 min. The mixture is then left at room temperature overnight.
  • Bio- (TETA) -Hy (4) (150 mg; 250.4 ⁇ mol) is dissolved in 1 mL of anhydrous DMSO under argon. It is left to react for 30 minutes with Mn ⁇ 2 (s) (15 eq.; 330 mg) and then filtered on frit No. 4 with celite (0.5 cm thick) and 3 A molecular sieve (0.5 cm thick). 100 ⁇ L are used for NMR with addition of 380 ⁇ L of DMSO-d 6 and 20 ⁇ L of The final volume is adjusted to 4.5 ml with anhydrous DMSO and 4% methanol. We stun in a glove box under Argon by 250 ⁇ L. The compound is fuchsia pink.
  • the degree of purity (diazomethyl content) is checked by 1 H NMR and UN-vis spectrophotometry (absorbance peak of diazomethyl at 516 nm).
  • RM ⁇ -1H (200 MHz, DMSO- d 6 ) ⁇ 9.93 (s, 1H, Ph-NH-CO-); 7.3 (s, 3H, EL TM - *) * ",); 6.6 (s, IH,; 6.4 (s, IH, -NH- biot); 6.3 (s, IH, -NH- biot); 4.3 (t, IH, -CH- biot) ; 3.3 (m, 12H, - ⁇ H2-NH-); 3.3 (m, 1H, -CH-S-); 2.9 (dd, 2H, -CH 2 -S-); 2.5 (4H, -CH 2 -CO-); 2.1 (s, 3H, -CH 3 ); 2.0 (m, 2H, -CH 2 -NH-CH 2 -
  • DNA amphcons are generated by PCR from Mycobacterium tuberculosis 16S genomic DNA targets (10 +4 copies as starting targets) using the Roche Fast Start kit, 0.2 mM of each deoxyribonucleotide (d-ATP, d -CTP, d-GTP, d-TTP), 0.3 ⁇ M primers and 0.4 ⁇ L of enzyme.
  • the parameters of the PCR are as follows:
  • the transcripts are reacted from a PCR target (fragment of the 16S RNA of Mycobacterium tuberculosis) using the MEGAscript kit from Ambion: 7.5 mM of each nucleotide (ATP, CTP, GTP and UTP) and 2 ⁇ L of enzyme (RNA polymerase). The incubation time is 3 hours (h) at 37 ° C.
  • the PCR amplification primers carry a T3 or T7 polymerase promoter, as described in application WO-A-99/65926 or in the article J. Clin Microbiol. 37 (1), p 49-55, 1999, which allows for transcription.
  • the transcripts are analyzed by electrophoresis on agarose gel (1.5%; TBE 0.5X). The volume deposited is 5 ⁇ L and the migration takes place for 20 min at 100V. The transcripts are visualized under UV lamp after staining with ethidium bromide. Identical results from the point of view of the invention can be obtained using other amplification techniques such as NASBA or TMA, which directly generate RNA amphcons.

Abstract

47 ABREGE DESCRIPTIF « Réactifs de marquage, procédés de synthèse de tels réactifs et procédés de détection de molécules biologiques » - BIOMERIEUX S.A. 5 La présente invention concerne un réactif de marquage stable à la température de formule (0) : dans laquelle : 10 R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multimérique, L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, 15 R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n- Y- X- , OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3- (O - CH2- CH2)3- CH2- NH- R2, - CO- NH- (CH2)3- (O - CH2- CH2)4- CH2- NH- R2 avec R = alkyle ou aryle, A est un bras de liaison comportant au moins une double liaison covalente permettant la conjugaison de la fonction diazo avec le cycle aromatique et u est un nombre entier compris entre 20 0 et 2, préférentiellement de 0 ou 1, -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O- , -CH2S- , -Z- représente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-, m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, et p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3. 25 48 La présente invention décrit aussi un procédé de synthèse desdits marqueurs ainsi que des applications pour le marquage de molécules biologiques, en particulier des acides nucléiques, avec un réactif de marquage portant la fonction diazométhyle. L'invention trouve une application préférentielle dans le domaine du diagnostic. 5

Description

Réactifs de marquage procédés de synthèse de tels réactifs et procédés de détection de molécules biologiques
La présente invention concerne de nouveaux réactifs de marquage de molécules biologiques, un procédé de synthèse desdits maïqueurs ainsi que des applications pour le marquage de molécules biologiques en particulier dans le domaine du diagnostic utilisant l'analyse des acides nucléiques..
L'état de la technique montre que de nombreuses méthodes existent pour marquer des nυcléotides, des oligoaucléoûdes ou des acides nucléiques. Une première méthode consiste à fixer le marqueur sur la base, que celle-ci soit naturelle ou modifiée. Une deuxième méthode propose de fixer le marqueur sur le sucre, là encore qu'il soit naturel ou modifié. Une troisième méthode a pour objet la fixation du marqueur sur le phosphate. Le marquage sur la base a été notamment utilisé dans l'approche de marquage des acides nucléiques par incorporation de nucléotides directement margués. Le marquage sur le sucre est souvent utilisé dans le cas des sondes nucléiques préparées par synthèse chimique. Le marquage sur le phosphate a été aussi utilisé pour introduire des bras fonctionnalisés et des marqueurs lors de la synthèse chimique des oligonucléotides. En fait l'homme du métier, qui doit effectuer un marquage d'un nucléotide, ou d'un analogue de nucléotide ou d'un acide nucléique, est enclin à effectuer cette fixation sur la base ou sur le sucre qui lui offrent plus de commodité et d'alternatives. C'est d'ailleurs ce qui essort de l'étude de nombreux documents, tels que EP-A-0.329.198, EP-A-0.302.175, EP-A-0.097.373, EP-A- 0.063.879, US-A-5,449,767, US-A-5,328,824, WO-A-93/16O94, DE-A-3.910.151, EP-A- 0.567.841 pour la base ou EP-A-0.286.898 pour le sucre.
La fixation du marqueur sur le phosphate est une technique plus complexe que la technique consistant à fonctionnaliser la base ou le sucre et a été bien moins utilisée notamment à cause de la faible réactivité du phosphate (voir par exemple Jenc s W.P. et al J. Amer. Chem Soc, 82, 1778- 1785, 1960). De même dans la revue de O'Donnel et Me Laughlin («Reporter groups for the analysis of nucleic acid structure », p 216-243, dans «Bioorganic Chemistry : Nucleic Acids », Ed Hecht S.M., Oxford University Press, 1996) portant sur les méthodes d'introduction de sondes dans les fitagments d'oligonucléotides, l'al ylation efficace du phosphodiester intemucléotidique est considérée comme étant impossible.
La demande de brevet WO- A- 99/65926 décrit un procédé de marquage d'un acide ribonucléique (ARN) de synthèse ou naturel qui consiste à fragmenter l'ARN et à marquer au niveau du phosphate terminal. Ce document décrit un certain nombre de fonctions pouvant être utilisées pour le marquage en liaison avec la fragmentation comme les fonctions hydroxyle, aminé, hydrazine, alcoxyamine, halogénure d'alkyle, halogénure d'alkyle de type benzylique et en particulier le dérivé 5-(bromométhyl)fl.uorescéine. Ces fonctions permettent de marquer les acides nucléiques, mais il faut associer une étape de fragmentation pour avoir un marquage efficace car ce marquage se produit sur le phosphate libéré lors de la fragmentation. De plus, il faut ajouter un excès important de réactif de marquage par rapport à l'ARN pour obtenir un marquage efficace ce qui induit des problèmes de bruit de fond générés par le marqueur en excès. Enfin, cette méthode ne fonctionne pas efficacement sur de l'ADN double brin.
D. existe donc un besoin pour de nouveaux réactifs qui soient efficaces du point de vue du rendement de marquage, qui soient spécifiques au niveau de la position de marquage et en particulier qui n'affectent pas les propriétés d'hybridation des bases impliquées dans la formation de la double hélice, par l'intermédiaire des liaisons hydrogènes, qui soient utilisables à la fois pour l'ADN et l'ARN, et enfin qui permettent de marquer indifféremment des nucléotides, des oligonucléotides, des acides nucléiques naturels ou préparés par amplification enzymatique.
La Demanderesse a déjà proposé de tels nouveaux marqueurs qui répondent aux conditions précitées et qui utilisent la fonction diazométhyle comme fonction réactive pour le marquage. C'est par exemple le cas dans les demandes de brevet WO-A-02/090319 et WO-A-02/090584 ou dans l'article de Laayoun et al. paru dans Bioconjugate Chem. 2003, 14, 1298- 1306 et intitulé : « Aryldiazomethanes for Universal Labelling of Nucleic Acids and Analysis on DNA Chips », auxquels le lecteur peut se référer afin de mieux comprendre les modes de synthèse et d'utilisation de tels constituants. Ainsi la fonction diazométhyle (de formule -C(N2)-) a déjà été utilisée pour l'alkylalion des groupements phosphates, mais un certain nombre de problèmes se posent D'une part, les réactifs incorporant au moins une fonction diazo en général sont instables par eux-mêmes, ce qui pose des problèmes pour l'utilisation de ces réactifs dans un Mt de marquage, ce qui est rédhibitoire si le produit marqué a pour fonction de mettre en évidence la présence d'une molécule cible biologique dans un échantillon quelconque.
Enfin les réactifs portant la fonction diazométhyle et associés à certains marqueurs, tels que la biotine, sont peu solubles dans l'eau, ce qui conduit à utiliser des solvants organiques qui sont missibles à l'eau pour le couplage avec des molécules biologiques, qui ne sont solubles que dans l'eau ou des tampons aqueux, mais ces solvants, présents en concentration importante dans la réaction de marquage, ralentissent la vitesse de réaction et donc nuisent à l'efficacité du couplage.
Les réactifs de marquage préconisés par les documents WO-A-02/090319 et WO-A- 02/090584 ci-dessus mentionnés résolvent aussi ces problèmes techniques. Le contenu de ces demandes est incorporé ici pour référence.
Toutefois même si ces molécules et procédés de marquage sont particulièrement efficaces, la Demanderesse a réussi à trouver de nouvelles molécules et de nouveaux procédés qui améliorent encore l'efficacité du marquage. L'invention consiste en l'utilisation de bras polyaminés qui, à l'instar des bras éthylèneglycols, permettent Féloignement de la biotine par rapport au centre réactif (fonction diazo). Ainsi on obtient une meilleure solubilité en miheu aqueux, grâce à l'introduction du bras hydrophile, avec la possibilité de protonation des aminés en milieu aqueux à pH neutre, ce qui produit une attraction entre les acides nucléiques, chargés négativement et le marqueur avec deux conséquences principales : • marquage plus rapide, ce qui peut être particulièrement intéressant pour les échantillons à faible concentration, et • stabilisation de la double hélice par neutralisation des charges négatives des phosphates.
De plus ces nouvelles molécules permettent la mise en œuvre de procédés pouvant fonctionner en miheu acide, ce qui est particuhèrement intéressant pour des molécules incorporant des fonctions diazo. Ainsi la sélectivité des réactifs portant une fonction diazo est donc plus importante en milieu acide. La solubilité apportée aux chaînes polyamides facilite donc le lavage tout en diminuant le bruit de fond lors de la détection ultérieure, voire même l'élimination pure et simple de l'étape de purification
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, celle-ci propose un réactif de marquage stable à la température de formule (0) :
Figure imgf000006_0001
dans laquelle : • R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué,
• R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multimérique,
• L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, • R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, N02, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n-Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, - CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle,
• A est un bras de liaison comportant au moins une double liaison covalente permettant la conjugaison de la fonction diazo avec le cycle aromatique et u est un nombre entier compris entre 0 et 2, préférentiellement de 0 ou 1, • -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-,
• -Z- représente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-,
• m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, et
• p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3. Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, celle-ci concerne un réactif de marquage, selon la revendication 1, de formule (1) :
Figure imgf000007_0001
dans laquelle :
• R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, • R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables rehés entre eux par au moins une structure multimérique,
• L est un bras de haison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1,
• R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n-Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, - CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle, et
• -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-,
• m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, et
• p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3. Avantageusement, selon une variante des deux premiers modes de réalisation, la valeur p est inférieure ou égale à la valeur m dans la foimule (0) ou (1) du réactif. Selon un troisième mode de réalisation, la présente invention propose un réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, de formule (2) :
Figure imgf000008_0001
dans laquelle :
• R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué,
• R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables rehés entre eux par au moins une structure multimérique,
• L est un bras de haison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux haisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, R et R représentent indépendamment l'un de l'autre : H, N02, Cl, Br, F, I, R" -(L)n-Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, - CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle, et
• q est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3 Selon un quatrième mode de réalisation, la présente invention décrit un réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, de formule (3) :
Figure imgf000008_0002
dans laquelle :
• R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aiyle substitué,
• R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables rehés entre eux par au moins une structure multimérique,
• L est un bras de haison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux haisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, et
• R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, N02, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n-Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, - CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle. Selon une variante associée au quatrième mode de réalisation de l'invention, R2 est consituté par un résidu D- Biotine de formule (4):
Figure imgf000009_0001
Avantageusement et quel que soit le mode de réalisation précédemment évoqué du réactif, R1 est consituté de : CH3, et R3 et R4 représentent chacun : H Avantageusement et quel que soit le mode de réalisation ou variante précédemment évoqué(e) du réactif, la structure -(L)n- est constituée par :
• la spermine ou N, -Bis(3- aminopropyl)- 1 ,4- diaminobutane : NH2- (CH2)3-NH- (CH2)4-NH- (CH2)3-NH2, ou
• la spermidine ou N-(3-aminopropyl)-l,4-butandiamine : H2N-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2, ou
• un dérivé contenant un motif alanine : NH2-CH2-CH2-COOH. Selon un cinquième mode de réalisation de l'invention, celle-ci a trait également un réactif de marquage stable à la température de formule (6) :
Figure imgf000009_0002
dans laquelle :
• R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué,
• R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables rehés entre eux par au moins une structure multimérique,
• L est un bras de haison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux haisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, • R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n-Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, - CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle,
• A est un bras de haison comportant au moins une double haison covalente permettant la conjugaison de la fonction diazo avec le cycle aromatique et u est un nombre entier compris entre 0 et 2, préférentiellement de 0 ou 1,
• -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-,
• -Z- représente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-,
• m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, et • p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3. Selon un sixième mode de réalisation, l'invention propose un réactif de marquage stable à la température de formule (7) :
Figure imgf000010_0001
dans laquelle : • R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué,
• R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables rehés entre eux par au moins une structure multimérique,
• L est un bras de haison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux haisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, • R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, N02, Cl, Br, F, I, R2 -ÇL)n-Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, - CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R= alkyle ou aryle,
• -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-,
• -Z- représente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-, • m est un nombre entier compris enhe 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, et
• p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3. Avantageusement et quel que soit le mode de réalisation ou variante précédemment évoqué(e) du réactif, L comprend un motif -(O-CH2-CH2)-, répété de 1 à 20 fois, préférentiellement de 1 à 10 fois, et encore plus préférentiellement de 2 à 5 fois, -Z- étant alors représenté par -NH-, -NHCO- ou -CONH-.
L'invention concerne également un procédé de synthèse d'un réactif de marquage, selon les modes de réalisation précédents, comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un marqueur ou d'un précurseur de marqueur possédant ine fonction réactive R6, b) on dispose d'un bras de haison de formule (8) : R* — (Z— (CH-j -)^— R. dans laquelle :
• -Z- représente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-,
• m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, • p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3,
• R7 et R8 représentent deux fonctions réactives identiques ou différentes, c) on fait réagir ensemble la fonction réactive R6 dudit marqueur ou précurseur de marqueur avec la fonction R7 du bras de haison de formule (8) en présence d'au moins un agent de couplage pour former une haison covalente, R6 et R7 étant complémentaires, d) on dispose d'un dérivé de formule (9) :
Figure imgf000011_0001
dans laquelle : • R1 représente H ou un groupe alkyle ou aryle ou aryle substitué, • L est un bras de haison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux haisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, • R3 et R4 représentent ind endamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)^ Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, - CO-NH- (CH2)3- (O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle,
• -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH20-, -CH2S-,
• A est un bras de haison comportant au moins une double haison covalente permettant la conjugaison de la fonction diazométhyle avec le cycle aromatique et u est un nombre entier égal à 0 ou 1, et • R9 représente une fonction réactive complémentaire de R8, e) on fait réagir ensemble la fonction réactive F? du dérivé de formule (9) avec la fonction R8 du bras de haison de formule (8) en présence d'au moins un agent de couplage pour former une haison covalente, f) on fait réagir I'hydrazine ou un de ses dérivés sur la fonction cétone ou aldéhyde pour former une hydrazone, et g) on transforme l'hydrazone en fonction diazométhyle à l'aide d'un traitement approprié. Avantageusement, le procédé de synthèse peut également comprendre :
• une étape supplémentaire de protection de la fonction cétone ou aldéhyde du composé (9), et
• une étape supplémentaire ultérieure de déprotection de ladite fonction cétone ou aldéhyde. L'invention concerne aussi un procédé pour le marquage d'une molécule biologique, en particuher un acide nucléique, comprenant la mise en contact en solution homogène, dans un tampon sensiblement aqueux, d'une molécule biologique et d'un réactif, selon les modes de réahsation précédemment évoqués. L'invention concerne encore une molécule biologique marquée susceptible d'être obtenue par le procédé, selon la revendication de marquage ci- dessus.
L'invention concerne également un procédé de marquage et de fragmentation d'un acide nucléique simple ou double brin comprenant les étapes suivantes :
• fragmenter l' acide nucléique, • attacher un marqueur sur au moins un des fragments par l'intermédiaire d'un réactif de marquage choisi parmi les réactifs, selon les modes de réahsation précédemment évoqués, ledit réactif se couplant de manière covalente et majoritaire sur au moins un phosphate dudit fragment Avantageusement le procédé de marquage et de fragmentation s'effectue à l'aide d'un réactif de marquage qui est choisi parmi les composés de foπnule (3) :
Figure imgf000013_0001
dans laquelle : .
• R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, • R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables rehés entre eux par au moins une structure multimérique,
• L est un bras de haison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux haisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, et
• R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n- Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, - CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle. Selon une première variante de réahsation du procédé de marquage et de fragmentation, la fragmentation et le marquage sont effectués en deux étapes. Selon une seconde variante de réahsation du procédé de marquage et de fragmentation, la fragmentation et le marquage sont effectués en une étape. Quel que soit le procédé de marquage et de fragmentation, le marquage s'effectue en solution homogène sensiblement aqueuse. Quel que soit le procédé de marquage et de fragmentation, la fragmentation s'effectue par voie enzymatique, physique ou chimique. La présente invention concerne aussi tout acide nucléique marqué susceptible d'être obtenu par le procédé de marquage et de fragmentation précédent.
La présente invention concerne encore un t de détection d'un acide nucléique cible comprenant un acide nucléique marqué, tel que défini ci- dessus.
La présente invention concerne toujours un support sohde sur lequel est fixé au moins un réactif, tel que défini ci- dessus. La présente invention concerne enfin un procédé de capture d'acides nucléiques comprenant les étapes suivantes : • on dispose d'un support sohde sur lequel est fixé directement ou indirectement au moins une molécule biologique, définie précédemment ou un acide nucléique, défini également précédemment la molécule biologique ou l'acide nucléique comprenant une fonction diazométhyle, • on met en contact un échantillon biologique susceptible de contenir des acides nucléiques hbres, et • on lave le support sohde où la (ou les) molécule(s) sont fixée(s) de manière covalente au moins à un acide nucléique.
Par « structure multimérique », on entend un polymère formé d'unités répétées de synthons chimiques ou biologiques. Un exemple est cité dans l'exemple 34.2 de la description de la demande de brevet WO-A-02/090319. L'homme du métier est invité à se référer à ce document si celui-ci trouvait les informations ci- après développées insuffisantes pour sa complète compréhension sur ce sujet De nombreuses variantes de telles structures utihsables dans la présente invention sont connues, comme par exemple :
• les polymères linéaires (EP- A- 0.561.722, EP-A-0.669.991),
• les polymères ramifiés (WO-A-01/92361),
• les particules (EP-A-0 827 552), • les dendήmères (US -A-4,507,466 ; US-A-4,568,737 ; US-A-6,083,708), • les polynucléotides, et • les polypeptides. Si cela s'avérait nécessaire, l'homme du métier peut également se référer à ces documents pour une parfaite compréhension sur ce sujet.
Par « marqueur détectable », on entend au moins un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs suit :
• les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la péroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la β-galactosidase, la glucose- 6-phosphate déshydrogénase,
• les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants,
• les groupements à densité électronique détectable par microscopie électronique ou par leur propriété électrique comme la conductivité, Fampérométαe, la voltamétάe, l'impédance, • les groupements détectables, par exemple dont les molécules sont de tailles suffisantes pour induire des modifications détectables de leurs caractéristiques physiques et/ou chimiques, cette détection peut être réalisée par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation de surface, la variation d'angle de contact ou des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, • les molécules radioactives comme le 32P, le 35S ou le 125I.
De préférence, le marqueur n'est pas un marqueur radioactif pour éviter les problèmes de sécurité hés à ces marqueurs. Dans un mode de réahsation particuher de la présente invention le marqueur est détectable électrochimiquement et en particuher le marqueur est un dérivé d'un complexe de fer, comme un ferrocène. Des systèmes indirects peuvent être aussi utilisés, comme par exemple des ligands capables de réagir avec un anti-hgand. Les couples hgand/anti-hgand sont bien connus de l'homme du métier, ce qui est le cas par exemple des couples suivants : biotine streptavidine, haptène anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/ complémentaire du polynucléotide. Dans ce cas, c'est le ligand qui porte la fonction réactive diazométhyle. L' anti-hgand peut être détectable directement par les marqueurs décrits au paragraphe précédent ou être lui- même détectable par un autre couple hgand/anti-hgand. Ce système d'empilement est illustré dans les exemptes. Un autre exemple de systèmes indirects utilise une haison covalente spécifique entre le ligand et l'anti- ligand par exemple méthylcétone et alcoxyamine. Des exemples de ce système sont décrits dans les demandes de brevet WO-A-00/40590 et WO-A-98/05766. Ces systèmes de détection indirects peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures WO-A-00/07982, WO-A-01/92361 et WO-A- 95/08000 pour des exemples d'amplification chimique en utilisant des polymères ou à la demande WO- A-01/44506 pour les systèmes d'amplification chimique par empilement.
Dans un mode particuher de l'amplification de signal, au moins deux marqueurs sont présents sur le réactif de marquage.
Dans un mode préféré de l'invention, le traceur est un composé fluorescent de faible encombrement stérique comme la fluorescéine, l'hexachlorofluorescein (HEX), le dansyl (edans), la rhodamine, la tetramethyhhodamine (5 ou 6-TAMRA), la carboχy-X-rhodamine (ROX), les chromophores du type N1R (LI-COR Inc, Lincoln NE, USA), des dérivés cyanines comme le Cy5 et le Cy3 (Randolph J.B. and al, Nucleic Acids Res., 25(14), p2923-2929, 1997) et en particuher les dérivés du Cy5 ou bien le traceur est un haptène de faible encombrement stérique comme la biotine, le dinitrohenyle, ou un dérivé de l'abiétane (voir la demande WO-A-00/07982). Par faible encombrement stérique, on entend un poids moléculaire inférieur à 1000 g/mole. Dans le cas d'un fluorophore, il est préférable de travailler avec des fluorophores dont la longueur d'onde d'excitation est supérieure à 450 nm, de préférence supérieure à 600 nm. Dans le cas où le traceur est un haptène qui ne produit pas de signal par lui-même comme par exemple la biotine, la détection est réalisé par la reconnaissance d'un anti-hgand marqué comme décrit plus haut. Dans le cas de la biotine, on utilise de préférence de la streptavidine ou un anticorps anti-biotine couplé à un composé fluorescent comme la fluorescéine, Cy5 ou la phycoérythrine. Dans le cas de l'abiétane, on utilise un anticorps monoclonal comme décrit dans la demande de brevet WO-A-00/07982.
En particuher les réactifs de marquage de l'invention sont solubles dans des solvants polaires comme le DMF, le DMSO, CH3CN, THF, DMA (diméthylacétamide), NMP (N- méthylpyrrohdone), DME (diméthoxyéthane). De préférence les réactifs de marquage sont solubles dans le DMSO ou l'eau. Par solvant miscible à l'eau, on entend un solvant qui est miscible dans une proportion d'au moins 5% en volume avec de l'eau ou un tampon aqueux contenant des sels. Avantageusement dans les formules précédentes, le bras L comprend un motif éthylène glycol ou polyéthylène glycol pour augmenter la solubilité du réactif dans l'eau. A est un bras de haison comportant au moins une double haison de type éthylénique permettant la conjugaison de la fonction diazométhyle avec le cycle aromatique. Le bras de haison A a pour fonction d'éloigner la fonction diazométhyle du cyle pour diminuer l'encombrement stérique tout en conservant la stabihté de la fonction diazométhyle. Par « conjugaison », on entend la délocalisation électronique du cycle aromatique le long de la chaîne carbonée du bras de haison A A titre d'exemple, le bras A peut avoir la structure suivante :
Figure imgf000017_0001
dans laquelle :
• v est un nombre entier compris ente 1 et 10, de préférence v est 1 ou 2, et
• R10 est H ou un groupement alkyle, de préférence R10 est H, méthyle ou éthyle. Ces réactifs peuvent ainsi se fixer en phase homogène sur les molécules biologiques, la phase homogène étant constituée d'une solution sensiblement aqueuse c'est à dire contenant au moins 50% d'eau. Par « molécule biologique », on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. A titre d'exemple on peut citer comme molécules biologiques les acides nucléiques, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes.
Le terme « acide nucléique » signifie un enchaînement d'au moins deux désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuehement au moins un nucléotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée, telle que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyυridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la haison intemucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les H- phosphonates, les alkyl-phosphonates, au niveau du squelette comme par exemple les alpha- ohgonucléotides ( FR 2 607 507) ou les PNA (M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc, 114, 1895- 1897, 1992 ou les 2' O-alkyl ribose. L'acide nucléique peut être naturel ou synthétique, un ohgonucléotide, un polynucléotide, un fragment d'acide nucléique, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique telle que :
• PCR (Polymerase Chain Reaction), décrite dans les brevets US-A-4,683,195, US-A-4,683,202 et US-A-4,800,159, et sa dérivée RT-PCR (Reverse Transcription PCR), notamment dans un format en une étape, tel que décrit dans le brevet EP-B-0.569.272,
• LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A- 0.201.184,
• RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A-90/01069,
• 3SR (Self Sustained Séquence Rephcation) avec la demande de brevet WO- A-90/06995,
• NASBA (Nucleic Acid Séquence- Based Amplification) avec la demande de brevet WO-A- 91/02818, et • TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5,399,491.
• RCA (Rolling Circle Amplification (US-6,576,448).
On parle alors d'amplicons pour désigner les acides nucléiques générés par une technique d'amplification enzymatique. Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison pour peu qu'au moins un phosphate soit présent dans l'acide nucléique.
Par « polypeptide », on entend un enchaînement d'au moins deux acides aminés. Par « acides aminés », on entend :
• les acides aminés primaires qui codent pour les protéines,
• les acides aminés dérivés après action enzymatique, comme la trans-4-hydroxyproline,
• les acides aminés naturels, mais non présents dans les protéines comme la norvaline, la N-méthyl- L leucine, la Staline (voir Hunt S. dans Chemistry and Biochemistry of the amino acids, Barett G.C., éd., Chapman and Hall, London, 1985), et
• les acides aminés protégés par des fonctions chimiques utihsables en synthèse sur support sohde ou en phase liquide et les acides aminés non naturels.
Le terme «haptène » désigne des composés non immunogènes, c'est-à-dire incapables par eux-mêmes de promouvoir une réaction immunitaire par production d'anticorps, mais capables d'être reconnues par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions connues, en particuher par immunisation avec un conjugué haptène-protéine. Ces composés ont généralement une masse moléculaire inférieure à 3000 Da, et le plus souvent inférieure à 2000 Da et peuvent être par exemple des peptides glycosyles, des metabohtes, des vitamines, des hormones, des prostaglandines, des toxines ou divers médicaments, les nucléosides et nucléotides. Le terme « anticorps » inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique, et des fragments d'anticorps tels que des fragments Fab ou F(ab')2. Le terme « antigène » désigne un composé susceptible de générer des anticorps. Le terme « protéine » inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines, aussi bien fibreuses que globulaires sous leur forme conformationnehe caractéristique. Avantageusement la molécule biologique possède un groupe phosphate, c'est-à-dire ayant au moins un motif :
Figure imgf000020_0001
qui est soit présent natureUement dans la molécule biologique, soit peut être introduit par exemple par modification chimique ou enzymatique. Des exemples de modification chimique pour les protéines sont données dans «Chemistiy of protein conjugation and cross linking », S.S. Wong, CRC Press, 1991.
De préférence, la molécule biologique est un acide nucléique.
Certains réactifs avantageux de l'invention sont : a) de formule (10) :
Figure imgf000020_0002
b) de formule (11) :
Figure imgf000020_0003
c) de formule (12) :
Figure imgf000020_0004
dans lesquelles :
• R1 représente H ou un groupe alkyle ou aryle ou aryle substitué,
• R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables rehés entre eux par au moins une structure multimérique, • L est un bras de haison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux haisons covalentes, et
• n un nombre entier égal à 0 ou 1. De préférence, le réactif de marquage a la : a) formule (13) :
Figure imgf000021_0001
b) formule (14)
Figure imgf000021_0002
c) formule (15)
Figure imgf000021_0003
dans lesquehes R1 représente un groupe méthyle ou phényle.
Quels que soient la variante et le mode de réahsation du réactif, L peut comprendre un motif -(NH-CH2-CH2)-, répété de 1 à 20 fois, préferentiehement de 1 à 10 fois, et encore plus préferentiehement de 2 à 5 fois. Par « dérivé de l'hydrazine », on entend une molécule possédant la fonction NH2-NH-. Le tosylhydrazine est un exemple d'un tel dérivé. La transformation de l'hydrazone en diazométhyle est réalisée par les méthodes usuelles, en particuher l' oxydation par MnO2. D'autres méthodes sont utihsables comme décrites dans X. Creary, Organic Synthèses, Wiley : New York, Coll. Vol. NE, p438-443, 1990; H. Zollinger, Diazo Chemistiy π, VCH, Weinheim, p34-47, 1995; T. L. Holton and H. Shechter, J. Org. Chem., 60, 4725-4729, 1995. Dans le cas de l'utilisation d'un dérivé tosylhydrazine, la méthode est décrite dans X. Creary, Organic Synthèses ; Wiley : New York, Coll. Vol. Vu, p438-443, 1990.
Dans un mode particuher de l'un quelconque des procédés de synthèse, ledit procédé comprend : • une étape supplémentaire de protection de la fonction cétone ou aldéhyde (dans le cas où R1 est H) du composé (9), et • une étape supplémentaire ultérieure de déprotection de ladite fonction cétone ou aldéhyde. Cette protection est réalisée par un groupement acétal par exemple. La déprotection est effectuée par un moyen approprié comme en miheu acide pour le groupement acétal. L'homme du métier détermine en fonction des composés à quehe étape de synthèse ces deux étapes de protection et de déprotection interviennent
Dans le cas de l'amplification de signal, le procédé de synthèse est similaire à ceux évoqués précédemment Le précurseur du marqueur peut avoir la formule (17) ci- dessous.
Figure imgf000022_0001
dans laquelle GPi et GP2 représentent deux groupements protecteurs de fonction a iné identiques ou différents et p est un nombre entier compris entre 1 et 10, avantageusement 2 et 6 de préférence 4. Avantageusement, GPi et GP2 sont différents pour pouvoir additionner plusieurs motifs comme cela est exphqué ci- dessous. Des exemples de groupement protecteurs GP1 ou GP2 utihsables dans la présente invention sont données dans T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2eme édition, John Wiley and Sons, New York, 1991, préferentiehement ceux couramment utihsés en synthèse peptidique comme Boc (tertiobutyloxycarbonyle), Fmoc (9- fluorénylméthylèneoxycarbonyle), Cbz (carboxybenzyle) ou A oc (ahyloxycarbonyle). En particuher GP1 et GP2 sont respectivement les groupements protecteurs Boc et Fmoc. La réaction ente ce précurseur qui possède une fonction carboxyhque et le dérivé de formule (18), ci- après a heu en présence d'un agent de couplage pour former la haison amide.
Figure imgf000023_0001
Après déprotection dans des conditions usuelles d'un des deux groupements protecteurs, par exemple Fmoc avec une base telle que la pipéridine, la fonction aminé hbérée est utilisée pour coupler une autre molécule de formule (17). Ce processus est répété autant de fois que nécessaire pour obtenir une multitude de fonctions NH2 protégé par un groupement protecteur par exemple une fonction Boc. Le motif est additionné entre une (1) et cent (100) fois, de préférence entre une (1) et vingt (20) fois. On fait réagir de l'hydrazine sur la fonction cétone provenant du dérivé phénylcétone pour former une hydrazone puis on oxyde en présence de MnO2 pour former un résidu diazométhyle. Puis après déprotection de la fonction aminé portant le groupement Boc, un traceur, par exemple une biotine activée par un groupement N-hydroxysuccinimide, est couplé sur les fonctions aminés pour conduire à un réactif dont le motif R2- (L)n- est celui de la formule (5). C'est un autre objet de la présente invention que de décrire un procédé, ainsi que les produits obtenus par ce procédé, pour le marquage d'une molécule biologique, en particuher un acide nucléique, comprenant la mise en contact en solution, dans une solution homogène sensiblement aqueuse, d'une molécule biologique et d'un réactif de marquage selon l'invention. Par « solution sensiblement aqueuse », on entend une solution contenant au moins 50% d'eau. Cette solution contient de préférence des sels comme une solution tampon. Par « solution homogène », on entend une solution monophasique telle qu'une solution eau DMSO par opposition à une solution biphasique telle qu'une solution eau chloroforme. Les conditions particulières pour les réactions de marquage varient en fonction des molécules biologiques et du marqueur. En ce qui concerne les acides nucléiques, un pH compris entre 5 et 8 permet un marquage efficace. En particuher, un pH compris entre 5,5 et 7,0 est préféré pour l'ensemble des réactifs de l'invention. Avec le réactif de formule (11), la gamme de pH est plus large pour le marquage. Une bonne efficacité de marquage est obtenue pour un pH compris entre 3 et 8 pour ce réactif.
Ce procédé de marquage et de fragmentation est particuhèrement utile dans le cas où l'acide nucléique marqué doit s'hybrider avec une multitude d'acides nucléiques, notamment ohgonucléotides, fixés sur le support sohde à une position prédéterminée pour former une puce à ADN. Par "puce à ADN", on entend un support sohde de dimension réduite où sont fixés une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées. En effet, la densité des acides nucléiques fixés sur le support sohde impose des contraintes stériques importantes lors de l'hybridation et la fragmentation permet d' amehorer cette étape d'hybridation. Des exemples de ces puces à ADN sont donnés par exemple dans les publications de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, ρ40-44, 1998; F. Ginot, Hu an Mutation, 10, pl-10, 1997 ; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1(3), ρl83-200, 1996 ; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 22(15), p2915-2921, 1994 ; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 16, p541-546, 1998.
La fragmentation et le marquage s'effectuent en une étape ou en deux étapes et le marquage peut s'effectuer indifféremment avant, après ou simultanément avec la fragmentation. De préférence, le marquage et la fragmentation s'effectuent simultanément c'est- à- dure que les réactifs nécessaires à ces deux étapes sont mis ensemble en solution homogène sensiblement aqueuse avec l'acide nucléique par exemple. C'est notamment le cas pour la fragmentation chimique ou enzymatique. Dans le cas de la fragmentation mécanique par un moyen physique, «marquage et fragmentation s' effectuant simultanément » signifie que le moyen physique est apphqué à une solution homogène sensiblement aqueuse contenant au moins les acides nucléiques et le réactif de marquage.
La fragmentation de l'acide nucléique s'effectue par voie enzymatique, chimique ou physique. La fragmentation par voie enzymatique de l'acide nucléique est réalisée par exemple par des nucléases. La fragmentation par voie physique de l'acide nucléique est réalisée par exemple par sonication ou par radiation. La fragmentation par voie chimique, si l'acide nucléique est un ARN, est réalisée par les méthodes usuelles (voir par exemple Chem. Rev, 98, 961-990, 1998 de Oivanen M. et al). Les complexes de métaux, tels que décrits dans la revue de G. Pratviel et al, Adv. Qrg. Chem., 45, p251-312, 1998 ou la revue G. Pratviel et al, Angew. Chem. Int. Ed. EngL, 34, p746- 769, 1995, sont utihsables pour la fragmentation de l'ADN ou l'ARN. Dans un premier mode de réahsation, la fragmentation chimique d'ARN est réalisée par des cations métalliques associés ou non à un catalyseur chimique. Dans ce cas, les cations métalliques sont des ions Mg +, Sr2*, Ba2+, Pb2+, Zn2+, Cd2+, Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Ru3+, Ce3+, Eu3+, Tb3+, Tm3+, Yb3+ ou Lu3+, le catalyseur chimique est constitué par de l'imidazole, un analogue substitué, par exemple le Nméthyl-imidazole, ou toute molécule chimique ayant une affinité pour l'ARN et portant un noyau imidazole ou un analogue substitué. Les conditions de fragmentation à l'aide de métaux sont bien décrites dans la demande de brevet WD- A- 99/65926. Avantageusement les métaux sont M +, Mn2+, Zn2+, Tb3+ ou Ce3+, de préférence Mg 2+, Mn2+, Zn2+. Des conditions efficaces de fragmentation sont obtenues avec une concentration en cation métallique comme Mn++ ente 2 et 100 mM, une concentration en imidazole ente 2 et lOOmM. Des conditions spécialement efficaces sont obtenues avec une concentration en cation comme Mn++ comprise ente 3 et 15 mM, et une concentration en imidazole comprise ente 20 et 50 mM, en particuher 30 mM. Le pH de la réaction doit être légèrement basique. Avantageusement le pH est compris entre 8,5 et 9, ce qui représente un compromis très intéressant pour réaliser la combinaison marquage et fragmentation avec de l'ARN. Dans un deuxième mode de réahsation, la fragmentation chimique de l'ARN est réalisée par action d'une polyamine, comme la spermine, la putescéine ou la cadavérine. Des concentrations de 5 à 100 mM permettent la fragmentation. Celle-ci est totale à partir de 10 mM de polyamine. Dans un troisième mode de réalisation, la fragmentation chimique de l'ARN est réalisée par action d'une nucléase artificielle (voir G. Pratviel et al, Adv. Inorg. Chem.,45, p251-312, 1998; D. S. Sigman et al. Chem. Rev., 93, p2295-2316, 1993), comme la 1,10-phénanthroline associée à un cation métallique comme le fer, le cuivre ou le zinc. Ces cations proviennent respectivement de FeSO ou CuCt ou'ZnQ. en solution. Des concentrations ente 2 et 50 mM de 1,10-phénanthroline sont utilisées pour la fragmentation d'ARN en particuher entre 4 et 10 mM.
La fragmentation par voie chimique de l'ADN est réalisée en mettant en présence l'acide nucléique avec un moyen chimique de création de site abasique. La formation d'un site abasique résulte de la coupure de la haison N-glycosidique qui he le sucre 2-désoxyribose à la base nucléique. h s'agit d'un dépurination par la perte d'une purine (guanine, adénine), chargée négativement ou d'une dépyrimidination dans le cas de la perte d'une pyrimidine (cytosine, thymine), chargée positivement Cette dépurination est spontanée dans des conditions physiologiques (pH 7,4 à 37°C) mais la vitesse de la réaction est très faible de l'ordre de 3.10"11 dépurination par seconde, c'est-à-dire inutilisable pour une fragmentation efficace. Pour augmenter la vitesse de réaction, on utilise des agents alkylants qui fragilisent la haison N-glycosidique ou des uracile-ADN glycosilases sur des
ADN incorporant des uracyles. Le site abasique obtenu par dépurination ou dépyrimidation est très instable. La fragmentation au niveau de ce site est obtenue à température ambiante en miheu basique. En miheu acide, la température élevée accélère également cette fragmentation. L'utilisation de molécules capables d'initier le phénomène de β -élimination accélère aussi la fragmentation. Un mode préféré de réahsation de la fragmentation est obtenu par l'utilisation d'un pH acide c'est-à-dire un pH inférieur à 5. Avantageusement le pH est de 3. Un tampon formiate de sodium à pH 3 permet de fragmenter de manière efficace selon l'invention. Ce tampon est compatible avec les conditions de marquage en une étape comme cela sera démontré dans les exemples. Encore plus avantageusement un miheu acide (HCl, carbonate, H2SO ) est utilisé.
Dans un mode particuher de la présente invention et dans le but d'augmenter encore la fragmentation, l'acide désoxyribonucléique contient au moins une base modifiée susceptible de générer un site abasique plus facilement
Diverses bases modifiées sont utihsables comme les N7-alkyl purines, les N3-alkyl purines, les O6- alkyl purines, les 8-bromopurines, les 8-thiopurines, les 8-alkylthiopurines, les 8 azidopurines ou les 8-alkylsulfonylpurines.
Dans le cas où l'acide nucléique à marquer serait généré par une technique d'amplification enzymatique comme la PCR, l' utilisation d'une 8-bromopurine permet d'avoir une incorporation efficace pendant l'amplification, ce qui facilite d'autant le procédé de fragmentation et de marquage selon l'invention, tout en conservant une sensibilité exceUente pour l'étape d'amplification enzymatique.
La présente invention décrit une molécule biologique marquée et en particuher un acide nucléique marqué, susceptible d'être obtenu(e) par l'un quelconque des procédés selon l'invention. La présente invention concerne aussi un kit de détection d'une molécule biologique, en particuher un acide nucléique cible comprenant un réactif de marquage selon l'invention. En fonction des applications du kit, d'autres éléments comme par exemple, des moyens de lyse (micro- organismes et/ou cellules) et/ou des moyens de concentration (comme de la sihce ou des particules magnétiques) et/ou des moyens d'amplification enzymatique sont incorporés dans le kit. L'invention concerne l'utilisation d'une molécule biologique marquée, en particulier un acide nucléique marqué tel que défini ci-dessus, comme sonde de détection d'une molécule biologique cible, et en particulier d'un acide nucléique cible.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique tel que défini ci- dessus, comme cible marquée pouvant se fixer sur une sonde de capture.
Pour permettre la détection et/ou la quantification et/ou la purification de la molécule biologique cible, la molécule biologique marquée est capable de former un complexe avec la molécule biologique cible. A titre d'exemple, pour la mise en évidence d'une molécule cible de type acide nucléique, l'acide nucléique marqué est suffisamment complémentaire de la cible pour s'hybrider spécifiquement en fonction des conditions de réaction, et notamment de la température ou de la salinité du milieu réactionnel. Le procédé de détection est apphcable pour le séquençage, le profil d'expression des ARN messagers ou le criblage de mutations à des fins de recherche ainsi que le criblage de drogues dans l'industrie pharmaceutique, le diagnostic de maladies infectieuses ou génétiques, le contrôle alimentaire ou industriel. La tendance en matière de diagnostic et notamment pour les maladies infectieuses (SIDA ou Tuberculose par exemple) est de baisser le niveau de sensibilité, jusqu'à la détection d'une molécule unique dans un échantillon qui peut représenter plusieurs millilitres dans le cas d'un prélèvement liquide type sang ou urine ou liquide céphalo-rachidien. Ce niveau de sensibilité ne peut être obtenu que si toutes les étapes depuis le prélèvement de l'échantillon jusqu'au rendu de résultat sont optimisées. Les différents moyens de l'invention permettent cette optimisation sans difficulté car les réactifs, méthodes et procédés de l'invention sont apphcables de manière très large à différentes molécules biologiques. En particuher dans le cas où une étape d'amplification enzymatique est nécessaire pour obtenir la sensibilité nécessaire (infection virale ou bactérienne comme VIH, VHC ou Tuberculose), un procédé de marquage et/ou de fragmentation, comme décrit dans la présente invention, permet de ne pas affecter la sensibilité de la technique d'amplification, soit parce qu'il n'est pas nécessaire de remplacer les désoxyribonucléotides ou les ribonucléotides utihsés dans la technique d'amplification enzymatique, soit parce ce que les ribonucléotides ou désoxyribonucléotides incorporés n'altèrent pas la sensibilité. La chimie de greffage décrite dans la présente invention possède des caractéristiques telles, du point de vue réactivité et spécificité, que d'autres applications sont décrites ci- après : • Dans un premier mode de réahsation, cette chimie de greffage est apphquée à la fixation covalente d'acides nucléiques sur un support sohde.
• Dans une première variante du procédé, un précurseur de la fonction diazométhyle, tel une cétone ou hydrazine comme décrit précédemment est introduit pendant la synthèse chimique et la fonction diazométhyle est introduite sur les acides nucléiques dans une deuxième étape.
• Dans une deuxième variante préférée du procédé, les fonctions diazométhyles sont introduites sur le support sohde et les acides nucléiques sont fixés sur le support sohde par l'intermédiaire des phosphates des acides nucléiques et en particuher des phosphates terminaux (5' ou 3'). L'introduction de phosphate à l'extrémité 3' ou 5' des acides nucléiques est bien connue
(voir « Protocols for Ohgonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties » édité par S. Agrawal, Humana Press, Totowa, New Jersey).
Dans un mode de réahsation particuher d'un tel support sohde, un réactif de marquage portant un hgand, en particuher un haptène comme la biotine ou l'abiétane, est fixé sur le support sohde sur lequel est fixé de manière covalente ou par adsorption un anti- ligand, comme la steptavidine ou un anticorps par exemple. Ces supports sohdes sont bien connus dans l'état de la technique et sont même commercialement disponibles (plaque de microtitration- steptavidine ou latex- streptavidine par exemple). La fonction du marqueur n'est plus dans ce cas de permettre la détection mais de permettre la fixation du réactif de marquage sur le support sohde. La fonction diazométhyle est alors disponible pour réagir sur des acides nucléiques. Les dérivés de formule (13), (14), (15) ou le dérivé PDAM sont des exemples de réactifs utihsables pour la fabrication d'un tel support sohde. La technique des anticorps monoclonaux permet de préparer des anticorps contre un grand nombre de marqueur comme la fluorescéine ou un dérivé du Cy5. L' omme du métier peut mettre en œuvre un support sohde avec les réactifs de marquage de la présente invention sans difficulté excessive par ce mode de préparation indirect du support sohde dans lequel une réaction hgand/anti-hgand est utilisée pour fixer la fonction diazométhyle sur le support sohde. Un deuxième mode de réahsation du support sohde concerne les supports particulaires comme les latex. Différents modes de polymérisation peuvent être utihsés pour préparer les particules portant une fonction diazométhyle à partir d'un monomère fonctionnel polymérisable portant soit une fonction diazométhyle soit préferentiehement une fonction précurseur de la fonction diazométhyle comme un aldéhyde ou une cétone et notamment : • Polymérisation à réacteur fermé appelée «batch» : les monomères sont introduits dans le réacteur avant le début de réaction avec les autres ingrédients et sans ajout ultérieur. En raison de la différence de réactivité des monomères, ce procédé conduit souvent à F apparition d'une dérive de composition. Cehe-ci se manifeste par l'obtention de macromolécules ayant des compositions qui varient considérablement en fonction de la conversion. Cette méthode est peu efficace pour l'incorporation en surface car une partie importante du monomère fonctionnel risque d'être perdue soit à l'intérieur des particules, soit sous forme de polymère hydrosoluble. Lorsque la copolymérisation est effectuée en «batch » avec des monomères de nature polaire, on obtient des particules plus petites, en grand nombre, mais avec une conversion limitée. Ce comportement est hé à l'importante solubilité dans l'eau de ces monomères, et h est attribué à la prépondérance du mécanisme de nucléation homogène.
• Polymérisation en semi- continu : une partie au moins des monomères est introduite dans le réacteur sur une période comprise entre le début de la réaction et la fin de celle-ci. Ce rajout peut être effectué à une vitesse fixe ou bien suivant un profil donné. Le but est de contrôler l'addition du mélange de monomères de façon à obtenir un copolymère de composition contrôlée (contrôle de la composition de l'interface); c'est ainsi qu'on se place souvent dans des conditions d'addition telles que la vitesse de polymérisation soit plus grande que celle d'addition.
• Polymérisation par addition différée appelée « shot » : une fois que la réaction de polymérisation est en cours, le monomère fonctionnel seul, ou en présence du monomère de base, est introduit dans le système d'une façon contrôlée. Le succès de l'opération dépend donc du degré de connaissance préalable de la cinétique de copolymérisation. C'est une méthode efficace pour favoriser l'incorporation superficielle. La sélection des conditions expérimentales (degré de conversion au moment de l'addition, composition et concentration du mélange des monomères) permet d'optimiser les rendements de surface. • Polymérisation sur semence : elle consiste à introduire le monomère fonctionnel dans le système contenant un latex déjà constitué et parfaitement caractérisé. Le monomère fonctionnel peut être additionné seul ou en mélange avec le monomère de base de la semence, en une étape ou en semi-continu. Les techniques de polymérisation sur semence, polymérisation par addition différée, polymérisation en semi-continu sont préférées car elles conduisent à un maximum d'incorporation du dérivé portant le précurseur de la fonction diazométhyle en surface. Des exemples de particules portant des fonctions aldéhydes sont donnés par exemple dans B. Charleux et al, Die Makromolecular Chem, 193, p 187 et p. 205, 1992 ou dans le brevet EP-B-0.350.407.
Un troisième mode de réahsation du support sohde consiste à disposer d'un support sohde comprenant une première fonction réactive nucléophile ou électrophile, comme par exemple NH2, SH, OH, O~NH2, alkylcétone, aldéhyde, isocyanate, isothiocyanate, maléimide, halogénure d' alkyle, ester de N-hydroxysuccinimide, tosylate, puis à faire réagir un intermédiaire de fixation, comportant une fonction réactive complémentaire de la première fonction réactive du support sohde. Cette réaction ente le support sohde et l'intermédiaiare de fixation s'effectue en présence, éventuehement d'un agent de couplage pour former une haison covalente.
Un tel support sohde comprenant au moins une fonction diazométhyle, selon les différents modes de réahsation décrits ci- dessus, en particuher un support sohde sur lequel est fixé indirectement un réactif de marquage de l'invention, est aussi un objet de la présente invention ainsi que le support sohde comprenant des acides nucléiques fixés sur le support sohde par l'intermédiaire des fonctions diazométhyles. Une première application d'un tel support sohde est la fabrication de puces à ADN. Des méthodes existent pour répartir des acides nucléiques sur le support sohde en des positions discrètes et prédéterminées. Le brevet US-A-6,110,426 propose une méthode pour réaliser ces puces à ADN à l'aide d'un capillaire que l'on met en contact sur une surface sohde pour délivrer un volume contrôlé de liquide. Un contact effectif a heu entre l'extrémité du capillaire et le support sohde pour que la goutte se dépose par capillarité. De même, le brevet US-A-6,083,763 décrit un ensemble de capillaires coulissant dans un dispositif de façon à compenser les différences de hauteur de chacun d'eux. Us sont amenés au contact d'une surface plane pour le dépôt par capillarité d' ohgonucleotides spécifiques. Le brevet US-A-6,083,762 propose une système de répartition de gouttes comprenant un microdispenseur couplé à un transducteur piézo-électrique pour éjecter des volumes de goutte inférieurs au nanohtre sur une surface sohde. Un résultat semblable est obtenu en appliquant une source chaude sur la paroi d'un capillaire pour former une buhe qui éjecte un volume défini de solution (voir T. Okamoto et al., Nature Biotechnology, 18, p438-441, 2000). La fonction diazométhyle permet ainsi de greffer de manière covalente les acides nucléiques sur le support. Le greffage est simple, la haison est stable, par rapport à l'adsorption notamment et la sélectivité de la réaction par rapport au phosphate terminal permet de réaliser un couplage orienté de l'acide nucléique sur le support sohde, ce qui facilite d'autant les étapes d'hybridation ultérieures en diminuant l'encombrement stérique.
Une deuxième application d'un support sohde selon l'invention est la purification des acides nucléiques. Dans le cas de la purification, cette purification est soit directe (le support sohde porteur de fonctions diazométhyle réagit avec les acides nucléiques à purifier) soit indirecte (des acides nucléiques de capture sont fixés sur le support sohde). Ces acides nucléiques de capture sont suffisamment complémentaires de la cible à capturer pour s'hybrider avec le degré de spécificité souhaité et c'est le complexe « acides nucléiques de capture/support sohde » qui permet la purification des acides nucléiques cibles. Le support sohde est de préférence sous forme dispersée pour l'utilisation en purification comme des particules de latex, par exemple des particules magnétiques. Par «étape de purification », on entend notamment la séparation entre les acides nucléiques des micro- organismes et les constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse qui précède la purification des acides nucléiques. Ces étapes de lyse sont bien connues à titre d'exemple indicatif, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrite dans les demandes de brevet :
- WO- A-00/60049 sur la lyse par sonication, - WO- A-00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique,
- WO- A- 99/53304 sur la lyse électrique, et
- WO-A-99/15621 sur la lyse mécanique.
L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les traitements par des agents chaotropiques, tels que les sels de guanidium (brevet US- A-5,234,809). Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques (voir à ce sujet les brevets US-A-4,672,040 et US-A- 5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques, qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particuhèrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réahsation particuhèrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet WO-A- 97/45202 et WO-A-99/35500.
Le terme "support sohde" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut être fixé un acide nucléique. Des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuehement modifiés chimiquement peuvent être utihsés comme support sohde, notamment les polysaccharides, tels que les matériaux à base de cehulose, par exemple du papier, des dérivés de cehulose tels que l'acétate de cehulose et la nitrocellulose, ou le dextran ; des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques tehes que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la sihce, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalhques, des gels, etc. Le support sohde peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane, d'une particule ou d'une plaque sensiblement plane de verre ou silicium ou dérivés.
L'invention concerne enfin un procédé de capture d'acides nucléiques comprenant les étapes suivantes : • on dispose d'un support sohde sur lequel est fixé directement ou indirectement au moins une molécule comprenant une fonction diazométhyle, • on met en contact un échantillon biologique susceptible de contenir des acides nucléiques hbres, et • on lave le support sohde où la (ou les) molécule(s) sont fixée(s) de manière covalente au moins à un acide nucléique. Des informations complémentaires peuvent être trouvées dans une autre demande de brevet de la Demanderesse, WO02/090584, déposée sous priorité du 4 mai 2001.
Les exemples et figures ci-joints représentent des modes particuliers de réahsation et ne peuvent pas être considérés comme limitant la portée de la présente invention. La figure 1 représente les formules développées de différents réactifs utihsés dans la présente invention ainsi que l'abréviation les désignant (o- signifie ortho, m- meta et p- para). La figure 2 représente la valeur moyenne du signal et le pourcentage de similarité de la m bio-TETA-PMDAM en fonction de sa concentration pour rpoB.
Exemple 1 : Synthèse du réactif de référence : éfa-BioPMDAM
• Composé biotine meta- acétophénone la : On solubilise la D-biotine (1,0 gramme (g), 4,1 milhmoles (mmol)) dans 45 millilitres (mL) de DMF anhydre à chaud. On refroidit à 0°C sous argon, puis on ajoute successivement la N- méthylmorpholine (590 microlitres (μL), 5,33 mmol) et le chloroformiate dïsobutyle (840 μL, 6,60 mmol). On laisse sous agitation pendant 30 minutes (min), puis on ajoute la 3-aminoacétophénone (824 mg, 6,10 mmol) et la N-méthylmorpholine (480 μL, 4,35 mmol) dans 10 mL de DMF. La solution est maintenue sous agitation à 0°C pendant 2 heures (h), puis on évapore à sec. On reprend le résidu dans 3 mL de MeOH, puis on ajoute 50 mL d'eau. Le précipité obtenu est filtré, lavé avec de l'eau, du CH2G2 et de l'éther pour donner 1,2 g (80 %) de produit la brut Unerecristalhsation dans le couple MeOH-H2O donne la (1,01 g, 70 %) sous forme d'une poudre blanche.
F 145°C. - IR (KBr) : 3280, 2931, 2857, 1691, 1590,1540, 1487, 1434, 1298, 1266 cm
RMΝ 1H (300 MHz, DMSO-d6) δ = 1,3-1,7 (m, 6 H) ; 2,33 (t, /= 8 Hz, 2 H) ; 2,55 (s, 3 H) ; 2,58 ; (d, J ≈ 12 Hz, 1 H) ; 2,83 (dd, J = 12 et 5 Hz, 1 H) ; 3,13 (m, 1 H) ; 4,15 (m, 1 H) ; 4,31 (m, 1 H) ; 6,34 (s, 1 H) ; 6,41 (s, 1 H) ; 7,44 (t, J= 8 Hz, 1 H) ; 7,64 (d, J= 8 Hz, 1 H) ; 7,85 (d, / = 8 Hz, 1 H) ; 8,17 (s, 1 H) ; 10,05 (s, 1 H). - MS (FAB/glycérol), m/z: 362 [M+H|+.
• Composé meta- hydrazone 2a :
Une solution de la (500 mg, 1,38 mmol) et d'hydrazine monohydrate (200 μL, 4,15 mmol) dans de l'éthanol absolu (8 mL) est chauffée à reflux pendant 2 h. Après refroidissement à température ambiante, le précipité blanc est filtré, lavé avec de l'eau, puis avec de l'éther et séché. On obtient ainsi 385 mg (74 %) de produit 2a sous forme d'une poudre blanche.
F 185°C. - IR (KBr) : 3298, 2931, 2857, 1698, 1665, 1626, 1541, 1494, 1470, 1446, 1330, 1265 cm1. - RMΝ 1H (300 MHz, DMSO-d6) δ = 1,3-1,7 (m, 6 H) ; 1,98 (s, 3 H) ; 2,26 (t, J= 8 Hz, 2 H) ; 2,56 ; (d, J = 12 Hz, 1 H) ; 2,81 (dd, /= 12 et 5 Hz, 1 H) ; 3,11 (m, 1 H) ; 4,13 (m, 1 H) ; 4,29 (m, 1 H) ; 6,39 (s, 3 H) ; 6,42 (s, 1 H) ; 7,22 (m, 2 H) ; 7,50 (d, /= 8 Hz, 1 H) ; 7,84 (s,
1 H) ; 9,82 (s, 1 H). - MS (FAB/glycérol), m/z: 376 [M+H]+. • Composé meta- diazométhane 3a :
On solubilise 2a (180 mg, 0,48 mmol) dans 2 mL de DMF. On ajoute alors MnO2 (340 mg, 3,9 mmol). Après 30 minutes d'agitation à température ordinaire, le mélange est filtré à travers un entonnoir fritt contenant de la célite (épaisseur : 0,5 cm) et des tamis moléculaires en poudre 3 A (0,5cm). Le mélange réactionnel est concentré jusqu'à un volume d'environ 0,5 mL, puis 5 mL d'éther sont ajoutés. Le précipité résultant est filtré, lavé à l'éther puis séché. Le composé 3a (170 mg, 95 %) est obtenu sous forme d'une poudre rose.
F 160°C. - IR (KBr) : 3278, 2935, 2859, 2038, 1704, 1666, 1605, 1577, 1536, 1458, 1430,
1263 cm'1. - RMN XH (300 MHz) δ = 1,3-1,7 (m, 6 H) ; 2,11 (s, 3 H); 2,28 (t, / = 8 Hz, 2 H); 2,57 ; (d, J = 12 Hz, 1 H) ; 2,81 (dd, J = 12 et 5 Hz, 1 H) ; 3,11 (m, 1 H) ; 4,13 (m, 1 H) ; 4,29 (m, 1 H) ; 6,33 (s, 1 H) ; 6,41 (s, 1 H) ; 6,60 (m, 1 H) ; 7,25 (m, 3 H) ; 9,84 (s, 1 H)).
Exemple 2 : Synthèse du réactif N-(3,6,9-triammenonanyl)-biotinamide (Bio-TETA) (1) :
La D-biotine (2,80 g, 11,40 mmol) est dissoute dans 30 mL de DMF anhydre. L'ajout du carbonyldiimidazole (1,5 éq. ; 2,78 g) provoque après quelques minutes la formation d'un précipité.
Après 30 min d'activation, la suspension qui résulte est ajoutée doucement sur la triéthylènetétramine (2 éq. ; 5,00 g) en suspension dans 20 mL de DMF. La réaction est laissée 2h sur bain d'huile à
60°C.
Le produit est purifié par chromatographie flash sur gel de sihce avec comme éluant
CHaCli MeOH/NHtOH 20 : 80 : 3. Après évaporation des fractions concernées, on obtient 1,94 g de produit en forme d'une poudre blanche (46 %). RMN-1H (200 MHz, DMSO- d6) δ = 7,75 (s, IH, -NH-CO-) ; 6,40 (d, 2H, -NH- biot) ; 4,30 (t,
IH, -CH- biot) ; 4,15 (d, IH, -CH- biot) ; 3,30 (m, 12H, -ÇJ^-NH-) ; 3,11 (m, IH, -CH-S-) ;
2,8 (dd, 2H, -CH2-S-) ; 2,55 (m, 5H, -NH-CH2- & -NH2) ; 2,04 (t, 2H, -CH2-CO-) ; 1,52 (m,
6H, -CH2-). Acide N-(3'-acétophényl)-succinami ue (ACBA) (2)
La 3-aminoacétophénone (5,0 g ; 37 mmol) est dissoute dans 50 mL d'acétonitrile anhydre sous argon. On ajoute l'anhydride succinique (1,3 éq. ; 4,62 g) et on laisse réagir une heure sous argon. Le produit 2 apparaît en forme de précipité. Après filtration et lavage à l'éther du précipité, on obtient 7,29 g de poudre blanche (84 %).
RMN-1H (200 MHz, DMSO-d6) δ = 12,10 (s, IH, -OH) ; 10,17 (s, IH, -NH-) ; 8,19 (s, IH) ; 7,82 (d, IH) ; 7,66 (d, IH) ; 7,50 (t, IH) ; 2,56 (m, 7H, -(CH2)2- et-CH3).
N-(3'-acétophényl)-N'-(3,6-diamine-9-biotinoylaminononanyl)-succinamide (Bio-(TETA)-AP) (&
L'ACBA (2) (1 ,03 g ; 4,39 mmol) est dissoute dans 20 mL de DMF anhydre sous argon. Le miheu est refroidi dans la glace, et on ajoute successivement N-méthylmorpholine (1,25 éq. ; 725 μL) et chloroformiate d'isobutyle (1 éq. ; 690 μL) : le miheu devient trouble après 30 min. En parallèle, la Bio-TETA (1) (0,8 éq. ; 1,94 g) est solubilisée à chaud dans 50 mL de DMF et de triéthylamine (0,8 éq. ; 750 μL). Ehe est ajoutée à l'ACBA activée à 0°C, pendant 30 min. On laisse ensuite à température ambiante sur la nuit La purification se fait par chromatographie flash sur gel de sihce avec comme éluant
Figure imgf000037_0001
85 : 30 : 3. Les fractions contenant le produit 3 sont réunies et le solvant évaporé. On obtient 1,01 g de sohde blanc en forme de paillettes (33%). RMN-1H (200 MHz, DMSO- d6) δ = 10,16 (s, IH, Ph-NH-CO-) ; 8,18 (s, IH) ; 7,97 (s, IH, - CO-NH-CHr) ; 7,80 (d, IH) ; 7,85 (s, IH, -CH2-NH-CO-) ; 7,60 (d, IH) ; 7,43 (t, IH) ; 6,38 (d, 2H, -NH- biot) ; 4,3 (t, IH, -CH- biot) ; 4,10 (d, IH, -CH- biot) ; 3,35 (m, 12H, -CHy H-) ; 3,10 (m, IH, -CH-S-) ; 2,80 (dd, 2H, -CH2-S-) ; 2,60 (s, 4H, -CH2-CO-) ; 2,55 (s, 3H, -CO- CH3) ; 2,50 (m, 2H, -CH2-CHrCO-) ; 2,15 (m, 2H, -NH-) ; 1,40 (m, 6H, -CH2-).
N-f3'-(l-hydrazono-ét yl)-phényl]-N'-(3,6-diamine-9-biot oylammononanyl)-succinamide (Bio-(TETA)-Hy) (4)
I^a Bio-(TETA)-AP (3) (1,0 g ; 1,71 mmol) est mise en suspension dans 25 mL d'éthanol à chaud (60°C). A reflux, on ajoute l'hydrazine monohydrate (9 éq. ; 750 μL). La réaction est laissée à reflux pendant 2h, puis refroidie sur glace. Un précipité se forme après quelques moments. Les deux phases sont séparées et le précipité est mis sous vide. On obtient 690 mg d'un sohde floconneux (68%).
RMN-1H (200 MHz, DMSO- d6) δ = 9,95 (s, IH, Ph-NH-CO-) ; 8,0 (s, IH, -CO-NH-CH2-) ; 7,90 (s, IH) ; 7,80 (s, IH, - CH2-NH-CO-) ; 7,5 (d, IH) ; 7,28 (m, 2H) ; 6,41 (s, IH, -NH- biot) ; 6,36 (d, 3H, -NH- biot & -NH2) ; 4,64 (t, IH, -CH- biot) ; 4,30 (d, IH, -CH- biot) ; 3,43 (m, 12H, -ÇHrNH-) ; 3,12 (m, IH, -CH-S-) ; 2,80 (dd, 2H, -CH2-S-) ; 2,60 (s, 4H, -CH2-CO-) ; 2,50 (s, 3H, -CO-CH3) ; 2,10 (m, 2H, -CH2-NH-CH2-) ; 1,50 (m, 6H, -CH2-).
N-f3'-(l-diazo-émyl)-Ohényll-N'-(3,6-diamine-9-biotinoylaminononanyl)-succinamide (m-Bio- (TETA)-PMDAM) {S)
La Bio-(TETA)-Hy (4) (150 mg ; 250,4 μmol) est solubilisée dans 1 mL de DMSO anhydre sous argon. On laisse réagh 30 minutes avec Mnθ2 (s) (15 éq. ; 330 mg) puis on filtre sur fritte n°4 avec de la célite (0,5 cm d'épaisseur) et du tamis moléculaire 3 À (0,5 cm d'épaisseur). 100 μL sont utilisés pour la RMN avec ajout de 380 μL de DMSO-d6 et 20 μL de
Figure imgf000038_0001
On ajuste le volume final à 4,5 mL avec DMSO anhydre et 4% de méthanol. On ahquote dans une boite à gants sous Argon par 250 μL. Le composé est rose fuchsia. Le degré de pureté (contenu en diazométhyle) est contrôlé par RMN 1H et spectrophotométrie UN- vis (pic d'absorbance du diazométhyle à 516 nm). RMΝ-1H (200 MHz, DMSO- d6) δ = 9,93 (s, IH, Ph-NH-CO-) ; 7,3 (s, 3H, EL™-*)*»,) ; 6,6 (s, IH, ; 6,4 (s, IH, -NH- biot) ; 6,3 (s, IH, -NH- biot) ; 4,3 (t, IH, -CH- biot) ; 3,3 (m, 12H, -ÇH2-NH-) ; 3,3 (m, IH, -CH-S-) ; 2,9 (dd, 2H, -CH2-S-) ; 2,5 (4H, -CH2-CO-) ; 2,1 (s, 3H, -CH3) ; 2,0 (m, 2H, -CH2-NH-CH2-) ; 1,50 (m, 6H, -CH2-).
Exemple 3 : Préparation des acides nucléiques ADN et ARN
Exemple 3.1 : Préparation des amplicons ADN : Les amphcons ADN sont générés par PCR à partir de cibles d'ADN génomique Mycobacterium tuberculosis 16S (10+4 copies comme cibles de départ) en utilisant le kit Fast Start de Roche, 0,2 mM de chaque désoxyribonucléotide (d-ATP, d-CTP, d-GTP, d-TTP), 0,3 μM d'amorces et 0,4 μL d'enzyme. Les paramètres de la PCR sont les suivants :
- 95°C : 4 mn puis 35 cycles (95°C : 30 sec ; 55°C : 30 sec ; 72°C : 30 sec) puis 4°C. Les amphcons sont analysés qualitativement par électrophorèse sur gel d'agarose (1,5%, TBE 0,5X). Le volume déposé est de 5 μL et la migration s'effectue durant 20 mn à 100 Volts (V). La visualisation des produits PCR est réalisée sous lampe UV après coloration au bromure d'éthidium. Les conditions pour la culture, l'extraction des Mycobactéries ainsi que les amorces d'amplification sont données dans la demande de brevet WO-A-99/65926.
Exemple 3.2 : Préparation des ARN transcrits :
Les transcriptions sont reahsées à partir de cible PCR (fragment de l'ARN 16S de Mycobacterium tuberculosis) en utilisant le kit MEGAscript d' Ambion : 7,5 mM de chaque nucléotide (ATP, CTP, GTP et UTP) et 2 μL d'enzyme (ARN polymérase). Le temps d'incubation est de 3 heures (h) à 37 °C. Les amorces d'amplification de la PCR portent un promoteur de polymérase T3 ou T7, comme décrit dans la demande WO-A-99/65926 ou dans l'article J. Clin Microbiol. 37(1), p 49-55, 1999, ce qui permet de réaliser la transcription.
Les transcrits sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (1,5% ; TBE 0,5X). Le volume déposé est de 5 μL et la migration s'effectue durant 20 mn à 100V. La visualisation des transcrits est réalisée sous lampe UV après coloration au bromure d'éthidium. Des résultats identiques du point de ^ne de l'invention peuvent être obtenus en utilisant d'autres techniques d'amplification comme la NASBA ou TMA, qui génèrent directement des amphcons ARN.

Claims

REVENDICATIONS
1. Réactif de marquage stable à la température de formule (0)
Figure imgf000040_0001
dans laqueïïe :
• R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué,
• R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables rehés entre eux par au moins une structure multimérique,
• L est un bras de haison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux haisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1,
• R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, N02, Cl, Br, F, I, R2 ~(L)π-Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, - CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle,
• A est un bras de haison comportant au moins une double haison covalente permettant la conjugaison de la fonction diazo avec le cycle aromatique et u est un nombre entier compris ente 0 et 2, préferentiehement de 0 ou 1,
• -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-,
• -Zr représente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-,
• m est un nombre entier compris ente 1 et 10, préferentiehement ente 1 et 3, et • p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préferentiehement ente 1 et 3.
2. Réactif de marquage, selon la revendication 1, de formule (1) :
Figure imgf000041_0001
dans laquelle :
• R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué,
• R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables rehés entre eux par au moins une structure multimérique,
• L est un bras de haison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1,
• R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n- Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, - CO-NH- (CH2)3- (O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle, et
• -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-,
• m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préferentiehement entre 1 et 3, et
• p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préferentiehement entre 1 et 3.
3. Réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que p est inférieur ou égal à m.
4. Réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, de formule (2) :
Figure imgf000041_0002
dans laquelle :
• R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué,
• R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables rehés ente eux par au moins une structure multimérique, • L est un bras de haison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux haisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1,
• R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n-Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, - CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R= alkyle ou aryle, et
• q est un nombre entier compris entre 1 et 10, préferentiehement entre 1 et 3
5. Réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, de formule (3) :
Figure imgf000042_0001
dans laquelle :
• R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué,
• R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multimérique,
• L est un bras de haison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux haisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1 , et
• R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n-Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, - CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle.
6. Réactif, selon la revendication 5, caractérisé par le fait que R2 est consituté par un résidu
D- Biotine de formule (4):
Figure imgf000042_0002
7. Réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que R1 est consituté de : CH3, et R3 et R4 représentent chacun : H
8. Réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle la structure -(L)n- est constituée par :
• la spermine ou N,N-Bis(3-aminopropyl)-l,4-diaminobutane : NH2-(CH2)3-NH-(CH2) -NH- (CH2)3-NH2, ou
• la spermidine ou N-(3-aminopropyl)-l,4-butandiamine : H2N-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2, ou • un dérivé contenant un motif alanine : Mi-CH2-CH2-COOH.
9. Réactif de marquage stable à la température de formule (6) :
Figure imgf000043_0001
dans laquelle : • R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué,
• R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables rehés entre eux par au moins une structure multimérique,
• L est un bras de haison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux haisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, • R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n- Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -Cθ-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, - CO-NH-(CH2)3-(O-CH2~CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle,
• A est un bras de haison comportant au moins une double haison covalente permettant la conjugaison de la fonction diazo avec le cycle aromatique et u est un nombre entier compris ente 0 et 2, préferentiehement de 0 ou 1,
• -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-,
• -ILr représente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-, m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préferentiehement ente 1 et 3, et p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préferentiehement ente 1 et 3.
10. Réactif de marquage, selon la revendication 9, de formule (7) :
Figure imgf000044_0001
dans laquelle :
• R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué,
• R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables rehés entre eux par au moins une structure multimérique, • L est un bras de haison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux haisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1,
• R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)„-Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, - CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle, • -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-,
• -Z- représente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-,
• m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préferentiehement ente 1 et 3, et
• p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préferentiehement ente 1 et 3.
11. Réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que L comprend un motif -(O-CH2-CH2)-, répété de 1 à 20 fois, préferentiehement de 1 à 10 fois, et encore plus préferentiehement de 2 à 5 fois, -Z- étant alors représenté par -NH-, -NHCO- ou - CONH-.
12. Procédé de synthèse d'un réactif de marquage, selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un πarqueur ou d'un précurseur de marqueur possédant une fonction réactive R6, b) on dispose d'un bras de haison de formule (8) :
Figure imgf000045_0001
dans laquelle :
• -Zr représente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-,
• m est un nombre entier compris ente 1 et 10, préferentiehement ente 1 et 3,
• p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préferentiehement entre 1 et 3,
• R7 et R8 représentent deux fonctions réactives identiques ou différentes, c) on fait réagir ensemble la fonction réactive R6 dudit marqueur ou précurseur de marqueur avec la fonction R7 du bras de haison de formule (8) en présence d'au moins un agent de couplage pour former une haison covalente, R6 et R7 étant complémentaires, d) on dispose d'un dérivé de formule (9) :
Figure imgf000045_0002
dans laquelle :
• R1 représente H ou un groupe alkyle ou aryle ou aryle substitué,
• L est un bras de haison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux haisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1,
• R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, N02, Cl, Br, F, I, R2 -(L)„-Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, - CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle,
• -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-,
• A est un bras de haison comportant au moins une double haison covalente permettant la conjugaison de la fonction diazométhyle avec le cycle aromatique et u est un nombre entier égal à 0 ou 1, et
• R9 représente une fonction réactive complémentaire de R8, e) on fait réagir ensemble la fonction réactive B? du dérivé de formule (9) avec la fonction R8 du bras de haison de formule (8) en présence d'au moins un agent de couplage pour former une haison covalente, f) on fait réagir l'hydrazine ou un de ses dérivés sur la fonction cétone ou aldéhyde pour former une hydrazone, et g) on transforme l'hydrazone en fonction diazométhyle à l'aide d'un traitement approprié.
13. Procédé de synthèse, selon la revendication 12, caractérisé par le fait qu'il comprend :
• une étape supplémentaire de protection de la fonction cétone ou aldéhyde du composé (9), et
• une étape supplémentaire ultérieure de déprotection de ladite fonction cétone ou aldéhyde.
14. Procédé pour le marquage d'une molécule biologique, en particuher un acide nucléique, comprenant la mise en contact en solution homogène, dans un tampon sensiblement aqueux, d'une molécule biologique et d'un réactif, obtenu selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
15. Molécule biologique marquée susceptible d'être obtenue par le procédé, selon la revendication 14.
16. Procédé de marquage et de fragmentation d'un acide nucléique simple ou double brin comprenant les étapes suivantes :
• fragmenter F acide nucléique,
• attacher un maïqueur sur au moins un des fragments par l'intermédiaire d'un réactif de marquage choisi parmi les réactifs, obtenus selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, ledit réactif se couplant de manière covalente et majoritaire sur au moins un phosphate dudit fragment
17. Procédé, selon la revendication 16, caractérisé par le fait que le réactif de marquage est choisi parmi les composés de formule (3) :
Figure imgf000047_0001
dans laquelle : • R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué,
• R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables rehés entre eux par au moins une structure multimérique,
• L est un bras de haison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux haisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, et • R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NC , Cl, Br, F, I, R2 -(L)n- Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, - CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle.
18. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 16 ou 17, caractérisé par le fait que la fragmentation et le marquage sont effectués en deux étapes.
19. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 16 à 17, caractérisé par le fait que la fragmentation et le marquage sont effectués en une étape.
20. Procédé, selon l'un quelconque des revendications 18 à 17, caractérisé par le fait que le marquage s'effectue en solution homogène sensiblement aqueuse.
21. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 16 à 20, caractérisé par le fait que la fragmentation s'effectue par voie enzymatique, physique ou chimique.
22. Acide nucléique marqué susceptible d'être obtenu par le procédé, selon l'une quelconque des revendications 16 à 21.
23. Kit de détection d'un acide nucléique cible comprenant un acide nucléique marqué, selon la revendication 22.
24. Support sohde sur lequel est fixé un réactif, selon l'une quelconque des revendications l à 11.
25. Procédé de capture d'acides nucléiques comprenant les étapes suivantes :
• on dispose d'un support sohde sur lequel est fixé directement ou indirectement au moins une molécule biologique, selon la revendication 15, ou un acide nucléique, selon la revendication 22, la molécule biologique ou l'acide nucléique comprenant une fonction diazométhyle,
• on met en contact un échantihon biologique susceptible de contenir des acides nucléiques hbres, et
• on lave le support sohde où la (ou les) molécule(s) sont fixée(s) de manière covalente au moins à un acide nucléique.
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