WO2006075626A1 - 炎症性疾患の検査法および炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法 - Google Patents

炎症性疾患の検査法および炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法 Download PDF

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gene
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toll
polymorphism
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Toshihiro Tanaka
Koichi Ozaki
Aritoshi Iida
Masatsugu Hori
Yusuke Nakamura
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Riken
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    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction

Definitions

  • the present invention relates to a method for examining inflammatory diseases such as myocardial infarction, and a screening method for therapeutic agents for inflammatory diseases.
  • Non-Patent Document 1 or 2 In recent years, with changes in lifestyle, the risk of death from inflammatory diseases, particularly coronary artery diseases such as myocardial infarction has increased (see Non-Patent Document 1 or 2). Therefore, it is desired to develop a method for determining the onset risk at an early stage for these diseases.
  • Coronary artery disease such as myocardial infarction has been proposed to develop due to genetic predisposition, and several methods are known for determining myocardial infarction based on the presence or absence of a gene mutation.
  • a method for determining the risk of developing myocardial infarction by analyzing a polymorphism of the prostacyclin synthase gene is known (see Patent Document 1).
  • Patent Document 1 a method for determining the risk of developing myocardial infarction by analyzing a polymorphism of the prostacyclin synthase gene.
  • TolHike receptor is a single-transmembrane receptor that is isolated as a homologue of Toll, an insect receptor, involved in immune responses (see Non-Patent Document 3). ). It has been known that polymorphisms at several sites of the gene encoding the toll-like receptor are related to asthma (see Non-Patent Document 4). However, the relationship between the polymorphism of toll lycleceptor gene and inflammatory diseases such as myocardial infarction has not been known.
  • Galectin is a protein that binds to galactose.
  • Ten types of galectins are currently known in mammals. Among them, galectin-2 is known to form a noncovalent homodimer consisting of a 14 kDa subunit, and self-aggregates and loses activity in the absence of a reducing agent. In addition, it is known that galectin-2 expression is frequently observed in epithelial cells mainly in the lower small intestine in normal adult tissues, but it has not been known for its detailed physiological function ( Non-patent document 5).
  • Patent Document 1 JP 2002-136291 A Non-Patent Document 1: Nature Medicine, 1997, vol.3, p600-601
  • Non-Patent Document 2 New England Journal of Medicine, 1997, vol.337, pl360-1369
  • Non-Patent Document 3 J. Biol. Chem., Vol. 278, Issue 40, 38105-38108, 2003
  • Non-Patent Document 4 Genes Immun. 2004 Aug; 5 (5): 343-6
  • Patent Document 5 Trends in Glycoscience and ulycotechnology, 1997, vol.9, No.45, p8 7-93
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems. As a result, it was found that a single nucleotide polymorphism of the tollwriter receptor gene is associated with myocardial infarction. Furthermore, since the toll-like receptor has a specific interaction with galectin 2, it was found that screening for substances that change the interaction between the two would provide a therapeutic agent for inflammatory diseases such as myocardial infarction. The present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • the toll-like receptor gene is toll-like receptor 1 gene, and the single nucleotide polymorphism present on the toll-like receptor 1 gene is the base corresponding to the 201st base of SEQ ID NO: 1 or the 197th of SEQ ID NO: 2.
  • the toll-like receptor gene is toll-like receptor 4 gene, and the single nucleotide polymorphism existing on the toll-like receptor 4 gene is a polymorphism of the base corresponding to the 202nd base of SEQ ID NO: 3 (2 )the method of.
  • the toll-like receptor gene is toll-like receptor 1 gene, and the polymorphism of the toll-like receptor 1 gene is the 201st base of SEQ ID NO: 1 or 197 of SEQ ID NO: 2.
  • the toll-like receptor gene is toll-like receptor 4 gene, and the polymorphism of the toll-like receptor 4 gene is a polymorphism in linkage disequilibrium with the single nucleotide polymorphism of the 202nd base of SEQ ID NO: 3. Method (1).
  • An inflammatory disease test probe having a sequence of 10 bases or more including the 201st base in the base sequence of SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof.
  • a primer for inflammatory disease testing that can amplify a region containing the 201st base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a probe for inflammatory disease testing comprising a sequence of 10 bases or more including the 197th base in the base sequence of SEQ ID NO: 2 or a complementary sequence thereof.
  • a primer for inflammatory disease testing which can amplify a region containing the 197th base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • An inflammatory disease test probe having a sequence of 10 bases or more including the 202nd base in the base sequence of SEQ ID NO: 3 or a complementary sequence thereof.
  • a primer for inflammatory disease testing which can amplify a region containing the 202nd base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • a method for screening a therapeutic drug for inflammatory diseases comprising the step of:
  • FIG. 1 shows the results of an interaction analysis between TLR and galectin 2 by immunoprecipitation.
  • IP means immunoprecipitation and WB means Western blot.
  • FIG. 2 shows the results of an analysis of the interaction between the intracellular region of TLR2 and galectin 2 by immunoprecipitation.
  • IP means immunoprecipitation and WB means Western plot.
  • the test method of the present invention is a method of analyzing a gene polymorphism associated with an inflammatory disease of the toll-like receptor (TLR) gene and testing the inflammatory disease based on the analysis.
  • Inflammatory diseases are not particularly limited as long as they are induced to induce cell adhesion factors and cytoforce-in that are known to correlate with inflammation.
  • rheumatoid arthritis systemic erythematosus
  • inflammatory bowel disease And various allergic diseases, bacterial shock, or coronary artery diseases such as myocardial infarction and stroke, and particularly myocardial infarction.
  • the “test” includes a test for the risk of developing an inflammatory disease and a test for the presence or absence of the onset.
  • the toll-like receptor gene is preferably toll-like receptor 1 (TLR1) gene or toll-like receptor 4 (TLR4) gene.
  • TLR1 gene the human TLR1 gene force s
  • Ru can be mentioned a gene having a sequence that is registered with the access number U88540 data based National Center for Biotechnology Information (NCBI) .
  • the TLR4 gene is preferably a human TLR4 gene, for example, a gene having a sequence registered under the access number AF172169 in the database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI). Note that these genes are not limited to the genes of the above sequences because substitutions or deletions may occur in bases other than those related to inflammatory diseases due to differences in races.
  • the sequence of the toll-like receptor gene may be analyzed for the sense strand or the anti-sense strand.
  • the type of gene polymorphism is not particularly limited as long as it is related to inflammatory diseases, and includes monobasic polymorphisms (SNPs), VNTR (Variable Number of Tandem Repeat), and the like.
  • the single nucleotide polymorphism of the TLR1 gene associated with inflammatory diseases is not particularly limited, but is preferably 1805 base (201 of SEQ ID NO: 1) or 130 base (SEQ ID NO: 2 of base sequence 197). Examples include polymorphism.
  • the numbers 1805 and 130 are the numbers counted as the starting point of translation.
  • Examples of the sequence containing the 1805th base include the sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the 1805th base corresponds to the 201st base of this sequence.
  • TLR 1 gene on the human chromosome there is a polymorphism in which this base is T (thymine) or G (guanine).
  • sequence containing the 130th base examples include the sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the 130th base corresponds to the 197th position of this sequence.
  • this base is T (thymine) or C (cytosine).
  • corresponding means a corresponding base in the region having the above sequence on the human TLR1 gene. Even if the above sequence is slightly changed at a position other than SNP due to differences in race, It also includes analyzing the corresponding base in it.
  • the single nucleotide polymorphism of the TLR4 gene associated with inflammatory diseases is not particularly limited, but preferably includes a polymorphism at the 1440th base (202 of SEQ ID NO: 3).
  • the -14th 40th is a number based on Dunnen J. T. and Antonarakis S. E. Hum. Mutation 15, 7-12, 2000.
  • Examples of the sequence containing the 1440th base include the sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the 1440th base corresponds to the 202nd base of this sequence.
  • this base is T (thymine) or C (cytosine).
  • corresponding means a corresponding base in the region having the above sequence on the human TLR4 gene. Even if the above sequence is slightly changed at a position other than SNP due to differences in race, It also includes analyzing the corresponding base in it.
  • inflammatory diseases By analyzing polymorphisms of the above bases alone or in combination, inflammatory diseases can be examined. Further, the examination may be performed based on polymorphisms in linkage disequilibrium with these single nucleotide polymorphisms. Examples of polymorphisms in linkage disequilibrium include single nucleotide polymorphisms of other bases and VNTR.
  • the sample used for the analysis of the gene polymorphism of the TLR gene is not particularly limited as long as it is a sample containing chromosomal DNA.
  • body fluid samples such as blood and urine, cells such as mucosal cells, and hair such as hair Etc.
  • the ability to use these samples directly for the analysis of genetic polymorphisms These sample forces It is preferable to isolate chromosomal DNA by a conventional method and analyze it.
  • Analysis of the gene polymorphism of the TLR gene should be performed by a normal gene polymorphism analysis method. Can do. For example, powers such as sequence analysis, PCR, and hybridization are not limited to these.
  • the sequence can be performed by a usual method. Specifically, a sequence reaction is performed using a primer set at the position of several tens of bases on the 5 'side of the base showing the polymorphism, and from the analysis results, the type of base at the corresponding position is determined. Can be determined. When performing the sequencing, it is preferable to amplify the fragment containing the polymorphism by PCR or the like.
  • a primer having a sequence corresponding to a region containing a polymorphic base and corresponding to each polymorphism is prepared.
  • PCR can be performed using each primer, and the type of polymorphism can be determined by the presence or absence of amplification products.
  • a base showing a polymorphism when a base showing a polymorphism is contained in a restriction enzyme recognition sequence, it can be analyzed by the presence or absence of cleavage by a restriction enzyme (RFLP method).
  • the DNA sample is first cleaved with a restriction enzyme.
  • the DNA fragments can then be separated and the type of polymorphism can be determined by the size of the detected DNA fragment.
  • the polymorphism at the 1805th base of the TLR1 gene can be detected by the presence or absence of cleavage by Pstl because a Pstl cleavage site occurs when this polymorphism is G.
  • an inflammatory disease is examined.
  • the base force is high in the risk of developing an inflammatory disease or highly likely to be suffering from an inflammatory disease. can do.
  • the genotype is GG or TG allele
  • the risk of developing an inflammatory disease is higher than that of the TT allele, and the patient suffers from an inflammatory disease. It can be determined that there is a high possibility of
  • the base is C
  • the risk of developing an inflammatory disease is high, the possibility of having an inflammatory disease is high, etc. be able to.
  • the gene type is CC or TC allele
  • the risk of developing inflammatory diseases is higher than that of TT alleles, and inflammatory diseases can be considered. It can be determined that the patient is likely to be affected.
  • the base is the same, there is a high risk of developing an inflammatory disease or a high possibility of suffering from an inflammatory disease. Can be determined. For example, if the genotype is CC allele, the risk of developing inflammatory disease is higher than that of TC or TT allele, and the patient is affected by inflammatory disease. Therefore, it can be determined that there is a high possibility.
  • polymorphisms of other genes are prayed, and an inflammatory disease is determined based on the combination of the polymorphisms of these genes.
  • Other genes include the galectin-2 gene.
  • the galectin-2 gene sequence can include the sequence registered in NCBI under NT_011520, and the galectin-2 gene polymorphism can include the 3279th nucleotide polymorphism of intron 1 . This base corresponds to the 377th base of SEQ ID NO: 20.
  • the human galectin-2 gene has a polymorphism in which the base is AZT. And the risk of inflammatory disease is higher in the case of TT than in the case of genotype at this position (Nature. 2004 May 6; 4 29 (6987): 72-5.) O
  • lymphotoxin is known to be associated with myocardial infarction.
  • a combination of the polymorphisms of the syn- ⁇ gene (Nat Genet. 2002 Dec; 32 (4): 650-4.2002; WO2004 / 0151 00) can also be examined.
  • the present invention also provides a test reagent such as a primer or a probe for testing an inflammatory disease.
  • a test reagent such as a primer or a probe for testing an inflammatory disease.
  • a probe include a probe having the 201st base in the base sequence of SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof, a sequence having the 197th base in the base sequence of SEQ ID NO: 2, or a complementary sequence thereof And a probe having a sequence containing the 202nd base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, or a complementary sequence thereof.
  • a primer capable of discriminating the polymorphism of the 201st base of the base sequence of SEQ ID NO: 1, for example, a region having a sequence containing the 201st base of the base sequence of SEQ ID NO: 1 is amplified.
  • Primer capable of discriminating the polymorphism of the 197th base of the base sequence of SEQ ID NO: 2 for example, amplifying a region having a sequence containing the 197th base of the base sequence of SEQ ID NO: 2
  • Primer capable of discriminating the polymorphism of the 202nd base of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 for example, amplifying a region having a sequence containing the 202nd nucleotide of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3
  • the primer which can be mentioned is mentioned. These primers may be a primer set of a forward primer and a reverse primer set at both ends of a region containing a polymorphism (preferably 50 to: a region having a length of LOOO base).
  • a primer having a sequence 5′-side of the base when used for sequence analysis or single-stranded amplification, a primer having a sequence 5′-side of the base, preferably 30 to 100 bases upstream, or a 3′-side region of the base, preferably 30 to 100 bases downstream.
  • a primer having a complementary sequence in this region is exemplified.
  • Primers used to determine polymorphism based on the presence or absence of amplification by PCR have a sequence containing the above base, a primer containing the above base on the 3 ′ side, or a sequence complementary to the sequence containing the above base, Examples include primers containing the above-mentioned base complementary base on the 3 side.
  • the length of such a primer or probe is not particularly limited.
  • an oligonucleotide having 10 to 100 bases is preferable, and an oligonucleotide having 15 to 50 bases is more preferable.
  • the test reagent of the present invention can be used in PCR for these primers and probes.
  • the polymerase may contain a buffer.
  • the test reagent of the present invention may further include a primer or a probe for analyzing a polymorphism of galectin-12 gene.
  • a probe include a probe having a sequence containing the 377th base of the base sequence of SEQ ID NO: 20 or a complementary sequence thereof, and the primer includes the 377th base of the base sequence of SEQ ID NO: 20.
  • a primer capable of amplifying DNA having a sequence containing include a primer or a probe for analyzing a polymorphism of galectin-12 gene.
  • the screening method of the present invention comprises a step of adding a drug candidate substance to a screening system containing toll-like receptor (TLR) and galectin 2, a step of measuring the interaction between TLR and galectin 1-2, and changing the interaction
  • TLR toll-like receptor
  • This is a screening method for a therapeutic agent for inflammatory diseases, which comprises a step of selecting a substance to be treated.
  • TLR and galectin 2 are related to inflammatory diseases such as myocardial infarction, In addition, since these proteins interact specifically in vivo, substances that change these interactions can be candidates for drugs for inflammatory diseases.
  • the TLR protein is preferably TLR1 or TLR2.
  • the drug candidate substance is not particularly limited, and may be, for example, a low-molecular synthetic compound or a compound contained in a natural product. Moreover, a peptide may be sufficient. Individual test substances may be used for screening, but a compound library containing these substances may be used. By selecting a candidate substance that alters the interaction between TLR and galectin-2, therapeutic agents for inflammatory diseases can be obtained. Here, “change” includes inhibiting interaction and enhancing interaction.
  • the screening system containing TLR and galectin 2 means a screening system containing both of these proteins, and may be an in vitro system or a cell system.
  • the above screening system may be a system in which these proteins are added directly, or a system in which these proteins are included by translating the transcribed mRNA. Yo ...
  • the TLR protein and galectin-2 protein used in the in vitro screening system may be a recombinant protein or a naturally derived protein. Further, it may be chemically synthesized. The ability to use proteins derived from eukaryotes including humans and other animals that are not limited by the origin of the protein. Preferably, proteins derived from humans are used.
  • the human-derived TLR1 protein one having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 can be mentioned.
  • Examples of the human-derived TLR2 protein include those having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. Further, as long as the binding property to galectin 2 is maintained, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or 15 may have a sequence in which one or several amino acids are replaced by 'deletion'. .
  • examples of the human-derived galectin 2 protein include those having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. Further, as long as the binding property to TLR2 is maintained, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 may have a sequence in which a position or several amino acids are substituted / deleted / added. The above-mentioned several are preferably 2 to 50, more preferably 2 to 20, and particularly preferably 2 to 10.
  • the protein may be a partial peptide containing a binding site. Since TLR has a large molecular weight and is not always easy to express, an intracellular domain involved in binding to galectin 2 may be used. Alternatively, a fusion protein with another peptide may be used. Examples of peptides to be fused include peptide tags such as GST, His tag, and S tag that can be used for purification in pull-down assay.
  • DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 (TLR1), SEQ ID NO: 14 (TLR2) or SEQ ID NO: 16 (galectin 2) is transferred to Escherichia coli or animal cells. It can be obtained by introducing and expressing the recombinant protein and purifying the protein. Note that it is not always necessary to use purified protein, and crudely purified products or cell extracts may be used for detecting interactions.
  • vectors for introducing the above DNA into E. coli include pET vectors (Novagen) and pGEX vectors (Amersham Pharmacia), and vectors for introducing them into animal cells include pcD. NA vectors (Invitrogen), pcDNA (Invitrogen) and the like.
  • TLR and galectin-2 protein are incubated in vitro, and an antibody against one protein, or a peptide to be fused when this protein is a fusion protein
  • the interaction between the two proteins can be evaluated by detecting the other protein that binds to the protein. Screening can be performed by adding a test substance to this system and selecting a substance that affects the interaction.
  • one of the proteins may be labeled with a labeling substance such as a radioisotope or piotin, and detected using that.
  • Biosensors using the surface plasmon resonance phenomenon can observe the interaction between proteins in real time as a surface plasmon resonance signal using a small amount of protein sample and without labeling (for example, manufactured by BIAcore, Pharmacia). ). Therefore, it is possible to evaluate the binding of TLR and galectin 2 by using a biosensor such as BIAcore.
  • screening of the present invention can be performed by high-throughput screening using combinatorial chemistry (Science 1996, 273 p458-64, Nature 1996, 384pl-13).
  • rRE ⁇ Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • Screening can also be performed in a cell system.
  • a method using immunoprecipitation can be mentioned. That is, cells that express TLR and galectin-12 are cultured, and after recovering the cells, the complex is recovered with an antibody against one of the proteins, and the other protein is then recovered with an antibody against the protein. By detecting, the interaction between the two proteins can be detected, and the influence of the test substance on the interaction can be evaluated.
  • both proteins may be proteins endogenously expressed by the cell, but either force or both proteins can be expressed exogenously in the cell.
  • Examples of cells used include CHO cells and COS cells. However, it is not limited to these.
  • a gene encoding TLR and 7 or galectin-2 as described above is used for expression of foreign genes such as 3 ⁇ 21 ⁇ 0, pcDNA I, and pCD8.
  • the gene can be expressed by inserting it into a vector.
  • These proteins can be expressed as fusion proteins with peptide tags such as Myc tag and Flag tag.
  • the screening system using cells further includes a two-hybrid method using yeast or animal cells.
  • a vector that expresses a fusion protein in which the partial peptide is fused with a transcriptional activity domain such as VP16 or GAL4 is constructed and introduced into yeast cells together with a vector encoding a reporter gene, The compound is assayed using the reporter activity as an indicator in the presence of the sample containing the test substance.
  • reporter gene is induced by the interaction between the TLR protein and the galectin-2 protein, but if the interaction between the two proteins is inhibited by the test compound, the expression of the reporter gene is suppressed.
  • reporter genes include, but are not limited to, the HIS3 gene, Ade2 gene, LacZ gene, CAT gene, luciferase gene, GFP gene, and the like. Screening by the two-hybrid method can be performed using yeast or mammalian cells.
  • Two-hybrid screening includes, for example, “MATCHMARKER Two—Hybrid System”, “Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”, “MATCHMAKER One-Hybrid SystemJ” (both manufactured by Clontech), “HybriZAP Two-Hybrid Vector System” ( Etc.) manufactured by Stratagene)).
  • TLR1 gene and the TLR4 gene Single nucleotide polymorphisms of the TLR1 gene and the TLR4 gene were analyzed for Japanese myocardial infarction patients and non-myocardial infarction patients (controls) with informed consent.
  • the chromosomal DNA isolated from the subject's blood force was converted into a saddle shape, and PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 4 and 5 to obtain DNA fragments.
  • the resulting fragment was digested with the restriction enzyme Pstl (Takara) and analyzed by analyzing the electrophoretic pattern on a 4% Nusieve GTG agarose gel (Takara).
  • PCR was performed using the chromosomal DNA isolated from the blood of the subject as a saddle and using the primers of SEQ ID NOs: 6 and 7. The product was subjected to sequence analysis of the polymorphic site using the primer of SEQ ID NO: 10.
  • the polymorphism of the 1440th base of the TLR4 gene is obtained by PCR using the chromosomal DNA isolated from the blood of the subject in a cage and using the primers of SEQ ID NOs: 8 and 9.
  • the amplified product was subjected to sequence analysis of the polymorphic site using the primer of SEQ ID NO: 11.
  • the patients with myocardial infarction analyzed had a history of G) chest compression feeling, pain, chest pain of 30 minutes or more, and (ii) at least one standard lead or two chest leads greater than O.lmV. Of three conditions (Nat Genet. 2002 Dec; 32 (4): 650-4.2002), showing an increase in ST segment, (iii) Serum creatine kinase concentration increased more than twice the standard value Patients who have been diagnosed with myocardial infarction by satisfying two or more of them. Table 1 shows the analysis results.
  • PCR was performed using primers specific to galectin-2 (SEQ ID NOs: 18 and 19) with EcoRI and Xhol sites attached, respectively, and using human liver cDNA (Clontech) as a template.
  • the amplified fragment was treated with EcoRI and Xhol, and ligated to pFLAG-CMV5a vector (SIGMA) treated with EcoRI and Xhol in the same way to obtain a FLAG-tagged galectin-2 expression vector (galectin-2—FLAG).
  • HA tag fusion TLR1, 2, 3 expression vectors were purchased from invivogen (TLR—HAl, 2, 3).
  • the galectin-2-FLAG expression vector and the TLR-HA expression vector were transiently transfected into COS7 cells (Health Science Research Resources Bank; JCRB9127) using Fugene (Roche). After 24 hours, the cells were treated with complete protease inhibitor tabl et (Roche; 1 tablet per 20 ml) and lysis buffer (20 mM Tris-HC1 pH7.5, 150 mM NaCL, containing MG-132 (Calbiochm; 5 ⁇ g / ml). 0.1% Triton X-100) was used for 1 hour or more so that insoluble de bris did not precipitate.
  • a vector for expressing the fusion protein of the intracellular region of TLR2 (regions 614 to 784 of SEQ ID NO: 15) and the S tag was constructed.
  • a DNA fragment encoding the intracellular region of TLR2 was amplified using the primers of SEQ ID NOs: 21 and 22, and inserted into pTriEx4 vector (Novagen) (S-tag-TLR2ID).
  • the galectin-2 FLAG expression vector and S-tag-TLR2ID expression vector were transiently transfected into COS7 cells (Health Science Research Resources Bank; JCRB9127) using Fugene (Roche). After immunoprecipitation using S-Protein, Western blot (WB) was performed using S-Protein or anti-FLAG antibody. As a result, it was found that the intracellular region of TLR2 interacted with galectin-2.
  • an inflammatory disease such as myocardial infarction can be detected at an early stage, which is useful in the diagnostic field and the like. Further, according to the screening method of the present invention, a new drug for inflammatory diseases such as myocardial infarction can be obtained, which is useful in the pharmaceutical field and the like.

Abstract

　トルライクレセプター遺伝子上に存在する遺伝子多型を分析し、該分析結果に基づいて炎症性疾患を検査する。また、トルライクレセプターとガレクチン－２の相互作用を変化させる物質を選択することにより炎症性疾患の治療薬のスクリーニングを行う。

Description

明 細 書
炎症性疾患の検査法および炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法 技術分野
[0001] 本発明は心筋梗塞などの炎症性疾患の検査方法及び炎症性疾患治療薬のスクリ 一二ング方法に関する。 背景技術
[0002] 近年、ライフスタイルの変化に伴って、炎症性疾患、特に心筋梗塞などの冠動脈疾 患の死亡リスクが増加している（非特許文献 1又は 2参照)。したがって、これらの疾患 につ 、て早期に発症リスクを判定する方法の開発が望まれて 、る。
[0003] 心筋梗塞などの冠動脈疾患は遺伝的素因によって発症する可能性が提唱され、遺 伝子変異の有無によって、心筋梗塞を判定する方法力 ^、くつか知られている。例え ば、プロスタサイクリン合成酵素遺伝子の多型を分析して心筋梗塞の発症リスクを判 定する方法が知られている (特許文献 1参照)。し力しながら、より正確に判定するた めには、さらなる判定法の開発が求められていた。
[0004] トルライクレセプター（TolHike receptor)は、昆虫の受容体である Tollのホモログと して単離された、免疫応答などに関与する一回膜貫通型受容体である (非特許文献 3参照）。トルライクレセプターをコードする遺伝子のいくつかの部位における多型が 喘息に関連することが知られていた (非特許文献 4参照)。し力しながら、トルライクレ セプター遺伝子の多型と心筋梗塞等の炎症性疾患との関連については知られてい なかった。
[0005] ガレクチン (galectin)はガラクトースに結合性を示すタンパク質である力 哺乳類で は現在、 10種類のガレクチンが知られている。その中で、ガレクチン— 2は 14kDaの サブユニットからなる非共有結合性のホモダイマーを形成し、還元剤非存在下では 自己凝集し活性を失うことが知られている。また、ガレクチン 2の発現は正常成人 組織中では下部小腸を主とした上皮細胞に多く認められることが知られているが、そ の詳細な生理機能にっ 、ては知られて 、なかった (非特許文献 5参照)。
特許文献 1 :特開 2002— 136291号公報 非特許文献 1 : Nature Medicine, 1997, vol.3, p600-601
非特許文献 2 : New England Journal of Medicine, 1997, vol.337, pl360- 1369 非特許文献 3 : J. Biol. Chem., Vol. 278, Issue 40, 38105-38108, 2003
非特許文献 4 : Genes Immun. 2004 Aug;5(5):343- 6
特許文献 5 : Trends in Glycoscience and ulycotechnology, 1997, vol.9, No.45, p8 7-93
発明の開示
[0006] 本発明は、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症リスクや発症の有無を正確に検査する 方法を提供することを課題とする。本発明はまた、心筋梗塞等の炎症性疾患の治療 薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
[0007] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、トルライ タレセプター遺伝子の一塩基多型が心筋梗塞に関連することを見出した。さらに、ト ルライクレセプターがガレクチン 2と特異的な相互作用を示すことから、両者の相互 作用を変化させる物質をスクリーニングすることで心筋梗塞等の炎症性疾患の治療 薬が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
[0008] すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)トルライクレセプター遺伝子の多型を分析し、該分析結果に基づいて炎症性疾 患を検査する方法。
(2)前記多型が一塩基多型である、（1)の方法。
(3)トルライクレセプター遺伝子がトルライクレセプター 1遺伝子であり、該トルライクレ セプター 1遺伝子上に存在する一塩基多型が配列番号 1の 201番目の塩基に相当 する塩基または配列番号 2の 197番目の塩基に相当する塩基の多型である、 (2)の 方法。
(4)トルライクレセプター遺伝子がトルライクレセプター 4遺伝子であり、該トルライクレ セプター 4遺伝子上に存在する一塩基多型が配列番号 3の 202番目の塩基に相当 する塩基の多型である、（2)の方法。
(5)トルライクレセプター遺伝子がトルライクレセプター 1遺伝子であり、該トルライクレ セプター 1遺伝子の多型が、配列番号 1の 201番目の塩基または配列番号 2の 197 番目の塩基の一塩基多型と連鎖不平衡にある多型である、 (1)の方法。
(6)トルライクレセプター遺伝子がトルライクレセプター 4遺伝子であり、該トルライクレ セプター 4遺伝子の多型が、配列番号 3の 202番目の塩基の一塩基多型と連鎖不平 衡にある多型である、（1)の方法。
(7)炎症性疾患が心筋梗塞である（1)〜（6)の 、ずれかの方法。
(8)配列番号 1の塩基配列において 201番目の塩基を含む 10塩基以上の配列、又 はその相補配列を有する炎症性疾患検査用プローブ。
(9)配列番号 1の塩基配列において 201番目の塩基を含む領域を増幅することので きる炎症性疾患検査用プライマー。
(10)配列番号 2の塩基配列において 197番目の塩基を含む 10塩基以上の配列、 又はその相補配列を有する炎症性疾患検査用プローブ。
(11)配列番号 2の塩基配列において 197番目の塩基を含む領域を増幅することの できる炎症性疾患検査用プライマー。
(12)配列番号 3の塩基配列において 202番目の塩基を含む 10塩基以上の配列、 又はその相補配列を有する炎症性疾患検査用プローブ。
(13)配列番号 3の塩基配列において 202番目の塩基を含む領域を増幅することの できる炎症性疾患検査用プライマー。
(14)トルライクレセプターおよびガレクチン一 2を含むスクリーニング系に医薬候補物 質を添加する工程、トルライクレセプターとガレクチン 2との相互作用を測定するェ 程、及び前記相互作用を変化させる物質を選択する工程を含む、炎症性疾患治療 薬のスクリーニング方法。
(15)トルライクレセプターがトルライクレセプター 1またはトルライクレセプター 2である (14)のスクリーニング方法。
図面の簡単な説明
[図 1]免疫沈降による TLRとガレクチン 2の相互作用解析の結果を示す図。 IPは免疫 沈降を、 WBはウェスタンブロットを意味する。
[図 2]免疫沈降による TLR2の細胞内領域とガレクチン 2の相互作用解析の結果を示 す図。 IPは免疫沈降を、 WBはウェスタンプロットを意味する。 発明を実施するための最良の形態
[0010] < 1 >本発明の検査方法
本発明の検査方法は、トルライクレセプター (TLR)遺伝子の炎症性疾患に関連す る遺伝子多型を分析し、該分析に基づいて炎症性疾患を検査する方法である。炎症 性疾患としては、炎症との相関が知られている細胞接着因子やサイト力インの誘導が 認められる疾患であれば特に限定されないが、例えば、慢性関節リウマチ、全身性ェ リマトーデス、炎症性腸炎、種々のアレルギー疾患、細菌性ショック、または心筋梗塞 や脳卒中などの冠動脈疾患などが挙げられ、特には心筋梗塞が挙げられる。なお、 本発明にお 、て、「検査」とは炎症性疾患の発症リスクの検査や発症の有無の検査 を含む。
[0011] トルライクレセプター遺伝子としては、トルライクレセプター 1 (TLR1)遺伝子又はトル ライクレセプター 4 (TLR4)遺伝子が好ましい。 TLR1遺伝子としては、ヒト TLR1遺伝子 力 s好ましく、例えば、 National Center for Biotechnology Information (NCBI)のデータ ベースにアクセス番号 U88540で登録された配列を有する遺伝子を挙げることができ る。 TLR4遺伝子としては、ヒト TLR4遺伝子が好ましぐ例えば、 National Center for Bi otechnology Information (NCBI)のデータベースにアクセス番号 AF172169で登録さ れた配列を有する遺伝子を挙げることができる。なお、これらの遺伝子は人種の違い などによって炎症性疾患に関連する塩基以外の塩基において置換や欠失等が存在 する可能性があるため、上記配列の遺伝子に限定されない。
なお、トルライクレセプター遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセ ンス鎖を解析してもよい。
[0012] 遺伝子多型の種類は炎症性疾患に関連するものである限り特に制限されず、一塩 基多型（SNPs)、及び VNTR (Variable Number of Tandem Repeat)などを含む。
炎症性疾患に関連する TLR1遺伝子の一塩基多型は特に制限されないが、好まし くは 1805番目（配列番号 1の 201番目）の塩基または 130番目（配列番号 2の塩基 配列の 197番目）の多型が挙げられる。なお、 1805番目、 130番目とは翻訳開始点 力 数えた番号である。
1805番目の塩基を含む配列としては、例えば、配列番号 1の配列が挙げられる。 該 1805番目の塩基は、この配列の 201番目の塩基に相当する。ヒト染色体上の TLR 1遺伝子にぉ 、ては、この塩基が T (チミン)又は G (グァニン）となる多型が存在する。
130番目の塩基を含む配列としては、例えば、配列番号 2の配列が挙げられる。該 130番目の塩基は、この配列の 197番目に相当する。ヒト染色体上の TLR1遺伝子に お!、ては、この塩基が T (チミン）又は C (シトシン）となる多型が存在する。
なお、「相当する」とは、ヒト TLR1遺伝子上の上記配列を有する領域中の該当塩基 を意味し、仮に、人種の違いなどによって上記配列が SNP以外の位置で若干変化し たとしても、その中の該当塩基を解析することも含む。
[0013] 炎症性疾患に関連する TLR4遺伝子の一塩基多型は特に制限されないが、好まし くは— 1440番目（配列番号 3の 202番目）の塩基の多型が挙げられる。なお、—14 40番目とは Dunnen J. T. and Antonarakis S. E. Hum. Mutation 15, 7-12, 2000に基 づく番号である。 1440番目の塩基を含む配列としては、例えば、配列番号 3の配 列が挙げられる。該ー 1440番目の塩基は、この配列の 202番目の塩基に相当する 。ヒト染色体上の TLR4遺伝子においては、この塩基が T (チミン）又は C (シトシン）とな る多型が存在する。
なお、「相当する」とは、ヒト TLR4遺伝子上の上記配列を有する領域中の該当塩基 を意味し、仮に、人種の違いなどによって上記配列が SNP以外の位置で若干変化し たとしても、その中の該当塩基を解析することも含む。
上記の塩基の多型を単独または組み合わせて解析することにより、炎症性疾患を 検査することができる。また、これらの一塩基多型と連鎖不平衡にある多型に基づい て検査を行ってもよい。連鎖不平衡にある多型としては、他の塩基の一塩基多型や VNTRなどが挙げられる。
[0014] TLR遺伝子の遺伝子多型の解析に用いる試料としては、染色体 DNAを含む試料 であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、粘膜細胞など の細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。遺伝子多型の解析にはこれらの試料を直 接使用することもできる力 これらの試料力 染色体 DNAを常法により単離し、これ を用いて解析することが好まし 、。
[0015] TLR遺伝子の遺伝子多型の解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うこと ができる。例えば、シークェンス解析、 PCR、ハイブリダィゼーシヨンなどが挙げられる 力 これらに限定されない。
[0016] シークェンスは通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の 5'側数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークェンス反応を行い、そ の解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。 なお、シークェンスを行う場合、あらカゝじめ多型を含む断片を PCRなどによって増幅し ておくことが好ましい。
[0017] また、 PCRによる増幅の有無を調べることによって解析することができる。例えば、多 型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、各多型に対応するプライマ 一をそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用して PCRを行い、増幅産物の 有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
また、 LAMP法（特許第 3313358号明細書）、 NASBA法 (Nucleic Acid Sequence- Bas ed Amplification；特許 2843586号明細書)、 ICAN法（特開 2002- 233379号公報）など によって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
[0018] また、多型を含む DNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違い によってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、 例 ば、 PCR-SSCP (single― strand conformation polymorphism)法 (Geno mics. 1992 Jan 1 ; 12 (1)： 139— 146. )が挙げられる。具体的には、まず、 TLR遺伝子の多型部位を含む DNAを増幅し、増幅した DNAを一本鎖 DNAに解離 させる。次いで、解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖 DNAのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定すること ができる。
[0019] さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による 切断の有無によって解析することもできる (RFLP法)。この場合、まず、 DNA試料を 制限酵素により切断する。次いで、 DNA断片を分離し、検出された DNA断片の大 きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。 TLR1遺伝子の 1805 番目の塩基の多型については、この多型が Gの場合 Pstl切断部位が生じるため、 Pstl による切断の有無によって検出することができる。 [0020] 次に、上記のような方法によって解析した多型に基いて、炎症性疾患について検 查を行う。
例えば、 TLR1遺伝子の 1805位の塩基の多型に基いて判定する場合は、該塩基 力 の場合、炎症性疾患の発症リスクが高い、炎症性疾患に罹患している可能性が 高いなどと判定することができる。また、対立遺伝子の多型を含めて考慮してもよぐ 例えば、遺伝子型が GGまたは TGアレルの場合に、 TTアレルと比べて炎症性疾患の 発症リスクが高 、、炎症性疾患に罹患して!/、る可能性が高 、などと判定することがで きる。
TLR1遺伝子の 130位の塩基の多型に基いて判定する場合は、該塩基が Cの場合 、炎症性疾患の発症リスクが高い、炎症性疾患に罹患している可能性が高いなどと 判定することができる。また、対立遺伝子の多型を含めて考慮してもよぐ例えば、遺 伝子型が CCまたは TCアレルの場合に、 TTアレルと比べて炎症性疾患の発症リスク が高 、、炎症性疾患に罹患して 、る可能性が高 、などと判定することができる。
TLR4遺伝子の 1440位の塩基の多型に基 、て判定する場合は、該塩基がじの 場合、炎症性疾患の発症リスクが高い、炎症性疾患に罹患している可能性が高いな どと判定することができる。また、対立遺伝子の多型を含めて考慮してもよぐ例えば 、遺伝子型が CCアレルの場合に、 TCまたは TTアレルと比べて炎症性疾患の発症リ スクが高 、、炎症性疾患に罹患して 、る可能性が高 、などと判定することができる。
[0021] 本発明の判定法においては、 TLR遺伝子の多型に加え、他の遺伝子の多型を解 祈し、それらの遺伝子の多型の組合わせに基 、て炎症性疾患の判定を行ってもょ ヽ 。他の遺伝子としては、ガレクチン— 2遺伝子が挙げられる。ガレクチン— 2遺伝子の 配列としては、 NCBIに NT_011520に登録されている配列を挙げることができ、ガレク チン— 2遺伝子の多型としては、イントロン 1の 3279番目の塩基の多型を挙げること ができる。この塩基は、配列番号 20の 377番目の塩基に相当する。ヒトガレクチン— 2遺伝子では該塩基が AZTとなる多型が存在する。そして、この位置の遺伝子型が AAの場合に比べて、 TTの場合に炎症性疾患のリスクが高い（Nature. 2004 May 6;4 29(6987):72-5.) o
さらに、本発明の検査方法においては心筋梗塞との関連が知られているリンホトキ シン α遺伝子の多型（Nat Genet. 2002 Dec;32 (4):650- 4. 2002 ;WO2004/0151 00)を組合わせて検査することもできる。
< 2>本発明の検査用試薬
本発明はまた、炎症性疾患を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試 薬を提供する。このようなプローブとしては、配列番号 1の塩基配列において 201番 目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有するプローブ、配列番号 2の塩基配列 において 197番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有するプローブ、配列番 号 3の塩基配列において 202番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する プローブが挙げられる。
また、プライマーとしては、配列番号 1の塩基配列の 201番目の塩基の多型を判別 することのできるプライマー、例えば、配列番号 1の塩基配列の 201番目の塩基を含 む配列を有する領域を増幅することのできるプライマー；配列番号 2の塩基配列の 19 7番目の塩基の多型を判別することのできるプライマー、例えば、配列番号 2の塩基 配列の 197番目の塩基を含む配列を有する領域を増幅することのできるプライマー； 配列番号 3の塩基配列の 202番目の塩基の多型を判別することのできるプライマー、 例えば、配列番号 3の塩基配列の 202番目の塩基を含む配列を有する領域を増幅 することのできるプライマーが挙げられる。これらのプライマーは多型を含む領域 (好 ましくは 50〜： LOOO塩基の長さの領域)の両端に設定されたフォワードプライマーとリ バースプライマーのプライマーセットであってもよい。また、シークェンス解析や単鎖 増幅に用いる場合、上記塩基の 5'側領域、好ましくは 30〜100塩基上流の配列を有 するプライマーや、上記塩基の 3'側領域、好ましくは 30〜100塩基下流の領域に相 補的な配列を有するプライマーが例示される。 PCRによる増幅の有無で多型を判定 するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を 3 '側 に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩 基を 3，側に含むプライマーなどが例示される。
このようなプライマーやプローブの長さは特に制限されないが、例えば、 10-100 塩基のオリゴヌクレオチドが好ましぐ 15〜50塩基のオリゴヌクレオチドがより好まし い。なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブにカ卩えて、 PCR用の ポリメラーゼゃバッファーを含むものであってもよ 、。
[0023] また、本発明の検査用試薬は、さらにガレクチン一 2遺伝子の多型を解析するため のプライマーやプローブをさらに含むものであってもよい。このようなプローブとしては 、配列番号 20の塩基配列の 377番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有す るプローブが挙げられ、プライマーとしては、配列番号 20の塩基配列の 377番目の 塩基を含む配列を有する DNAを増幅することのできるプライマーが挙げられる。
[0024] < 3 >スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、トルライクレセプター（TLR)およびガレクチン 2を 含むスクリーニング系に医薬候補物質を添加する工程、 TLRとガレクチン一 2との相 互作用を測定する工程、及び前記相互作用を変化させる物質を選択する工程を含 む、炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法である。
[0025] TLR及びガレクチン 2 (Nature. 2004 May 6;429(6987):72-5.)は、 、ずれもその遺 伝子上の多型が心筋梗塞などの炎症性疾患に関連を示し、かつ、これらのタンパク 質は生体内で特異的に相互作用しているため、これらの相互作用を変化させる物質 は炎症性疾患に対する医薬の候補物質になりうる。 TLRタンパク質としては、 TLR1ま たは TLR2が好ましい。
[0026] 医薬候補物質としては特に制限はなぐ例えば、低分子合成化合物であってもよい し、天然物に含まれる化合物であってもよい。また、ペプチドであってもよい。スクリー ユングには個々の被検物質を用いてもよいが、これらの物質を含む化合物ライブラリ 一を用いてもょ 、。候補物質の中力 TLRとガレクチン 2の相互作用を変化させる ものを選択することにより、炎症性疾患の治療薬を得ることができる。ここで、「変化」と は相互作用を阻害すること、および相互作用を強化することを含む。
[0027] TLRおよびガレクチン 2を含むスクリーニング系とは、これらの両タンパク質を含む スクリーニング系を意味し、インビトロの系であってもよいし、細胞系であってもよい。 上記スクリーニング系はこれらのタンパク質が直接添加される系であってもよ 、し、遺 伝子力も転写された mRNAが翻訳されることによりこれらのタンパク質が含まれるよう になった系であってもよ 、。
[0028] インビトロのスクリーニング系として具体的には、以下に示すような、 TLRタンパク質 およびガレクチン 2タンパク質を用いたプルダウンアツセィゃ表面プラズモン共鳴 現象を利用した検出法などが挙げられる。
[0029] インビトロのスクリーニング系に用いられる TLRタンパク質およびガレクチン 2タン ノ ク質は組換えタンパク質であっても、天然由来の蛋白質であってもよい。さらに、化 学合成したものであってもよい。タンパク質の由来に制限はなぐヒトおよび他の動物 を含む真核生物由来の蛋白質を用いることができる力 好ましくは、ヒト由来のタンパ ク質が用いられる。ヒト由来の TLR1タンパク質としては、配列番号 13のアミノ酸配列 を有するものが挙げられる。ヒト由来の TLR2タンパク質としては、配列番号 15のァミノ 酸配列を有するものが挙げられる。また、ガレクチン 2との結合性を保持する限りに おいて、配列番号 13または 15のアミノ酸配列において一または数個のアミノ酸が置 換 '欠失 '付加された配列を有するものであってもよい。
一方、ヒト由来のガレクチン 2タンパク質としては、配列番号 17のアミノ酸配列を有 するものが挙げられる。また、 TLR2との結合性を保持する限りにおいて、配列番号 1 7のアミノ酸配列にお 、て位置または数個のアミノ酸が置換 ·欠失 ·付加された配列を 有するものであってもよい。なお、上記数個とは、好ましくは 2〜50個、より好ましくは 2〜20個、特に好ましくは 2〜10個である。
[0030] また、タンパク質は結合部位を含む部分ペプチドを使用してもょ 、。 TLRは分子量 が大きく発現が必ずしも容易でないため、ガレクチン 2との結合に関与する細胞内 ドメインを用いてもよい。または他のペプチドとの融合タンパク質を用いてもよい。融 合させるペプチドとしては、例えば、プルダウンアツセィゃ精製に使用できる GST、 His タグ、 Sタグなどのペプチドタグが挙げられる。
[0031] 組換えによりタンパク質を得るためには、例えば、配列番号 12 (TLR1)、配列番号 1 4 (TLR2)や配列番号 16 (ガレクチン 2)の塩基配列を有する DNAを大腸菌や動物 細胞などに導入して組換えタンパク質を発現させ、該タンパク質を精製することによ つて得ることができる。なお、必ずしも精製されたタンパク質を用いる必要はなぐ粗 精製物や細胞抽出物を相互作用の検出に使用してもょ 、。上記 DNAを大腸菌に導 入するためのベクターとしては pETベクター（Novagen社）や pGEXベクター（Amersha m Pharmacia社)などが挙げられ、動物細胞に導入するためのベクターとしては、 pcD NAベクター（Invitrogen社）、 pcDNA (Invitrogen)などが挙げられる。
[0032] インビトロの系として、プルダウンアツセィを行う場合は、 TLRとガレクチン 2タンパ ク質とをインビトロでインキュベートし、一方のタンパク質に対する抗体、またはこのタ ンパク質が融合タンパク質の場合、融合するペプチドタグに対する抗体ゃァフィニテ イカラム等で複合体を回収したのち、該タンパク質に結合する他方のタンパク質を検 出することにより、両タンパク質の相互作用を評価することができる。この系に被検物 質を添加し、相互作用に影響を与える物質を選択することによってスクリーニングを 行うことができる。プルダウンアツセィにおいては、一方のタンパク質を放射性同位体 やピオチン等の標識物質で標識し、それを利用して検出してもよい。
[0033] さらに、インビトロのスクリーニング系として、表面プラス、モン共鳴現象を利用したバ ィォセンサーを使用する系を挙げることもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用し たバイオセンサーは、タンパク質間の相互作用を微量の蛋白質試料を用いてかつ 標識することなぐ表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが 可能である（例えば BIAcore、 Pharmacia製）。したがって、 BIAcore等のバイオセ ンサーを用いることにより TLRおよびガレクチン 2の結合を評価することが可能であ る。さらに、コンビナトリアルケミストリーを利用したハイスループットスクリーニング（Sci ence 1996, 273 p458— 64、 Nature 1996, 384 pl l— 13)などにより本発 明のスクリーニングを行うことも可能である。
さらに、その他のスクリーニング系として、蛍光によって検出する系を用いることもで きる (Fluorescence Resonance Energy Transfer (rRE Γ) )。
[0034] また、細胞系でスクリーニングを行うこともできる。例えば、免疫沈降を用いる方法を 挙げることができる。すなわち、 TLRとガレクチン一 2とを発現する細胞を培養し、細胞 を回収後、一方のタンパク質に対する抗体等で複合体を回収したのち、他方のタン パク質を、そのタンパク質に対する抗体等を用いて検出することにより、両者のタンパ ク質の相互作用を検出でき、また、該相互作用に与える被検物質の影響を評価する ことができる。この場合において、両タンパク質は細胞が内因的に発現するタンパク 質であってもよいが、どちら力または両方のタンパク質を外来的に細胞で発現させる こともできる。用いる細胞としては、 CHO細胞や COS細胞などを挙げることができるが 、これらに限定されない。
動物細胞内で蛋白質を外来的に発現させる場合、例えば、上述したような TLRおよ び7またはガレクチンー2をコードする遺伝子を、 3¥21^0, pcDNA I, pCD8な どの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで当該遺伝子を発現させることが できる。なお、これらのタンパク質は Mycタグや Flagタグなどのペプチドタグとの融合 タンパク質として発現させてもょ 、。
[0035] 細胞を用いたスクリーニング系としては、さらに、酵母または動物細胞などを用いた 2ハイブリッド法が挙げられる。
酵母 2—ハイブリッド法においては、 TLRまたはガレクチン 2のどちらか一方のタン ノ ク質またはその部分ペプチドを、 GAL4 DNA結合領域等と融合させた融合タン ノ ク質を発現するベクター、そして他方のタンパク質またはその部分ペプチドを VP1 6または GAL4等の転写活性ィ匕領域と融合させた融合タンパク質を発現するべクタ 一を構築し、これらを、レポーター遺伝子をコードするベクターと共に酵母細胞に導 入して、被検物質を含む試料の存在下でレポーター活性を指標に化合物のアツセィ を行う。 TLRタンパク質とガレクチン 2タンパク質との相互作用によりレポーター遺伝 子の発現が誘導されるが、被検化合物により両者のタンパク質の相互作用が阻害さ れると、レポーター遺伝子の発現が抑制される。レポーター遺伝子としては、例えば、 HIS3遺伝子の他、 Ade2遺伝子、 LacZ遺伝子、 CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝 子、 GFP遺伝子等が挙げられる力 これらに制限されない。 2ハイブリッド法によるスク リー-ングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
2ハイブリッド法によるスクリーニングは例えば、「MATCHMARKER Two— Hy brid System] , 「Mammalian MATCHMAKER Two -Hybrid Assay Kit 」， 「MATCHMAKER One -Hybrid SystemJ (いずれもクロンテック社製）、「 HybriZAP Two -Hybrid Vector System」（ストラタジーン社製））などを使用 して行うことができる。
実施例
[0036] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実 施例に限定されない。 (1)一塩基多型の解析
インフォームドコンセントの得られた日本人の心筋梗塞患者及び非心筋梗塞者 (コ ントロール)それぞれについて、 TLR1遺伝子、 TLR4遺伝子の一塩基多型を解析した 。具体的には、 TLR1遺伝子の 1805番目の塩基の多型については、被検者の血液 力 単離した染色体 DNAを铸型にし、配列番号 4, 5のプライマーを用いて PCRを行 つて DNAフラグメントを増幅し、得られたフラグメントを制限酵素 Pstl (Takara)で消化 し、 4%Nusieve GTGァガロースゲル（Takara)で泳動パターンを解析することにより調 ベた。
TLR1遺伝子の 130番目の塩基の多型については、被検者の血液から単離した染 色体 DNAを铸型に、配列番号 6および 7のプライマーを使用して PCRを行い、得られ た増幅産物について配列番号 10のプライマーを用いて多型部位のシークェンス解 析を行った。
TLR4遺伝子の 1440番目の塩基の多型につ!、ては、被検者の血液から単離し た染色体 DNAを铸型に、配列番号 8および 9のプライマーを使用して PCRを行い、得 られた増幅産物について配列番号 11のプライマーを用いて多型部位のシークェン ス解析を行った。
なお、解析された心筋梗塞患者は、 G) 30分以上の胸部圧迫感、痛み、胸苦しさな どの病歴を持つ、（ii)少なくとも 1の標準誘導又は 2の胸部誘導において O.lmVより大 き 、STセグメントの上昇を示す、（iii)血清クレアチンキナーゼ濃度が標準値の 2倍以 上に上昇する、の 3つの条件（Nat Genet. 2002 Dec;32 (4):650- 4. 2002)のうち 2っ以 上を満たすことによって心筋梗塞であると診断された患者である。解析結果を表 1に 示す。
[表 1] TLR1遺 fe 内の SNPと心筋 SS(MI)の相関
Allele T vs allele C (exon 1 )or G (exon 4) CC (exon 1) orTT (exon 4) vs others
Genotype Ml;人 (％) Control; (%〉 %2[Pvalue] Odds ratio(95%CI) χ2[Ρ value] Odds ratio(95%CI) TLR1 exon 1
130T>C*
Ser44Pro
TT 2210(86.5%) 1590(88.7%) 5.23 1.23 4.52 3.5 TC 324(12.8%) 199(11.1%) [0.022] (1.03-1.47) [0.034] (1.02-12.2) CC 15(0.6%) 3(0.2%)
Total 2549(100%) 1792(100%)
TLR1 exon 4
1805T>G*
Sei602lle
TT 2685(97.6%) 2046(99.0%) 13.4 2.52 15.95 2.72 TG 66(2.4%) 20(1.0%) [0.00021] (1.52-4.16) [0.000065] (1.6S4.53) GG 0(0%) 0(0%)
Total 2751(100%) 2066(100%)
[0038] [表 2] 表 2. 11^1遗<5^130#目の00ホモ型と1805番目の丁6ヘテロ型の ίϋΛ·^せとその他の型の tW¾
Others;人 (％) combination;人 (％) χ2[Ρ value] Odds ratio(95%CI)
Ml 2276 68 17.12 3.01
CO 1614 16 [0.000035] [1.74-5.25]
[0039] [表 3]
表 3. TLR4遗 fe 内の SNPと心筋鶴 (Ml)の相関
χ2 [P value] (Odds ratio)<95%CI>
Genotype Allele TTvs Others CC s Others Genotype Ml;人（％) Control;人（％) frequency frequency
TLR4 promoter -1440
T>C*
TT 1516(55.0%) 1287(58.0%) 12.5 9.2 4.5 11.1 TC 1037(37.6%) 820(37.0%) [0.0019] [0.0024] [0.034] [0.00084] CC 203(7.4%) 112(5.0%) (1-15) (1.13) (1.5) Total 2756(100%) 2219(100%) <1.05-1.26> <1.01-1.26> <1.18-1.90>
[0040] 表 1より、 TLR1遺伝子のェクソン 1の 130番目の塩基の TZCの多型については、 心筋梗塞患者では Cが有意に多い（％2=5.23, P=0.0022; odds ratio=1.23)ことがわか つた。また、 TLR1遺伝子のェクソン 4の 1805番目の塩基の TZGの多型については 、心筋梗塞患者では Gが有意に多い（％2=13.4, P=0.00021; odds ratio=2.52)ことが わかった。
さらに、 130番目の塩基力 SCCアレルであり、かつ 1805番目の塩基力 STGアレルで ある被験者（combination)をその他のアレルの被験者（others)と比較したところ、 com binationの被験者は心筋梗塞の割合が有意に高いことがわ力つた (表 2 ; % 2=17.12, P =0.000035; odds ratio=3.01)。
[0041] 表 3には、 TLR4遺伝子のプロモーター領域の 1440番目の塩基の TZC多型と心 筋梗塞との関連を示す。それによると心筋梗塞患者では Cが有意に多い（％2=9.2, P =0.0024; odds ratio=1.15)ことがわかった。
[0042] (2) TLRとガレクチン 2の相互作用の確認
FLAGタグ融合ガレクチン一 2 (galectin— FLAG)の構築
EcoRI, Xhol siteがそれぞれ付カ卩された galectin- 2に特異的な primer (配列番号 18 及び 19)を用い、ヒト肝臓 cDNA (Clontech)をテンプレートとし， PCRを行った。増幅さ れたフラグメントを EcoRI, Xhol処理し，同様に EcoRI, Xhol処理した pFLAG-CMV5a v ector (SIGMA)に連結して、 FLAGタグ融合ガレクチン 2発現ベクターを得た (gale ctin—2— FLAG)。
HAタグ融合 TLR1, 2, 3発現用ベクターは invivogenより購入した (TLR— HAl, 2, 3)。
[0043] galectin— 2— FLAG発現ベクター及び TLR—HA発現ベクターを Fugene (Roch e)を用いて COS7細胞（Health Science Research Resources Bank; JCRB9127)に一 過的にトランスフエクシヨンした。 24時間後、細胞を、 complete protease inhibitor tabl et (Roche； 20mlあたり 1錠）及び MG- 132 (Calbiochm； 5 μ g/ml)を含む lysis buff er (20mM Tris- HC1 pH7.5, 150mM NaCL, 0.1% Triton X- 100)を用いて不溶性の de brisが沈殿しない程度に 1時間以上溶解した。次に、抗 FLAGタグ M2ァガロース（Si gma)または坑 HAァガロース（Santacruz)を用いて 4°Cで 12— 18時間免疫沈降を行 つた。沈降物を lysis bufferで 3回洗浄した後、抗 HA抗体ペルォキシダーゼコンジ ュゲート（Santa Cruz)又は抗 FLAG抗体ペルォキシダーゼコンジュゲート（Sigma)を 用いて可視化した。結果を図 1に示す。 FLAG抗体を用いて免疫沈降 (IP)を行い、得 られた沈降物にっ 、て HA抗体でウェスタンブロット (WB)を行った結果、ガレクチン — 2— FLAGによって TLR1、 TLR2を共沈降することができた。これにより、 TLR1、 TL R2とガレクチン一 2が特異的に相互作用していることが明らかになった。
[0044] (3) TLR2の細胞内領域とガレクチン 2の相互作用の確認
TLR2の細胞内領域（配列番号 15の 614〜784番目の領域）と Sタグの融合タンパク 質を発現させるためのベクターを構築した。まず、配列番号 21, 22のプライマーを用 V、て TLR2の細胞内領域をコードする DNAフラグメントを増幅し、これを pTriEx4ベクタ 一（Novagen社）に挿入した（S- tag- TLR2ID)。
galectin— 2— FLAG発現べクター及びS-tag-TLR2ID発現べクターをFugene (R oche)を用いて COS7細胞（Health Science Research Resources Bank; JCRB9127) に一過的にトランスフエクシヨンした。 S-Proteinを用いて免疫沈降を行った後、 S-Prot einまたは坑 FLAG抗体を用いてウェスタンブロット（WB)を行った。その結果、 TLR2 の細胞内領域とガレクチン 2が相互作用して 、ることがわ力つた。
産業上の利用の可能性
[0045] 本発明の判定方法によれば心筋梗塞等の炎症性疾患を早期に発見することがで き、診断分野等において有用である。また、本発明のスクリーニング方法によれば、 心筋梗塞等の炎症性疾患に対する新規医薬を得ることができ、医薬分野等において 有用である。

Claims

請求の範囲
[I] トルライクレセプター遺伝子の多型を分析し、該分析結果に基づ 、て炎症性疾患を 検査する方法。
[2] 前記多型が一塩基多型である、請求項 1に記載の方法。
[3] トルライクレセプター遺伝子がトルライクレセプター 1遺伝子であり、該トルライクレセプ ター 1遺伝子上に存在する一塩基多型が配列番号 1の 201番目の塩基に相当する 塩基または配列番号 2の 197番目の塩基に相当する塩基の多型である、請求項 2に 記載の方法。
[4] トルライクレセプター遺伝子がトルライクレセプター 4遺伝子であり、該トルライクレセプ ター 4遺伝子上に存在する一塩基多型が配列番号 3の 202番目の塩基に相当する 塩基の多型である、請求項 2に記載の方法。
[5] トルライクレセプター遺伝子がトルライクレセプター 1遺伝子であり、該トルライクレセプ ター 1遺伝子の多型が、配列番号 1の 201番目の塩基または配列番号 2の 197番目 の塩基の一塩基多型と連鎖不平衡にある多型である、請求項 1に記載の方法。
[6] トルライクレセプター遺伝子がトルライクレセプター 4遺伝子であり、該トルライクレセプ ター 4遺伝子の多型が、配列番号 3の 202番目の塩基の一塩基多型と連鎖不平衡に ある多型である、請求項 1に記載の方法。
[7] 炎症性疾患が心筋梗塞である請求項 1〜6の 、ずれか一項に記載の方法。
[8] 配列番号 1の塩基配列において 201番目の塩基を含む 10塩基以上の配列、又はそ の相補配列を有する炎症性疾患検査用プローブ。
[9] 配列番号 1の塩基配列において 201番目の塩基を含む領域を増幅することのできる 炎症性疾患検査用プライマー。
[10] 配列番号 2の塩基配列において 197番目の塩基を含む 10塩基以上の配列、又はそ の相補配列を有する炎症性疾患検査用プローブ。
[II] 配列番号 2の塩基配列において 197番目の塩基を含む領域を増幅することのできる 炎症性疾患検査用プライマー。
[12] 配列番号 3の塩基配列において 202番目の塩基を含む 10塩基以上の配列、又はそ の相補配列を有する炎症性疾患検査用プローブ。
[13] 配列番号 3の塩基配列にぉ 、て 202番目の塩基を含む領域を増幅することのできる 炎症性疾患検査用プライマー。
[14] トルライクレセプターおよびガレクチン 2を含むスクリーニング系に医薬候補物質を 添加する工程、トルライクレセプターとガレクチン 2との相互作用を測定する工程、 及び前記相互作用を変化させる物質を選択する工程を含む、炎症性疾患治療薬の スクリーニング方法。
[15] トルライクレセプターがトルライクレセプター 1またはトルライクレセプター 2である請求 項 14に記載のスクリーニング方法。
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