WO2012110126A1 - Flüssiger kationenaustauscher - Google Patents

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WO2012110126A1
WO2012110126A1 PCT/EP2011/071494 EP2011071494W WO2012110126A1 WO 2012110126 A1 WO2012110126 A1 WO 2012110126A1 EP 2011071494 W EP2011071494 W EP 2011071494W WO 2012110126 A1 WO2012110126 A1 WO 2012110126A1
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organic
cation exchanger
liquid cation
organic compound
aqueous solution
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PCT/EP2011/071494
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Frank Erhardt
Thomas Haas
Martin Roos
Daniel Demicoli
Markus PÖTTER
Anja Schubert
Jan Christoph Pfeffer
Thomas Tacke
Harald HÄGER
Andreas Pfennig
Marie-Dominique Przybylski
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Evonik Degussa Gmbh
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Definitions

  • the present application relates to a method for removing an organic compound having one or more positive charges from an aqueous solution, comprising the steps of a) providing the aqueous solution containing the organic compound and a hydrophobic organic solution comprising a liquid cation exchanger, wherein the liquid Cation exchanger is hydrophobic, and wherein the liquid cation exchanger has one or more negative charges and a total negative charge, b) contacting the aqueous solution and the organic solution, and c) separating the organic solution from the aqueous solution, wherein the liquid cation exchanger is a fatty acid, and wherein the organic compound has at least two amino groups and no negatively charged functional group, and corresponding reaction mixtures.
  • this conversion is carried out in order to concentrate a finished intermediate or end product and, if appropriate, to enable synthetic processing in subsequent reaction steps in organic solution, and on the other hand to increase the yield of the reaction in the aqueous phase by removing the desired product improve or allow the process of the reaction in a technically meaningful framework in the first place.
  • the direct thermal concentration of the frequently present in low concentrations product from the large-volume aqueous solution is usually not useful.
  • a compound in a two-phase system comprising an aqueous, hydrophilic phase and an organic hydrophobic phase which do not mix depends largely on the physicochemical properties of the particular compound. While compounds with a high proportion of or exclusively consisting of unsubstituted hydrocarbons accumulate predominantly in the hydrophobic phase, are compounds with a high proportion of polar groups such as heteroatom-containing functionalities and especially compounds with charges predominantly or practically exclusively in the aqueous phase, which makes it difficult to convert into an organic phase.
  • K ow also referred to as P value, which characterizes the distributional equilibrium of a compound between an octanol and an aqueous phase:
  • ALS 12-aminolauric acid
  • ALSME methyl ester
  • ALS is an important starting material in the production of polymers, for example for the production of piping systems and nylon.
  • ALS is prepared from fossil sources in a low yield process via laurolactam, which is synthesized by trimerization of butadiene, subsequent hydrogenation to form cyclododecane, subsequent oxidation to cyclododecanone, reaction with hydroxylaurine, and subsequent Beckmann rearrangement.
  • laurolactam which is synthesized by trimerization of butadiene, subsequent hydrogenation to form cyclododecane, subsequent oxidation to cyclododecanone, reaction with hydroxylaurine, and subsequent Beckmann rearrangement.
  • the prior art teaches the recovery of positively charged organic compounds by contacting an aqueous reaction mixture comprising a biological agent with an organic phase comprising an organic solvent.
  • DE 10200710060705 describes the recovery of the product ALSME by shaking it out with ethyl acetate from an aqueous reaction mixture.
  • Asano et al. (2008) disclose the extraction of ALS with toluene from an aqueous reaction solution comprising an ALS synthesizing enzyme.
  • Another object of the present invention is to provide a method for removing organic compounds having at least one positive charge from an aqueous solution comprising a biological agent using a hydrophobic organic phase as an extracting agent in which the distributional equilibrium is maximized on the side of the hydrophobic organic phase.
  • Another object of the invention is to develop a method for removing organic compounds having at least one positive charge from an aqueous solution using a hydrophobic organic solution as the extraction agent, the least possible growth of biotechnologically relevant microorganisms, in particular Escherichia coli impairs or slows down and / or lowers the number of dividable and / or viable and / or respiratory active cells as little as possible.
  • the invention has for its object to provide a method for removing an organic compound having at least one positive charge from an aqueous solution comprising a biological agent using a hydrophobic organic phase as the extraction agent, in which the total of the yield, the total sales and rapid performance of an underlying biotechnological synthesis process crucial properties, in particular the toxicity of the organic phase to the biological agent and the inclusion of the compound in the organic extractant, with regard to the overall yield or a faster process or, in the case of a continuous process, the longest possible usability of the biological agent is optimized, especially in the event that the organic compound having at least one positive charge is the product or an intermediate of the synthesis process, the u nter participation of a catalytic activity of the biological agent is synthesized.
  • a method for removing an organic compound having one or more positive charges from an aqueous solution comprising the steps of a) providing the aqueous solution containing the organic compound and a hydrophobic organic solution comprising a liquid cation exchanger, wherein the liquid cation exchanger is hydrophobic, b) contacting the aqueous solution and the organic solution, and c) separating the organic solution from the aqueous solution, wherein the liquid cation exchanger is a fatty acid, and wherein the organic compound has at least two amino groups and no negatively charged functional group
  • the temperature at step b) is 28 to 70, preferably 30 to 37 ° C.
  • the pH at step b) is 6 to 8, preferably 6.2 to 7.2.
  • the problem is solved by a method wherein the organic compound is a compound of the formula H 2 N - ( CH 2 ) X - NH 2 , and x is 1 to 20, preferably 6 to 10.
  • the organic diamine is an annular sugar having at least two amino groups, preferably diaminoisoidite and diaminoisosorbitol.
  • a fifth embodiment of the first aspect of the present invention which is also an embodiment of the first to fourth embodiments of the present invention, the problem is solved by a method wherein the molar ratio of liquid cation exchanger to organic compound is at least 1.
  • the problem is solved by a method wherein the volume ratio of organic solution to aqueous solution is 1:10 to 10: 1 ,
  • the problem is solved by a method wherein the liquid cation exchanger has a fatty acid of more than 12, preferably 14 to 22, more preferably 16 to 18 carbon atoms.
  • the problem is solved by a method wherein the liquid cation exchanger is an unsaturated fatty acid, preferably oleic acid or erucic acid.
  • the problem is solved by a method wherein the aqueous solution further comprises a biological agent having catalytic activity.
  • the problem is solved by a method wherein the biological agent is a cell, preferably a bacterial cell.
  • the problem is solved by a method wherein the organic compound is a toxic organic compound for the cell ,
  • the problem is solved by a method wherein the organic solution further contains at least one organic solvent, preferably a fatty acid and / or or a fatty acid ester.
  • the object underlying the invention is achieved in a second aspect by a reaction mixture comprising an aqueous solution and a hydrophobic organic solution, wherein the hydrophobic organic solution is a fatty acid, more preferably a fatty acid having more than 12 or 14 to 22 or 16 to 18 carbon atoms, more preferably, an unsaturated fatty acid as a liquid cation exchanger, and wherein the aqueous solution comprises an organic compound having at least two amino groups and no negatively charged functional group.
  • the hydrophobic organic solution is a fatty acid, more preferably a fatty acid having more than 12 or 14 to 22 or 16 to 18 carbon atoms, more preferably, an unsaturated fatty acid as a liquid cation exchanger
  • the aqueous solution comprises an organic compound having at least two amino groups and no negatively charged functional group.
  • the problem is solved by one wherein the aqueous solution further comprises an intact cell having catalytic activity, preferably a bacterial cell, more preferably E. coli.
  • the problem is solved by a reaction mixture according to any one of claims 14 to 15, wherein the organic compound is a compound of formula H 2 N - (CH 2 ) X - NH 2 , and x is 1 to 20, preferably 6 to 10.
  • the problem is solved by a reaction mixture wherein the organic diamine is a ring-shaped sugar having at least two amino groups, preferably diaminoisoidite and diaminoisosorbitol.
  • the object underlying the invention is achieved in a third aspect by a method for removing an organic compound having one or more positive charges from an aqueous solution, comprising the steps: a) providing the aqueous solution containing the organic compound and a hydrophobic organic solution comprising a liquid cation exchanger, wherein the liquid cation exchanger is hydrophobic,
  • liquid cation exchanger has one or more negative charges and a negative total charge
  • the method comprises the step of: d) working up the organic solution, preferably by back-extraction of the organic
  • the temperature at step b) of the process according to the invention is 28 to 70 ° C, preferably 30 to 37 ° C.
  • the pH at step b) of the method according to the invention is 3 to 8, preferably 6 to 8, particularly preferably 6, 2 to 7.2.
  • a fourth embodiment of the third aspect of the present invention which is also an embodiment of the first to third embodiments of the present invention the molar ratio of liquid cation exchanger to organic compound in the process at least 1.
  • the volume ratio of organic solution to aqueous solution is 1:10 to 10: 1.
  • the organic compound has at least one positively charged substituent of the formula (I)
  • R 2 , R 3 and R 4 are independently selected the group comprising hydrogen, methyl, ethyl, propyl, 2-propyl, butyl, t-butyl, pentyl, hexyl, benzyl, hydroxyl, substituted or unsubstituted and / or straight-chain or branched or cyclic alkyl or alkenyl.
  • the organic compound has the formula (II)
  • the organic compound has the formula III
  • the liquid cation exchanger has at least one alkyl or alkenyl group having at least six carbon atoms and a terminal substituent selected from the group consisting of which comprises -COOH, -OSO 2 H, -OPO (OH) 2 - and -OPO (OH) O- and unprotonated forms thereof.
  • the liquid cation exchanger is an unsaturated fatty acid, preferably oleic acid.
  • the aqueous solution further comprises a biological agent having catalytic activity.
  • the biological agent is a cell, preferably a bacterial cell.
  • the presence of the organic compound adversely affects the catalytic activity.
  • the organic solution further contains at least one organic solvent, preferably a fatty acid and / or a fatty acid ester.
  • the organic solution as the liquid cation exchanger comprises 20 to 80% by volume, preferably 25 to 75% by volume of oleic acid, and as Methyl lauric acid solvent and the organic compound is 12-aminolauric acid methyl ester and in the aqueous solution is a bacterial cell having a catalytic activity involved in the synthesis of 12-aminoluric acid methyl ester.
  • the organic compound is an annular sugar having at least one amino group, preferably having at least two amino groups.
  • the object underlying the invention is achieved by a bioreactor comprising an aqueous solution comprising a biological agent, and a hydrophobic organic solution comprising a liquid cation exchanger.
  • a bioreactor as used herein means any vessel in which biologically useful microorganisms are cultured under controlled conditions and / or for a biotechnological process, preferably the synthesis of an organic compound can be.
  • the liquid cation exchanger is a fatty acid, preferably oleic acid.
  • the hydrophobic organic solution further comprises a fatty acid ester, preferably methyl laurate.
  • the hydrophobic organic solution comprises oleic acid as the cation exchanger and 25 to 75% by volume of lauric acid methyl ester as the solvent.
  • the organic compound is a compound according to any one of the embodiments of the first aspect of the invention.
  • the object underlying the present invention is achieved by a process for producing an organic compound having one or more positive charges, wherein the organic compound is toxic to cells, comprising culturing in an aqueous solution of the synthesis of the organic compound cells involved, preferably cells which catalyze at least one step of the synthesis, in the presence of a hydrophobic organic solution comprising a liquid cation exchanger and optionally an organic solvent.
  • the organic compound is 12-aminolauric acid or methyl ester
  • the organic solvent is methyl lauric acid
  • the inventors of the present invention have found that the efficiency of removing an organic compound having one or more positive charges from an aqueous solution into a hydrophobic organic solution can be surprisingly increased when this organic solution a liquid cation exchanger.
  • the inventors of the present invention speculate that the negative charge (s) of the liquid cation exchanger ionically interacts with and interacts with the one or more positive charges of the organic compounds masking at least one positive charge which increases the solubility in the organic phase.
  • liquid cation exchanger means a hydrophobic organic solvent-soluble compound which is capable of forming an ionic interaction with at least one cation due to one or more negative permanent charges liquid cation exchanger at least one saturated or unsaturated hydrocarbon chain which may be straight-chain or branched and one negative charged group, for example a carboxy group
  • the liquid ion exchanger is a fatty acid, in an even preferred embodiment an unsaturated fatty acid,
  • the liquid ion exchanger is di (2-ethylhexly) phosphoric acid (also referred to as DEHPA or D2EHPA).
  • the liquid ion exchanger not only has a negative total charge, but no positive charge at all.
  • total charge of the ion exchanger or other molecule as used herein means the sum of charges of all the functional groups covalently linked to the molecule, for example, lauric acid has a negative charge as the total charge, regardless of Presence of other molecules or counterions present in the aqueous solution.
  • the term "contacting" as used herein means that two phases are exposed directly and in particular without the interposition of a physical barrier, such as a membrane, in the simplest case both phases are added to the same vessel and mixed in a suitable manner, for example by stirring with each other.
  • the organic compound has a positive total charge. In a further preferred embodiment, the organic compound has no negative charges. In a preferred embodiment, the organic compound is an ⁇ -aminocarboxylic acid. In a preferred embodiment, the phrase "one or more" charges of a particular type means at least one corresponding charge.
  • the term "has a charge, as used herein, means that a compound so designated has a corresponding charge in aqueous solution at pH 0 to 14, preferably 2 to 12, 2 to 6, 8 to 12, 3 to 10 6 to 8, most preferably at pH 7. In a preferred embodiment, it is a permanent charge. In a further preferred embodiment, the term "has a charge, as used herein, means that the corresponding functional group or compound at pH 7 is predominantly of the corresponding charge, ie, at least 50, more preferably 90, more preferably 99%. In another preferred embodiment, an amino group (-NH 2 ) in a molecule counts as a positive charge group, whether completely, partially or not at all protonated. In a preferred embodiment of the invention, the term “containing” in the sense of “comprising”, ie not to be understood as exhaustive. A mixture containing A can have other constituents in addition to A in this sense.
  • the term "hydrophobic” as used herein is understood to mean the property of a liquid to form, in the presence of an aqueous phase, its own liquid phase clearly defined from the aqueous phase
  • the term “hydrophobic” as used herein is understood to mean the property of a compound not to dissolve in water substantially.
  • the term is understood to mean that such designated compound has a P value (J. Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997) whose decadic logarithm is greater than 0, more preferably greater than 0.5, even more preferably greater than 1, and most preferably greater than 2.
  • the liquid ion exchanger has no or only a moderate toxic effect on biotechnologically relevant microorganisms.
  • toxic effect in a preferred embodiment of the invention, the property of a compound is understood upon contact with the corresponding Microorganisms to reduce their growth rate, reduce their metabolic activity, increase their energy consumption, reduce their optical density or number of viable cells and / or directly lead to their death and lysis.
  • at least one of these effects is achieved in a toxic compound already in low concentration, preferably at a concentration of 1000, more preferably 100, even more preferably 50 or 25, most preferably 5 mg / L.
  • a "moderate toxic effect” is understood to mean that growth-phase microorganisms continue to grow and / or metabolically active in the presence of the compound, but to a lesser extent than a control obtained under the same conditions in the absence of the corresponding compound incubated, and / or have a prolonged lag phase.
  • the contacting of aqueous and organic solution takes place under suitable conditions, and more particularly over a period of time sufficient for sufficient transfer of the organic compound from the aqueous phase to the organic phase, ideally even for the adjustment of the corresponding equilibrium.
  • This period of time and conditions may be determined by those skilled in the art in the context of routine experimentation.
  • the organic compound having one or more positive charges is a terminally aminated fatty acid, more preferably 12-amino lauric acid or an ester thereof or a mixture of both compounds.
  • a terminally aminated fatty acid more preferably 12-amino lauric acid or an ester thereof or a mixture of both compounds.
  • an ester of a fatty acid in the presence of a biological system comprising esterase activities may be partially in the form of the corresponding acid and both compounds are considered equivalent in this respect.
  • fatty acids or fatty acid derivatives as used herein also include the corresponding esters, preferably methyl esters, and vice versa.
  • alkylene group as used herein is a group of the formula - (CH 2 ) n -, ie, an alkane having two open, preferably terminal, substituents For example, it may be an amino group and a carboxy group At least 3, more preferably at least 6, even more preferably 11.
  • a "substituted alkylene chain” at least one hydrogen atom is replaced by a substituent other than a hydrogen atom or an alkyl group, preferably an atom other than a hydrogen atom "unsubstituted alkylene” as used herein, however, is a hydrocarbon chain of the formula - (CH 2) n - without such substituents
  • the organic compound having one or more positive charges is an annular sugar.
  • this annular sugar has at least two amino groups.
  • the "ring sugar" is a sugar selected from diamino-dianhydro-dideoxy-hexitols, especially 2,5-diamino-1, 4: 3,6-dianhydro-2,5- Dideoxy-D-hexitol, in a most preferred embodiment, its three stereoisomers, 2,5-diamino-1, 4: 3,6-dianhydro-2,5-dideoxy-D-mannitol (I), 2,5-diamino-1 , 4: 3,6-Dianhydro-2,5-dideoxy-D-glucitol (II) and 2,5-diamino-5 1,4: 3, 6-dianhydro-2,5-dideoxy-L-iditol (III ), which differ in chirality at positions 2 and 5.
  • the amino groups may be in the endo, endo (I), endo, exo (II) or exo, exo (III) position, referring to the chair shape of the
  • a compound selected from the group consisting of selected from the group consisting of a compound is used as the solvent which comprises kerosene (K), benzyl benzoate (B), methyl laurate (ML), cis-9-octadecene-1-ol (OD).
  • the organic compound is DAI (diaminoisoidite) or DAS (diaminoisosorbitol)
  • the liquid cation exchanger is an unsaturated fatty acid, preferred oleic acid
  • the aqueous phase has a pH of at least 6.5 or 7, preferably 7 to 10, more preferably 7.5 to 9.5.
  • the organic compound is DAI or DAS
  • the liquid cation exchanger is DEHPA
  • the aqueous phase has a pH of at least 3 or at least 3.5, preferably 3 to 8, preferably 4 to 10, more preferably 4.5 to 9, even more preferably 4.5 to 7 or 5 to 8.
  • the mixture resulting from contacting the aqueous and hydrophobic phases is subjected to increased phase separation as part of step c) or in an additional step to promote phase separation.
  • the temperature can be raised above 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 or 95 ° C.
  • the temperature at step b) depends not only on the properties of the liquid cation exchanger, but also, especially in the case where the contacting of the aqueous and the organic solution takes place in the aqueous phase during the reaction, also on the temperature requirements of, where appropriate aqueous phase reactions take place.
  • the temperature at step b) is 0 to 100 ° C, more preferably 20 to 80 ° C, 28 to 70 ° C, 30 to 37 ° C, 35 to 40 ° C.
  • the pH at step b) must take into account the requirements of any concurrent reactions, the stability of starting materials, products, intermediates or agents.
  • the pH is 3 to 8, more preferably 6 to 8, even more preferably 6.2 to 7.2.
  • the molar ratio of liquid cation exchanger and organic compound in at least one step in a continuous process summed over the entire course of the reaction is at least 1, ie at least one molecule of liquid cation exchanger is used per molecule of the organic compound. In a more preferred embodiment, the ratio is greater than 2, 3, 5, 10, 15, or 20, preferably 1.5 to 3. In a preferred embodiment, it is determined whether the cation exchanger is a liquid cation exchanger its state of aggregation at the process temperature, preferably at 37 ° C.
  • a mixture can be prepared which is liquid at the process temperature, preferably at 37 ° C, and comprises the liquid cation exchanger.
  • the volume ratio of the organic solution to the aqueous solution, together with the molar ratio of cation exchanger / organic compound, is important for an efficient process. In a particular embodiment, it is 100: 1 to 1: 100, more preferably 20: 1 to 1:20, even more preferably 10: 1 to 1:10, 4: 1 to 1: 4, 3: 1 to 1: 3 or am most preferably 1: 2 to 2: 1.
  • a fatty acid is used as the liquid cation exchanger.
  • the term "fatty acid” as used herein means a carboxylic acid, preferably alkanoic acid, having at least 6, preferably 8, more preferably 10, most preferably 12 carbon atoms
  • it is saturated fatty acids, in a particularly preferred embodiment it is unsaturated.
  • it is a straight-chain fatty acid having at least 12 carbon atoms, comprising one Double bond, preferably at position 9.
  • it is a monounsaturated fatty acid in which the double bond is at the position 9 and / or 1 1.
  • the liquid cation exchanger to an unsaturated fatty acid selected from the group comprising oleic acid, palmitoleic acid and gadoleic acid and icosenoic acid.
  • the most preferred embodiment is oleic acid.
  • it is a fatty acid having 6, 7, 8 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 carbon atoms, preferably more than 12, more preferably more than 14 carbon atoms, even more preferably 14 to 28, 14 to 22, most preferably 16 to 18 carbon atoms.
  • liquid ion exchanger a mixture of different fatty acids is used as the liquid ion exchanger, as it is present, for example, in the form of soybean oil or ball diuretic oil.
  • the fatty acids may still have to be released by hydrolysis of the corresponding esters, which can be done by lowering the pH or similar measures known to the person skilled in the art as a routine method.
  • a combination of two liquid cation exchangers, preferably at least one of them, is a fatty acid.
  • a particular advantage of the present invention lies in the compatibility of the method according to the invention with biotechnological methods and biological agents used therein.
  • the term "biological agent having catalytic activity” as used herein is understood to mean a cell-synthesized biocatalyst in all purification steps, from the entire cell to the isolated molecule one cell expressing enzymes having catalytic activity
  • the cell may be a prokaryote, including arches, or a eukaryote, preferably from the group comprising Pseudomonas, Corynebacterium and E. coli, in a more preferred embodiment the agent is a bacterial cell, more preferably a Gram-negative bacterial cell, most preferably E.
  • coli coli.
  • Another preferred embodiment is a eukaryotic cell, more preferably a fungal cell, more preferably a yeast cell most preferably Saccharomyc it or Candida, Pichia, in particular Candida tropicalis.
  • the term "cell” is, in a particular embodiment, used synonymously and interchangeably with the term "microorganism” in this application.
  • the cell may be an isolated cell or a mixture of cultures.
  • the cell used as a biological agent may be viable, or it may be a preparation thereof, for example, a membrane fraction or cytosolic fraction or a crude extract of the cell.
  • the biological agent when it is an isolated molecule at different purification levels, it can be any of the catalytically active molecules produced by a cell. In a particularly preferred embodiment, it is a molecule from the group comprising peptides, polypeptides, carbohydrates, nucleic acids or mixed forms thereof. In a more preferred embodiment, it is a catalytically active polypeptide. In a further preferred embodiment, it is an immobilized molecule.
  • catalytic activity is a synthetic activity, ie, the catalysis of chemical reactions involving the formation of at least one new covalent bond.
  • a transport activity ie the ability of a molecule to effect the transport of another molecule from one compartment to another, eg the uptake of a substance from the aqueous medium across a cell membrane into the interior of the cell.
  • the biological agent is a living cell used for catalysis in the presence of the liquid cation exchanger, preferably to synthesize an organic compound having one or more positive charges which are subsequently or simultaneously reacted by means of the liquid Cation exchanger is removed in a hydrophobic organic phase.
  • the presence of the organic compound adversely affects the catalytic activity. In one embodiment, this may reduce the amount of activity present expressible in terms of a lower ka of an enzyme. In a further embodiment, the affinity of the agent exhibiting the catalytic activity may be affected in terms of increased K M of an enzyme. In a further embodiment, the specificity of the catalytic activity may be altered, for example in such a way that it preferably reacts or preferably reacts other than the desired substrate molecule. In another embodiment, the organic compound has a toxic effect on a cell as a biological agent. In another embodiment, the organic compound is an organic compound that reduces the availability of an essential co-substrate or coenzyme.
  • the hydrophobic organic phase may further contain a hydrophobic solvent.
  • a hydrophobic solvent This can serve to increase the uptake capacity of a liquid cation exchanger in the hydrophobic phase and to prevent undesirable behavior such as flocculation.
  • the solvent is an educt of a reaction taking place in the aqueous solution, most preferably the substrate of an enzyme-catalyzed reaction taking place in the aqueous solution. In a preferred embodiment, it is a fatty acid ester.
  • the solvent is a fatty acid ester, preferably methyl ester, a fatty acid which serves as a liquid cation exchanger.
  • the proportion of the solvent, if present, of the hydrophobic organic phase in a preferred embodiment is 1 to 99 volume percent (vol .-%). In a preferred embodiment, the proportion of the solvent is 10 to 90, more preferably 20 to 80, most preferably 25 to 75 vol%.
  • the organic compound is 12-aminolauric acid and / or 12-aminolauric acid methyl ester in the aqueous phase from a recombinant E. coli strain by stepwise oxidation of the terminal carbon atom of methyl laurate is prepared as disclosed in DE 10200710060705, and the hydrophobic phase comprises 25 to 75% oleic acid as a liquid cation exchanger dissolved in methyl laurate as a substrate of the reaction.
  • the organic compound is a compound of the formula H 2 N - (CH 2 ) X - NH 2 .
  • x can be the values 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10.
  • Figure 1 shows a control experiment to confirm that LSME is non-toxic, probed with an E. coli W3110 strain and compared to potassium phosphate buffer (Kpi) as a negative control.
  • Fig. 2 shows the viability of the strain E. coli W3110 in terms of the number of cfus that the strain can form in the absence of a liquid cation exchanger and in the presence of various liquid cation exchangers after 0 h, 4 h and 24 h.
  • Figure 3a shows the results of removal of diaminoisoidite (DAI) and diaminoisosorbitol (DAS) from an aqueous phase using D2EHPA as the liquid cation exchanger.
  • DAI diaminoisoidite
  • DAS diaminoisosorbitol
  • Figure 3b shows the results of the removal of DAI and DAS from an aqueous phase using oleic acid as the liquid cation exchanger.
  • Figure 3c shows the results of the removal of DAI and DAS from an aqueous phase without using a liquid cation exchanger.
  • Fig. 4 shows the effect of using a liquid cation exchanger on toxicity from the change in the viable cell count of an E. coli W3110 strain in the presence of ALSME 0.2% ammonia adjusted DEHPA ("D2EHPNH3 2%"). a DEHPA / LSME blend (2% / 98%) ("D / L”) in the presence of ALSME 0.2%.
  • Figure 5 shows the effect of various liquid cation exchangers on the OTR of aminolauric acid methyl ester producing E. coli strain. The experiment was carried out as described in Example 5.
  • Figure 6 shows the effect of various liquid cation exchangers on the yield of methyl aminolaurate producing an E. coli strain with appropriate genetic modification. The experiment was carried out as described in Example 5.
  • Example 1 Toxicity test of the solvent LSME used in compositions with liquid cation exchangers.
  • a plate LB (10 g / L peptone from casein, 5 g / L yeast extract, 10 g / L NaCl) was streaked with E. coli BW3110 and incubated for 24 h. On the evening of the following day, a preculture of this previously slashed plate was inoculated. This preculture had a volume of 50 mL LB medium and was incubated overnight for approximately 16 h.
  • the cells were harvested, centrifuged at 5258 g and 4 ° C for 10 min and incubated with an OD 60 o of 30 in 10 mL 50mM Kp r buffer at pH 7.4 (or 25mM HEPES buffer pH 7, 4, when CFU determinations were performed with ALSME). Both buffer solutions used contained 5% glucose (w / v). Subsequently, the bacterial suspension was transferred to the shake flasks and mixed with the respective substance solutions. After mixing by swirling the flask, 100 of the suspension were pipetted out and filled into 900 sterile saline. This corresponded to sampling at time t 0 .
  • the OD 60 o was 60.
  • the cells were resuspended in 10 mL Kpi buffer and then mixed in the flask with 5 mL LSME 98% (w / w).
  • One dilution step per batch was plated.
  • the number of CFU / mL remained constant over the period of 6 hours. After 22 h, a percentage decline in the viable cell count of only 30.3% was recorded.
  • a preculture containing 20 ml of LB medium in a 100 ml baffled flask was inoculated with a cryoculture of the corresponding strain.
  • the culture was cultured overnight at 37 ° C and shaking at 200 rpm and used the next day to inoculate a same major culture to an OD of 0.2.
  • the main cultures (each 30mL LB medium) were then further incubated under the same conditions. At an OD of 0.4 to 0.5, the main culture was overlaid with equal volumes (30 ml) of solvent and then further incubated.
  • cfu colony-forming units or colony-forming units
  • liquid cation exchangers significantly reduce the number of cfus, but when lauric acid is used, in contrast to DEHPA, there are still some viable cells and the saturated fatty acid is therefore preferable as a liquid cation exchanger.
  • LSME lauric acid methyl ester
  • Kerosene (K), benzyl benzoate (B), lauric acid methyl ester (ML), cis-9-octadecene-1-ol (OD) were used as organic solvents.
  • oleic acid and D2EHPA were compared in their effect with the respective pure solvent.
  • the aqueous phase contained 2% by weight of diamine and the organic phase consisted of the corresponding solvent and 20 Wt .-% of the respective liquid cation exchanger.
  • the volume ratio of the two phases was 1: 1 (4.5 ml each).
  • T 30 ° C
  • the samples were shaken for 2 hours in a water bath. This was followed by centrifugation and phase separation, the analysis of the phases.
  • the pH was adjusted in all cases with aqueous ammonia or sulfuric acid.
  • Fig. 3a shows the results of the reactive extraction with D2EHPA as a liquid cation exchanger.
  • the degree of extraction at a pH range of 5.4 to 6.2 is about 100%.
  • the addition of acid leads to a significant decrease in the degree of extraction.
  • With the addition of a small amount of lye no influence on the degree of extraction can be detected in the experiments with benzyl benzoate. When a lot of lye was added, the initial pH being 11 to 12, the experiments were not evaluable.
  • the bacteria were first resuspended in 5 mL (equal to half the buffer volume). Additional 5 mL buffers were mixed with 0.4% (w / v) ALSME if necessary and subsequently with 5 mL D2EHPNH3 / LSME 2/98% (w / w) for 1 min at 3000 rpm vortexed. This solution was added to the bacterial suspension presented in the shake flask and mixed. Then the first sampling took place. The solution had a foamy consistency at the beginning of the experiments, but had disappeared in the second sampling in both experiments.
  • D / L The abbreviation "D / L" was used for D2EHPNH3 (ammonia loaded D2EHPA) / LSME 2/98% (w / w). Between sampling t 0 and ti > 5 h, the number of CFU / mL increased by 34.3%. From sampling (ti > 5 ) to the last sampling (t 2 2), the number of CFU / mL decreased by 54.9%. Compared with the approach with D2EHPNH3 / LSME 2/98% (w / w) without the addition of ALSME 0.2% (w / v), the number of viable cells was 4.5 times higher after 22 h and 3.4 % not significantly lower than the mean of controls in HEPES buffer (see FIG. 4). Compared to the ALSME 0.2% (w / v) batch in the shake flask, without addition of an organic phase, the number of CFU / mL was 2800 times higher.
  • Example 5 Comparative Experiments on the Toxicity of Various Liquid Cation Exchangers to a ⁇ -Aminolauric Acid (ALS) and the Methyl Ester (ALSME) Producing Microorganism
  • ALS ⁇ -Aminolauric Acid
  • ALSME Methyl Ester
  • IL reactors were used for the fermentation.
  • the pH probes were calibrated by means of a two-point calibration with pH 4.0 and pH 7.0 custom solutions.
  • the reactors were filled with 300 mL of water and autoclaved at 121 ° C for 20 minutes to ensure sterility. Subsequently, the pO 2 probes were polarized overnight (for at least 6 h). The next morning, the water was removed under the Clean Bench and replaced with high cell density medium containing 50 mg / L kanamycin and 34 mg / L chloramphenicol.
  • the p02 probes were calibrated with a one-point calibration (stirrer: 600 rpm / gassing: 10 sL / h air) and the feed, correction agent and induction agent sections were cleaned by means of clean-in-place.
  • the tubes were rinsed with 70% ethanol, then with 1 M NaOH, then with sterile demineralized water and finally filled with the respective media.
  • the ALS and ALSME producing E.
  • coli strain BL21 (DE3) TIr pBTIO pACYC Duet [TAcv] was first extracted from cryoculture in LB medium (25 mL in a 100 mL baffled flask) with 50 mg / L kanamycin and 34 mg / L Chloramphenicol attracted overnight at 37 ° C and 200 rpm for about 18 h.
  • the 3 cultures were combined in a shake flask and the optical density was determined to be 7.2.
  • the optical density was determined to be 7.2.
  • 1, 4.2 mL each were drawn up in a 5 mL syringe and the reactors were cannulated by cannula via a septum.
  • the experiment can be divided into two phases, the cultivation, in which the cells should reach a certain optical density, and the subsequent biotransformation, in which the expression of the genes required for the biotechnological process for the production of ALSME was induced.
  • the pH was adjusted unilaterally with ammonia (12.5%) to pH 6.8.
  • the dissolved oxygen (DO) in the culture was controlled by stirrer speed and gassing rate at 30%.
  • the fermentation was carried out as a feedbatch with the feed start, 5 g / Lh glucose feed (500 g / L glucose with 1% MgS0 4 * 7H 2 O and 2.2% NH 4 Cl) being triggered via a DO peak.
  • Feedstart the temperature was lowered from 37 ° C to 30 ° C.
  • the ion exchangers used were di (2-ethylhexyl) phosphoric acid (DEHPA), lauric acid, oleic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid and a mixture of free fatty acids from the saponification of ball diuretic oil.
  • DEHPA di (2-ethylhexyl) phosphoric acid
  • lauric acid oleic acid
  • palmitic acid palmitoleic acid
  • stearic acid a mixture of free fatty acids from the saponification of ball diuretic oil.
  • Quantification of ALS, ALSME, DDS, DDSME, LS, LSME, HLS, OLS and OLSME in fermentation samples was performed by LC-ESI / MS 2 using an external calibration for all analytes and using the internal standard aminoundecanoic acid (AUD). The following devices were used:
  • HPLC system 1260 Align; Böblingen
  • autosampler G1367E
  • binary pump G1312B
  • column oven G1316A
  • HPLC column Kinetex C18, 100 ⁇ 2, 1 mm, particle size: 2.6 ⁇ m, pore size 100 ⁇ (Phenomenex, Aillesburg)
  • the HPLC separation was carried out with the above column or precolumn.
  • the injection volume was 0.7 ⁇ ⁇ , the column temperature 50 ° C, the flow rate 0.6 mL / min.
  • the mobile phase consisted of eluent A (0.1% (v / v) aqueous formic acid) and eluent B (acetonitrile with 0.1% (v / v) formic acid).
  • the following gradient profile was used
  • unsaturated fatty acids such as palmitoleic acid, saponified Kugeldistelöl (contains predominantly linoleic acid) and oleic acid surprisingly leads to significantly better results. These fatty acids surprisingly show even lower toxicity than the saturated fatty acids.

Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft ein Verfahren zum Entfernen einer eine oder mehrere positive Ladungen aufweisenden organischen Verbindung aus einer wässrigen Lösung, umfassend die Schritte a) Bereitstellen der die organische Verbindung enthaltenden wässrigen Lösung und einer hydrophoben organischen Lösung, die einen flüssigen Kationenaustauscher umfasst, wobei der flüssige Kationenaustauscher hydrophob ist, und wobei der flüssige Kationenaustauscher eine oder mehrere negative Ladungen und eine negative Gesamtladung aufweist, b) Kontaktieren der wässrigen Lösung und der organischen Lösung, und c) Abtrennen der organischen Lösung von der wässrigen Lösung.

Description

Flüssiger Kationenaustauscher
Die vorliegende Anmeldung betrifft ein Verfahren zum Entfernen einer eine oder mehrere positive Ladungen aufweisenden organischen Verbindung aus einer wässrigen Lösung, umfassend die Schritte a) Bereitstellen der die organische Verbindung enthaltenden wässrigen Lösung und einer hydrophoben organischen Lösung, die einen flüssigen Kationenaustauscher umfasst, wobei der flüssige Kationenaustauscher hydrophob ist, und wobei der flüssige Kationenaustauscher eine oder mehrere negative Ladungen und eine negative Gesamtladung aufweist, b) Kontaktieren der wässrigen Lösung und der organischen Lösung, und c) Abtrennen der organischen Lösung von der wässrigen Lösung, wobei es sich bei dem flüssigen Kationenaustauscher um eine Fettsäure handelt, und wobei die organische Verbindung wenigstens zwei Aminogruppen und keine negativ geladene funktionelle Gruppe aufweist, sowie entsprechende Reaktionsmischungen.
Ein grundlegendes Problem bei der von nachwachsenden Rohstoffen ausgehenden biotechnologischen Herstellung von Feinchemikalien, die herkömmlicherweise ausgehend von fossilen Brennstoffen synthetisiert werden, besteht darin, das einmal erhaltene Produkt, das typischerweise in einer großvolumigen wässrigen Phase vorliegt, in eine organische Phase zu überführen. Diese Überführung führt man einerseits durch, um ein fertiges Zwischen- oder Endprodukt zu konzentrieren und um ggf. die synthetische Verarbeitung in folgenden Reaktionsschritten in organischer Lösung zu ermöglichen, andererseits, um die Ausbeute der Reaktion in der wässrigen Phase durch das Entfernen des erwünschten Produktes zu verbessern oder den Ablauf der Reaktion in einem technisch sinnvollen Rahmen überhaupt erst zu ermöglichen. Die direkte thermische Aufkonzentrierung des häufig in niedrigen Konzentrationen vorliegenden Produktes aus der großvolumigen wässrigen Lösung ist in der Regel nicht sinnvoll.
Die Verteilung einer Verbindung in einem Zweiphasensystem umfassend eine wässrige, hydrophile Phase und eine organische, hydrophobe Phase, die sich nicht mischen, hängt maßgeblich von den physikochemischen Eigenschaften der jeweiligen Verbindung ab. Während Verbindungen mit einem hohen Anteil an oder ausschließlich bestehend aus unsubstituierten Kohlenwasserstoffen sich überwiegend in der hydrophoben Phase anreichern, liegen Verbindung mit einem hohen Anteil an polaren Gruppen wie heteroatomhaltigen Funktionalitäten und ganz besonders Verbindungen mit Ladungen überwiegend oder praktisch ausschließlich in der wässrigen Phase vor, was eine Überführung in eine organische Phase erschwert.
Die Verteilung einer Verbindung in dem genannten Zweiphasensystem nach Einstellung des Gleichgewichts wird häufig mit Hilfe von Verteilungskoeffizienten, beispielsweise nach der Nernst' sehen Gleichung
Ot = C Phase 1 / Cphase 2, beschrieben. Ein spezieller Verteilungskoeffizient ist Kow, auch als P-Wert bezeichnet, der das Verteilungsgleichgewicht einer Verbindung zwischen einer Oktanol- und einer wässrigen Phase charakterisiert:
K0w P Coktanol / Cwasser
Ein Beispiel für eine industriell stark nachgefragte, positiv geladene organische Verbindung stellen 12- Aminolaurinsäure (ALS) und deren Derivate, insbesondere der Methylester (ALSME) dar. ALS ist ein wichtiges Ausgangsprodukt bei der Herstellung von Polymeren, beispielsweise zur Herstellung von Leitungssystemen und Nylon. Herkömmlich wird ALS ausgehend von fossilen Rohstoffen in einem Prozess mit niedriger Ausbeute über Laurinlactam hergestellt, das durch Trimerisierung von Butadien, anschließende Hydrierung unter Bildung von Cyclododecan, anschließende Oxidation zu Cyclododecanon, Umsetzung mit Hydroxylaurin und anschließender Beckmann-Umlagerung synthetisiert wird. Ein vielversprechender Weg zur biotechnologischen Herstellung von ALS bzw. ALSME ist in der DE10200710060705 beschrieben.
Der Stand der Technik lehrt die Gewinnung positiv geladener organischer Verbindungen durch Kontaktieren einer wässrigen Reaktionsmischung umfassend ein biologisches Agens mit einer organischen Phase umfassend ein organisches Lösungsmittel. So beschreibt beispielsweise DE 10200710060705 die Gewinnung des Produktes ALSME durch Ausschütteln mit Essigsäureethylester aus einem wässrigen Reaktionsgemisch. Asano et al. (2008) offenbaren die Extraktion von ALS mit Toluol aus einer wässrigen Reaktionslösung umfassend ein ALS synthetisierendes Enzym.
Der vorliegenden Erfindung daher liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Entfernung positiv geladener organischer Verbindungen mit wenigstens einer positiven Ladung aus einer wässrigen Reaktionsmischung zu entwickeln, wobei eine möglichst vorteilhafte Lage der Verteilungsgleichgewichtes zwischen Reaktionsmischung und einer als Extraktionsmittel verwendeten hydrophoben organischen Phase erwünscht ist, d. h. das Verteilungsgleichgewicht soll möglichst weit auf der Seite der hydrophoben organischen Phase liegen.
Eine weitere der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Entfernung organischer Verbindungen mit wenigstens einer positiven Ladung aus einer wässrigen Lösung umfassend ein biologisches Agens unter Verwendung einer hydrophoben organischen Phase als Extraktionsmittel zu entwickeln, bei dem das Verteilungsgleichgewicht möglichst weit auf der Seite der hydrophoben organischen Phase liegt.
Eine weitere der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Entfernung organischer Verbindungen mit wenigstens einer positiven Ladung aus einer wässrigen Lösung unter Verwendung einer hydrophoben organischen Lösung als Extraktionsmittel zu entwickeln, das das Wachstum von biotechnologisch relevanten Mikroorganismen, insbesondere Escherichia coli, möglichst wenig beeinträchtigt bzw. verlangsamt und/oder die Zahl teilungsfähiger und/oder lebensfähiger und/oder respiratorisch aktiver Zellen dabei möglichst wenig senkt.
Schließlich liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Entfernung einer organischen Verbindung mit wenigstens einer positiven Ladung aus einer wässrigen Lösung umfassend ein biologisches Agens unter Verwendung einer hydrophoben organischen Phase als Extraktionsmittel aufzufinden, bei dem die Gesamtheit der für die Ausbeute, den Gesamtumsatz und schnelle Durchführbarkeit eines zugrundeliegenden biotechnologischen Syntheseverfahrens entscheidenden Eigenschaften, insbesondere die Toxizität der organischen Phase gegenüber dem biologischen Agens und die Aufnahme der Verbindung in das organische Extraktionsmittel, mit Hinblick auf die Gesamtausbeute oder einen schnelleren Ablauf oder, im Falle eines kontinuierlichen Prozesses, eine möglichst lange Verwendbarkeit des biologischen Agens optimiert ist, besonders für den Fall, dass die organische Verbindung mit wenigstens einer positiven Ladung das Produkt oder ein Zwischenprodukt des Syntheseverfahrens darstellt, das unter Beteiligung einer katalytischen Aktivität des biologischen Agens synthetisiert wird.
Diese und weitere Aufgaben werden durch den Gegenstand der vorliegenden Anmeldung und insbesondere auch durch den Gegenstand der beigefügten unabhängigen Ansprüche gelöst, wobei sich Ausführungsformen aus den Unteransprüchen ergeben. Das der Erfindung zu Grunde liegende Problem wird in einem ersten Aspekt gelöst durch ein Verfahren zum Entfernen einer eine oder mehrere positive Ladungen aufweisenden organischen Verbindung aus einer wässrigen Lösung, umfassend die Schritte a) Bereitstellen der die organische Verbindung enthaltenden wässrigen Lösung und einer hydrophoben organischen Lösung, die einen flüssigen Kationenaustauscher umfasst, wobei der flüssige Kationenaustauscher hydrophob ist, b) Kontaktieren der wässrigen Lösung und der organischen Lösung, und c) Abtrennen der organischen Lösung von der wässrigen Lösung, wobei es sich bei dem flüssigen Kationenaustauscher um eine Fettsäure handelt, und wobei die organische Verbindung wenigstens zwei Aminogruppen und keine negativ geladene funktionelle Gruppe aufweist
In einer ersten Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung beträgt die Temperatur bei Schritt b) 28 bis 70, bevorzugt 30 bis 37 °C.
In einer zweiten Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform des ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, beträgt der pH-Wert bei Schritt b) 6 bis 8, bevorzugt 6,2 bis 7,2.
In einer dritten Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform des ersten bis zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, wird das Problem gelöst durch ein Verfahren, wobei es sich bei der organischen Verbindung um eine Verbindung der Formel H2N - (CH2)X - NH2, handelt und x 1 bis 20, bevorzugt 6 bis 10 ist. In einer vierten Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform des ersten bis dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, wird das Problem gelöst durch ein Verfahren, wobei es sich bei dem organischen Diamin um einen ringförmigen Zucker mit wenigstens zwei Aminogruppen handelt, bevorzugt um Diaminoisoidit und Diaminoisosorbit.
In einer fünften Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform des ersten bis vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, wird das Problem gelöst durch ein Verfahren, wobei das Stoffmengenverhältnis von flüssigem Kationenaustauscher zu organischer Verbindung wenigstens 1 beträgt.
In einer sechsten Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform des ersten bis fünften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, wird das Problem gelöst durch ein Verfahren, wobei das Volumenverhältnis von organischer Lösung zu wässriger Lösung 1 : 10 bis 10: 1 beträgt.
In einer siebten Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform des ersten bis sechsten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, wird das Problem gelöst durch ein Verfahren, wobei der flüssige Kationenaustauscher eine Fettsäure mit mehr als 12, bevorzugt mit 14 bis 22, noch bevorzugter 16 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
In einer achten Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform des ersten bis siebten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, wird das Problem gelöst durch ein Verfahren, wobei der flüssige Kationenaustauscher eine ungesättigte Fettsäure, bevorzugt Ölsäure oder Erukasäure, ist.
In einer neunten Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform des ersten bis siebten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, wird das Problem gelöst durch ein Verfahren, wobei die wässrige Lösung weiterhin ein biologisches Agens mit katalytischer Aktivität umfasst.
In einer zehnten Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform des ersten bis neunten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, wird das Problem gelöst durch ein Verfahren, wobei das biologische Agens eine Zelle, bevorzugt eine bakterielle Zelle ist. In einer elften Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform des ersten bis zehnten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, wird das Problem gelöst durch ein Verfahren,, wobei es sich bei der organischen Verbindung um eine für die Zelle toxische organische Verbindung handelt.
In einer zwölften Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform des ersten bis elften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, wird das Problem gelöst durch ein Verfahren, wobei die organische Lösung darüber hinaus mindestens ein organisches Lösungsmittel enthält, bevorzugt eine Fettsäure und/oder einen Fettsäureester.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird in einem zweiten Aspekt gelöst durch eine Reaktionsmischung umfassend eine wässrige Lösung und eine hydrophobe organische Lösung, wobei die hydrophobe organische Lösung eine Fettsäure, bevorzugter eine Fettsäure mit mehr als 12 oder 14 bis 22 oder 16 bis 18 Kohlenstoffatomen, noch bevorzugter eine ungesättigte Fettsäure als flüssigen Kationenaustauscher umfasst, und wobei die wässrige Lösung eine organische Verbindung umfasst, die wenigstens zwei Aminogruppen und keine negativ geladene funktionelle Gruppe aufweist.
In einer ersten Ausfuhrungsform des zweiten Aspektes der vorliegenden Erfindung wird das Problem gelöst durch eine, wobei die wässrige Lösung weiterhin eine intakte Zelle mit katalytischer Aktivität, bevorzugt eine bakterielle Zelle, bevorzugter um E. coli umfasst.
In einer zweiten Ausfuhrungsform des zweiten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform des ersten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, wird das Problem gelöst durch eine Reaktionsmischung nach einem der Ansprüche 14 bis 15, wobei es sich bei der organischen Verbindung um eine Verbindung der Formel H2N - (CH2)X - NH2, handelt und x 1 bis 20, bevorzugt 6 bis 10 ist.
In einer dritten Ausführungsform des zweiten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform des ersten bis zweiten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, wird das Problem gelöst durch eine Reaktionsmischung, wobei es sich bei dem organischen Diamin um einen ringförmigen Zucker mit wenigstens zwei Aminogruppen handelt, bevorzugt um Diaminoisoidit und Diaminoisosorbit.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird in einem dritten Aspekt gelöst durch ein Verfahren zum Entfernen einer eine oder mehrere positive Ladungen aufweisenden organischen Verbindung aus einer wässrigen Lösung, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen der die organische Verbindung enthaltenden wässrigen Lösung und einer hydrophoben organischen Lösung, die einen flüssigen Kationenaustauscher umfasst, wobei der flüssige Kationenaustauscher hydrophob ist,
und wobei der flüssige Kationenaustauscher eine oder mehrere negative Ladungen und eine negative Gesamtladung aufweist,
b) Kontaktieren der wässrigen Lösung und der organischen Lösung, und
c) Abtrennen der organischen Lösung von der wässrigen Lösung.
In einer Ausführungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, umfasst das Verfahren den Schritt: d) Aufarbeiten der organischen Lösung, bevorzugt durch Rückextraktion der organischen
Verbindung in eine weitere wässrige Lösung.
In einer zweiten Ausführungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, beträgt die Temperatur bei Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens 28 bis 70°C, bevorzugt 30 bis 37°C.
In einer dritten Ausführungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, beträgt der pH-Wert bei Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens 3 bis 8, bevorzugt 6 bis 8,besonders bevorzugt 6,2 bis 7,2.
In einer vierten Ausführungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, beträgt das Stoffmengenverhältnis von flüssigem Kationenaustauscher zu organischer Verbindung bei dem Verfahren wenigstens 1.
In einer fünften Ausführungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, beträgt das Volumenverhältnis von organischer Lösung zu wässriger Lösung 1 : 10 bis 10 : 1.
In einer sechsten Ausführungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis fünften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, weist die organische Verbindung wenigstens einen positiv geladenen Substituenten der Formel (I)
-N R2R R4 (I) auf, oder, sofern wenigstens ein Substituent aus der Gruppe umfassend R2, R3 und R4 Wasserstoff ist, die unprotonierte Form davon, wobei R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl, 2-Propyl, Butyl, t-Butyl, Pentyl, Hexyl, Benzyl, Hydroxyl, substituiertes oder unsubstituiertes und/oder geradkettiges oder verzweigtes oder zyklisches Alkyl oder Alkenyl.
In einer siebten Ausführungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis sechsten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, weist die organische Verbindung die Formel (II)
Z-A-N R2R R4 (II) auf, oder, sofern wenigstens ein Substituent aus der Gruppe umfassend R2, R3 und R4 Wasserstoff ist, die unprotonierte Form davon, wobei R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl, 2-Propyl, Butyl, t-Butyl, Pentyl, Hexyl, Benzyl, Hydroxyl, substituiertes oder unsubstituiertes und/oder geradkettiges oder verzweigtes oder zyklisches Alkyl oder Alkenyl, wobei A eine Kohlenwasserstoffkette umfassend wenigstens drei Kohlenstoffatome, bevorzugt eine unsubstituierte Alkenylgruppe darstellt, und wobei Z aus der Gruppe ausg ewählt ist, die -COOH, -COOR5, -COH, -CH2OH und unprotonierte Formen davon umfasst, wobei R5 ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl, 2-Propyl, Butyl, t-Butyl, Pentyl, Hexyl, Benzyl, Hydroxyl, subsitituiertes oder unsubstituiertes und/oder geradkettiges oder verzweigtes oder zyklisches Alkyl oder
Alkenyl.
In einer achten Ausführungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis siebten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, weist die organische Verbindung die Formel III
NH3 -A-COOR1 (III), auf, oder eine unprotonierte Form davon, wobei R1 Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist und A eine unsubstituierte, geradkettige Alkylengruppe mit wenigstens drei Kohlenstoffatomen ist.
In einer neunten Ausführungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis achten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, weist der flüssige Kationen-austauscher wenigstens eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit wenigstens sechs Kohlenstoffatomen auf sowie einen endständigen Substituenten aus der Gruppe, die -COOH, -OS02H, - OPO(OH)2- und -OPO(OH)0- und unprotonierte Formen davon umfasst.
In einer zehnten Ausfuhrungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis neunten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, ist der flüssige Kationenaustauscher eine ungesättigte Fettsäure, bevorzugt Ölsäure.
In einer elften Ausfuhrungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis zehnten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, umfasst die wässrige Lösung weiterhin ein biologisches Agens mit katalytischer Aktivität. In einer zwölften Ausführungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis elften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, ist das biologische Agens eine Zelle, bevorzugt eine bakterielle Zelle.
In einer vierzehnten Ausführungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis zwölften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, wirkt sich die Anwesenheit der organischen Verbindung nachteilig auf die katalytische Aktivität aus. In einer fünfzehnten Ausführungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis dreizehnten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, enthält die organische Lösung darüber hinaus mindestens ein organisches Lösungsmittel, bevorzugt eine Fettsäure und/oder einen Fettsäureester. In einer sechzehnten Ausführungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis vierzehnten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, umfasst die organische Lösung als flüssigen Kationenaustauscher 20 bis 80 Volumen-%, bevorzugt 25 bis 75 Volumen-% Ölsäure, und als Lösungsmittel Laurinsäuremethylester und es handelt sich bei der organischen Verbindung um 12-Aminolaurinsäuremethylester und in der wässrigen Lösung ist eine bakterielle Zelle anwesend, die eine an der Synthese von 12-Aminolurinsäuremethylester beteiligte katalytische Aktivität aufweist.
In einer siebzehnten Ausführungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis fünfzehnten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, stellt die organische Verbindung einen ringförmigen Zucker mit wenigstens einer Aminogruppe, bevorzugt mit wenigstens zwei Aminogruppen, dar.
In einem vierten Aspekt wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe gelöst durch einen Bioreaktor umfassend eine wässrige Lösung, umfassend ein biologisches Agens, und eine hydrophobe organische Lösung umfassend einen flüssigen Kationenaustauscher. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff„Bioreaktor", wie hierin verwendet, ein jegliches Gefäß verstanden, in dem biotechnologisch nutzbare Mikroorganismen unter kontrollierten Bedingungen kultiviert werden und/oder für ein biotechnologisches Verfahren, bevorzugt die Synthese einer organischen Verbindung, verwendet werden können. In einer ersten Ausführungsform des vierten Aspektes, bei der es sich auch um eine Ausführungsform der ersten Ausführungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung handelt, ist der flüssige Kationenaustauscher eine Fettsäure, bevorzugt Ölsäure.
In einer zweiten Ausführungsform des vierten Aspektes, bei der es sich auch um eine Ausführungsform der ersten Ausführungsform des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung handelt, umfasst die hydrophobe organische Lösung weiterhin einen Fettsäureester, bevorzugt Laurinsäuremethylester. In einer dritten Ausführungsform des vierten Aspektes, bei der es sich auch um eine Ausführungsform der ersten bis zweiten Ausführungsform des zweiten Aspektes der vorliegenden Erfindung handelt, umfasst die hydrophobe organische Lösung als Kationenaustauscher Ölsäure und als Lösungsmittel 25 bis 75 Vol.-% Laurinsäuremethylester. In einer vierten Ausführungsform des vierten Aspektes, bei der es sich auch um eine Ausführungsform der ersten bis dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt, handelt es sich bei der organischen Verbindung um eine Verbindung gemäß einer der Ausführungsformen des ersten Aspektes der Erfindung. In einem fünften Aspekt wird die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung einer organischen Verbindung mit einer oder mehreren positiven Ladungen, wobei die organische Verbindung für Zellen toxisch ist, umfassend Kultivieren in einer wässrigen Lösung von an der Synthese der organischen Verbindung beteiligten Zellen, bevorzugt Zellen, die wenigstens einen Schritt der Synthese katalysieren, in Gegenwart einer hydrophoben organischen Lösung umfassend einen flüssigen Kationenaustauscher und optional ein organisches Lösungsmittel.
In einer ersten Ausführungsform des fünften Aspektes der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der organischen Verbindung um 12-Aminolaurinsäure oder -methylester, bei dem organischen Lösungsmittel um Laurinsäuremethylester.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass die Effizienz der Entfernung einer organischen Verbindung mit einer oder mehreren positiven Ladungen aus einer wässrigen Lösung in eine hydrophobe organische Lösung überraschend gesteigert werden kann, wenn diese organische Lösung einen flüssigen Kationenaustauscher umfasst. Ohne an irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen, vermuten die Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass die negative Ladung bzw. die negativen Ladungen des flüssigen Kationenaustauscher mit der einen positiven Ladung oder den mehreren positiven Ladungen der organischen Verbindungen ionisch interagiert/interagieren und dass diese Interaktion zu einer Maskierung wenigstens einer positiven Ladung führt, welche die Löslichkeit in der organischen Phase erhöht.
In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff„flüssiger Kationenaustauscher", wie hierin verwendet, eine in einem hydrophoben organischen Lösungsmittel lösliche Verbindung, die aufgrund einer oder mehrere negativer permanenter Ladungen in der Lage ist, eine ionische Wechselwirkung mit wenigstens einem Kation auszubilden. Typischerweise umfasst ein flüssiger Kationenaustauscher wenigstens eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette, die geradkettig oder verzweigt sein kann sowie eine negative geladene Gruppe, beispielsweise eine Carboxygruppe. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem flüssigen Ionenaustauscher um eine Fettsäure, in einer noch bevorzugten Ausführungsform um eine ungesättigte Fettsäure, beispielsweise Ölsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem flüssigen Ionenaustauscher um Di(2- ethylhexly)phosphorsäure (auch als DEHPA oder D2EHPA bezeichnet).
In einer bevorzugten Ausführungsform weist der flüssige Ionenaustauscher nicht nur eine negative Gesamtladung, sondern gar keine positive Ladung auf. In einer bevorzugten Ausführungsform ist unter dem Begriff„Gesamtladung" des Ionenaustauscher oder eines sonstigen Moleküls, wie hierin verwendet, die Summe de Ladungen aller kovalent mit dem Molekül verbundenen funktionellen Gruppen zu verstehen. Beispielsweise weist Laurinsäure eine negative Ladung als Gesamtladung auf, unabhängig von der Anwesenheit weiterer Moleküle oder Gegenionen, die in der wässrigen Lösung vorhanden sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Kontaktieren", wie hierin verwendet, verstanden, dass zwei Phasen direkt und insbesondere ohne Zwischenschaltung einer physikalischen Barriere wie einer Membran einander gegenüber exponiert werden. Das Kontaktieren erfolgt im einfachsten Fall dadurch, dass die beiden Phasen ins gleiche Gefäß gegeben und in geeigneter Weise, beispielsweise durch Rühren, mit einander vermischt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die organische Verbindung eine positive Gesamtladung auf. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die organische Verbindung keine negativen Ladungen auf. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der organischen Verbindung um eine ω-Aminocarbonsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet die Formulierung„eine oder mehrere" Ladungen einer bestimmten Art wenigstens eine entsprechende Ladung.
In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „weist eine Ladung auf, wie hierin verwendet, dass eine so bezeichnete Verbindung eine entsprechende Ladung in wässriger Lösung bei pH 0 bis 14, bevorzugte 2 bis 12, 2 bis 6, 8 bis 12, 3 bis 10, 6 bis 8, am bevorzugtesten bei pH 7 aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um eine permanent vorliegende Ladung. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „weist eine Ladung auf, wie hierin verwendet, dass die entsprechende funktionelle Gruppe oder Verbindung bei pH 7 überwiegend mit der entsprechenden Ladung vorliegt, d.h. zu wenigstens 50, bevorzugter 90 noch bevorzugter 99 %. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zählt eine Aminogruppe (-NH2) in einem Molekül als eine Gruppe mit positiver Ladung, unabhängig davon, ob sie vollständig, teilweise oder gar nicht protoniert vorliegt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Begriff „enthaltend" im Sinne von „umfassend", d.h. nicht abschließend zu verstehen. Eine Mischung enthaltend A kann in diesem Sinne neben A weitere Bestandteile aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter dem Begriff„hydrophob", wie hierin verwendet, die Eigenschaft einer Flüssigkeit verstanden, in Anwesenheit von einer wässrigen Phase eine eigene, von der wässrigen Phase klar abgegrenzte flüssige Phase auszubilden. Bei letzterer kann es sich um eine zusammenhängende flüssige Phase oder um eine Emulsion handeln. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird mit dem Begriff „hydrophob", wie hierin verwendet, die Eigenschaft einer Verbindung verstanden, sich im Wesentlichen nicht in Wasser zu lösen. Schließlich wird der Begriff in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, wie hierin verwendet, derart verstanden, dass eine derartige bezeichnete Verbindung einen P-Wert (J. Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients : Fundamentals and Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997) aufweist, dessen dekadischer Logarithmus größer 0, bevorzugter größer 0,5, noch bevorzugter größer 1 und am bevorzugtesten größer 2 ist.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist der flüssige Ionenaustauscher keine oder nur eine mäßige toxische Wirkung auf biotechnologisch relevante Mikroorganismen auf. Unter dem Begriff „toxische Wirkung", wie hierin verwendet, wird in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Eigenschaft einer Verbindung verstanden, bei Kontakt mit den entsprechenden Mikroorganismen deren Wachstumsgeschwindigkeit zu senken, deren Stoffwechselaktivität zu senken, deren Energieverbrauch zu erhöhen, deren optische Dichte oder Zahl wachstumsfähiger Zellen zu senken und/oder direkt zu deren Absterben und Lyse zu führen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird wenigstens eine dieser Wirkungen bei einer toxischen Verbindung bereits in geringer Konzentration, vorzugsweise bei einer Konzentration von 1000, bevorzugter 100, noch bevorzugter 50 oder 25, am bevorzugtesten 5 mg/L, erreicht. Dem Fachmann sind zahlreiche routinemäßig anwendbare Verfahren bekannt, mittels derer die Toxizität untersucht werden kann. Hierzu zählen beispielsweise die Messung der Atmung entsprechender Mikroorganismen über 02-Elektroden oder das vergleichende Ausplattieren von Mikroorganismenproben und das anschließende Zählen der koloniebildenden Einheiten (cfus). In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter einer„mäßigen toxischen Wirkung" verstanden, dass in einer Wachstumsphase befindliche Mikroorganismen in Anwesenheit der Verbindung weiter wachsen und/oder stoffwechselaktiv sind, jedoch in geringerem Maße als bei einer Kontrolle, die unter gleichen Bedingungen in Abwesenheit der entsprechenden Verbindung inkubiert wird, und/oder eine verlängerte Lag-Phase aufweisen.
Das Kontaktieren von wässriger und organischer Lösung findet unter geeigneten Bedingungen und insbesondere über einen Zeitraum statt, der für einen ausreichenden Übertritt der organischen Verbindung aus der wässrigen Phase in die organische Phase ausreicht, idealerweise sogar für die Einstellung des entsprechenden Gleichgewichts. Diese Zeitdauer und Bedingungen kann der Fachmann im Rahmen routinemäßigen Experimentierens bestimmen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der eine oder mehrere positive Ladungen aufweisenden organischen Verbindung um eine endständig aminierte Fettsäure, besonders bevorzugt 12-Aminolaurinsäure oder einen Ester davon oder einen Gemisch beider Verbindungen. Der Fachmann wird anerkennen, dass ein Ester einer Fettsäure in Anwesenheit eines biologischen Systems umfassend Esteraseaktivitäten teilweise in Form der entsprechenden Säure vorliegen kann und beide Verbindungen in diesem Zusammenhang insofern als äquivalent zu betrachten sind. Dementsprechend umfassen Fettsäuren oder Fettsäurederivate in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, wie hierin verwendet, auch die entsprechenden Ester, bevorzugt Methylester, und umgekehrt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Begriff„Alkylengruppe", wie hierin verwendet, um eine Gruppe der Formel - (CH2)n -, d.h. um ein Alkan mit zwei offen gelassenen, bevorzugt endständigen Substituenten. Bei den zwei Substituenten kann es sich z.B. um eine Aminogruppe und eine Carboxygruppe handeln. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt n wenigstens 3, noch bevorzugter wenigstens 6, noch bevorzugter 11. Bei einer „substituierten Alkylenkette" ist wenigstens ein Wasserstoffatom durch einen anderen Substituenten als ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest, bevorzugt ein anderes Atom als ein Wasserstoffatom, ersetzt. In einer besonderen Ausführungsform bedeutet der Begriff „unsubstituierte Alkylengruppe", wie hierein verwendet, hingegen eine Kohlenwasserstoffkette der Formel - (CH2)n - ohne einen derartigen Substituenten
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Verbindung handelt es sich bei der organischen Verbindung mit einer oder mehreren positiven Ladungen um einen ringförmigen Zucker. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform weist dieser ringförmige Zucker wenigstens zwei Aminogruppen auf. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem „ringförmigen Zucker" um einen Zucker ausgewählt aus den Diamino-dianhydro-dideoxy-hexitolen, besonders 2,5-Diamino-l,4:3,6-Dianhydro-2,5-Dideoxy-D-Hexitol, in einer bevorzugtesten Ausführungsform deren drei Stereoisomere, 2,5-Diamino-l,4:3,6-Dianhydro-2,5- Dideoxy-D-Mannitol (I), 2,5-Diamino-l,4:3,6-Dianhydro-2,5-Dideoxy-D-Glucitol (II) und 2,5-Diamino-5 1,4:3, 6-Dianhydro- 2,5-Dideoxy-L-Iditol (III), die sich in der Chiralität an der Position 2 und 5 unterscheiden. Die Aminogruppen können hier in der endo, endo (I), endo, exo (II) oder exo, exo (III) Position stehen, bezogen 10 auf die Sesselform der annelierten fünfgliedrigen Ringe. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Verbindung findet in Kombination mit einem ringförmigen Zucker als zu entfernender organischer Verbindung eine Verbindung als Lösungsmittel Verwendung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die Kerosin (K), Benzylbenzoat (B), Laurinsäuremethylester (ML), cis-9-Octadecen-l-ol (OD) umfasst. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der organischen Verbindung um DAI (Diaminoisoidit) oder DAS (Diaminoisosorbit), bei dem flüssigen Kationenaustauscher um eine ungesättigte Fettsäure, bevorzugte Ölsäure, und die wässrige Phase weist einen pH-Wert von wenigstens 6,5 oder 7, bevorzugt 7 bis 10, noch bevorzugter 7,5 bis 9,5 auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der organischen Verbindung um DAI oder DAS, bei dem flüssigen Kationenaustauscher um DEHPA, und die wässrige Phase weist einen pH-Wert von wenigstens 3 oder wenigstens 3,5, bevorzugt 3 bis 8, bevorzugt 4 bis 10, noch bevorzugter 4,5 bis 9, noch bevorzugter 4,5 bis 7 oder 5 bis 8 auf. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das durch das Kontaktieren wässriger und hydrophober Phase entstehende Gemisch zum Zwecke der besseren Phasenabtrennung als Teil von Schritt c) oder in einem zusätzlichen Schritt einer erhöhten Temperatur ausgesetzt, um die Phasentrennung zu fördern. Beispielsweise kann Temperatur bei Standarddruck auf über 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 oder 95 °C erhöht werden.
Die Temperatur bei Schritt b) hängt nicht nur von den Eigenschaften des flüssigen Kationenaustauschers ab, sondern, insbesondere für den Fall, dass das Kontaktieren der wässrigen und der organischen Lösung bei ablaufender Reaktion in der wässrigen Phase stattfindet, auch von den Temperaturerfordernissen etwaiger, in der wässrigen Phase stattfindenden Reaktionen. Insbesondere für den Fall, dass ein biologisches Agens wie eine lebende Zelle in der wässrigen Phase katalytisch aktiv ist, muss die Temperatur für die Erhaltung dieser Aktivität geeignet sein. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Temperatur bei Schritt b) 0 bis 100 °C, bevorzugter 20 bis 80 °C, 28 bis 70 °C, 30 bis 37 °C, 35 bis 40 °C.
Auch der pH-Wert bei Schritt b) muss den Erfordernissen etwaiger gleichzeitig ablaufender Reaktionen, der Stabilität von Edukten, Produkten, Zwischenprodukten oder Agenzien Rechnung tragen. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der pH-Wert 3 bis 8, bevorzugter 6 bis 8, noch bevorzugter 6,2 bis 7,2.
Um die organische Verbindung aus der wässrigen Phase möglichst vollständig in die organische zu überführen, ist eine ausreichende Menge des flüssigen Kationenaustauschers erforderlich. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt das Stoffmengenverhältnis von flüssigem Kationenaustauscher und organischer Verbindung bei wenigstens einem Schritt, bei einem kontinuierlichen Prozess über den gesamten Ablauf der Reaktion summiert, wenigstens 1, d.h. pro Molekül der organischen Verbindung wird wenigstens ein Molekül flüssiger Kationenaustauscher eingesetzt. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform ist das Verhältnis größer als 2, 3, 5, 10, 15, oder 20, bevorzugt 1,5 bis 3. In einer bevorzugten Ausführungsform bestimmt sich, ob es sich bei dem Kationenaustauscher um einen flüssigen Kationenaustauscher handelt, nach seinem Aggregatzustand bei der Verfahrenstemperatur, bevorzugt bei 37 °C. Wird der Kationenaustauscher in einer organischen Phase verwendet, die neben dem Kationenaustauscher weitere Verbindungen aufweist, so ist der Aggregatzustand der Mischung maßgeblich. Es genügt, wenn - optional unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Routineverfahren - eine Mischung hergestellt werden kann, die bei der Verfahrenstemperatur, bevorzugt bei 37 °C, insgesamt flüssig ist und den flüssigen Kationenaustauscher umfasst. Beispielsweise kann es notwendig sein, den Kationenaustauscher bei höherer Temperatur als der im Verfahren verwandten aufzulösen und die Mischung auf die Verfahrenstemperatur abzukühlen.
Das Volumenverhältnis der organischen Lösung zur wässrigen Lösung ist, zusammen mit dem Stoffmengenverhältnis Kationenaustauscher/organische Verbindung, für ein effizientes Verfahren bedeutend. In einer besonderen Ausführungsform beträgt es 100: 1 bis 1 : 100, bevorzugter 20: 1 bis 1 :20, noch bevorzugter 10: 1 bis 1 : 10, 4: 1 bis 1 :4, 3 : 1 bis 1 :3 oder am bevorzugtesten 1 :2 bis 2: 1.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Fettsäure als flüssiger Kationenaustauscher eingesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Fettsäure", wie hierin verwendet, eine Carbonsäure, bevorzugt Alkansäure, mit wenigstens 6, bevorzugt 8, noch bevorzugter 10, am bevorzugtesten 12 Kohlenstoffatomen verstanden. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um geradkettige Fettsäuren, in einer weiteren Ausführungsform um verzweigte. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um gesättigte Fettsäuren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ungesättigte. In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform handelt es sich um eine geradkettige Fettsäure mit wenigstens 12 Kohlenstoffatomen umfassend eine Doppelbindung, bevorzugt an Position 9. In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform handelt es sich um eine einfach ungesättigte Fettsäure, bei der sich die Doppelbindung an der Position 9 und/oder 1 1 befindet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem flüssigen Kationenaustauscher um eine ungesättigte Fettsäure ausgewählt aus der Gruppe umfassend Ölsäure, Palmitoleinsäure und Gadoleinsäure und Icosensäure. In der bevorzugtesten Ausführungsform handelt es sich um Ölsäure. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um eine Fettsäure mit 6, 7, 8 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 Kohlenstoffatomen, bevorzugt mehr als 12, noch bevorzugter mehr als 14 Kohlenstoffatomen, noch bevorzugter mit 14 bis 28, 14 bis 22, am bevorzugtesten 16 bis 18 Kohlenstoffatomen.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform wird als flüssiger Ionenaustauscher ein Gemisch verschiedener Fettsäuren eingesetzt, wie es beispielsweise in Form von Sojaöl oder Kugeldistelöl vorliegt. Die Fettsäuren müssen in diesem Fall unter Umständen noch durch Hydrolyse der entsprechenden Ester freigesetzt werden, was durch Senkung des pH-Wertes oder ähnliche, dem Fachmann als Routineverfahren bekannte Maßnahmen geschehen kann. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Kombination von zwei flüssigen Kationenaustauschern, bevorzugt wenigstens einer von ihnen eine Fettsäure, verwendet.
Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt in der Kompatibilität des erfindungsgemäßen Verfahrens mit biotechnologischen Verfahren und dabei verwendeten biologischen Agenzien. In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff„biologisches Agens mit katalytischer Aktivität", wie hierin verwendet, ein durch eine Zelle synthetisierter Biokatalysator in sämtlichen Aufreinigungsstufen, von der gesamten Zelle bis zum isolierten Molekül, verstanden. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um eine Zelle exprimierend Enzyme mit katalytischer Aktivität. Bei der Zelle kann es sich um einen Prokaryonten, einschließlich Archeen, oder um einen Eukaryonten handeln, bevorzugt aus der Gruppe umfassend Pseudomonas, Corynebacterium und E. coli. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Agens um eine bakterielle Zelle, noch bevorzugter um eine Gram-negative bakterielle Zelle, am bevorzugtesten um E. coli. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um eine eukaryontische Zelle, bevorzugter um eine Pilzzelle, noch bevorzugter um eine Hefezelle, am bevorzugtesten um Saccharomyces oder Candida, Pichia, insbesondere Candida tropicalis. Der Begriff„Zelle" wird, in einer besonderen Ausführungsform, in dieser Anmeldung gleichbedeutend und austauschbar mit dem Begriff„Mikroorganismus" verwendet. Weiterhin kann es sich bei der Zelle um eine isolierte Zelle oder eine Mischung von Kulturen handeln. Die als biologisches Agens verwendete Zelle kann lebensfähig sein, oder es kann sich um eine Präparation davon, beispielsweise um eine Membranfraktion oder cytosolische Fraktion oder ein Rohextrakt der Zelle, handeln.
Wenn es sich bei dem biologischen Agens um ein isoliertes Molekül in verschiedenen Reinigungsstufen handelt, so kann dies sämtliche katalytische aktive, von einer Zelle hergestellte Moleküle handeln. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein Molekül aus der Gruppe umfassend Peptide, Polypeptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren oder Mischformen davon. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform handelt es sich um ein katalytisch wirksames Polypeptid. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein immobilisiertes Molekül.
Die für synthetische biotechnologische Verfahren erforderlichen katalytischen Funktionen sind vielfältig. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich beim Begriff„katalytische Aktivität", wie hierein verwendet, um eine synthetische Aktivität, d.h. die Katalyse chemischer Reaktionen umfassend die Bildung wenigstens einer neuen kovalenten Bindung. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um eine Transportaktivität, d.h. die Fähigkeit eine Moleküle, den Transport eines anderen Moleküls von einem Kompartiment in ein anderes zu bewerkstelligen, z.B. die Aufnahme eines Stoffes aus dem wässrigen Medium über eine Zellmembran ins Innere der Zelle. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem biologischen Agens um eine lebende Zelle, die in Anwesenheit des flüssigen Kationenaustauschers zur Katalyse verwendet wird, bevorzugt, um eine organische Verbindung mit einer oder mehreren positiven Ladungen zu synthetisieren, die anschließend oder gleichzeitig mittels des flüssigen Kationenaustauschers in eine hydrophobe organische Phase entfernt wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wirkt sich die Anwesenheit der organischen Verbindung nachteilig auf die katalytische Aktivität aus. In einer Ausführungsform kann dies die Menge an vorhandener Aktivität, ausdrückbar im Sinne eines niedrigeren kca, eines Enzyms, verringert. In einer weiteren Ausführungsform kann die Affinität des die katalytische Aktivität aufweisenden Agens im Sinne eines erhöhten KM eines Enzyms betroffen sein. In einer weiteren Ausführungsform kann die Spezifität der katalytischen Aktivität verändert sein, beispielsweise in der Weise, dass es bevorzugt ein anderes als das erwünschte Substratmolekül umsetzt oder bevorzugt umsetzt. In einer weiteren Ausführungsform weist die organische Verbindung eine toxische Wirkung auf eine Zelle als biologisches Agens auf. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der organischen Verbindung um einer organische Verbindung, die die Verfügbarkeit eines essentiellen Co-Substrates oder Co-Enzymes verringert. Dies kann z.B. der Fall sein, wenn die organische Verbindung eine entsprechende Regenerationsreaktion inhibiert. Neben dem flüssigen Kationenaustauscher kann die hydrophobe organische Phase weiterhin ein hydrophobes Lösungsmittel enthalten. Dies kann dazu dienen, die Aufhahmekapazität eines flüssigen Kationenaustauschers in der hydrophoben Phase zu erhöhen und unerwünschtes Verhalten, beispielsweise Ausflocken, zu verhindern. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Lösungsmittel um ein Edukt einer in der wässrigen Lösung ablaufenden Reaktion, am stärksten bevorzugt das Substrat einer in der wässrigen Lösung ablaufenden enzymkatalysierten Reaktion. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um einen Fettsäureester. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Lösungsmittel um einen Fettsäureester, bevorzugt -methylester, einer Fettsäure, die als flüssiger Kationenaustauscher dient. Der Anteil des Lösungsmittels, sofern vorhanden, an der hydrophoben organischen Phase beträgt in einer bevorzugten Ausführungsform 1 bis 99 Volumenprozent (Vol.-%). In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Anteil des Lösungsmittels 10 bis 90, noch bevorzugter 20 bis 80, am bevorzugtesten 25 bis 75 Vol.-%.
In einer bevorzugtesten Ausführungsform des Verfahrens handelt es sich bei der organischen Verbindung um 12-Aminolaurinsäure und/oder 12-Aminolaurinsäuremethylester, das bzw. der in der wässrigen Phase von einem rekombinanten E. co/z-Stamm durch schrittweise Oxidation des endständigen Kohlenstoffatoms von Laurinsäuremethylester hergestellt wird, wie es in der DE 10200710060705 offenbart ist, und die hydrophobe Phase umfasst 25 bis 75 % Ölsäure als flüssigen Kationenaustauscher gelöst in Laurinsäuremethylester als Substrat der Reaktion.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der organischen Verbindung um eine Verbindung der Formel H2N - (CH2)X - NH2. Dabei kann x die Werte 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 annehmen, ist bevorzugt 1 bis 20, noch bevorzugter 1 bis 10.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Figuren und nicht beschränkenden Beispiele veranschaulicht, denen weitere Merkmale, Ausführungsformen, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung entnommen werden können.
Fig. 1 zeigt ein Kontrollexperiment zur Bestätigung, dass LSME nicht toxisch wirkt, untersucht mit einem E. coli W3110-Stamm und im Vergleich zu Kaliumphosphatpuffer (Kpi) als Negativkontrolle.
Fig. 2 zeigt die Lebensfähigkeit des Stammes E. coli W3110 in Form von der Zahl der cfus, die der Stamm in Abwesenheit eines flüssigen Kationenaustauschers und in Anwesenheit verschiedener flüssiger Kationenaustauscher nach 0 h, 4 h und 24 h ausbilden kann. Fig. 3a zeigt die Ergebnisse der Entfernung von Diaminoisoidit (DAI) und Diaminoisosorbit (DAS) aus einer wässrigen Phase unter Verwendung von D2EHPA als flüssigem Kationenaustauscher.
Fig. 3b zeigt die Ergebnisse der Entfernung von DAI und DAS aus einer wässrigen Phase unter Verwendung von Ölsäure als flüssigem Kationenaustauscher. Fig. 3c zeigt die Ergebnisse der Entfernung von DAI und DAS aus einer wässrigen Phase ohne Verwendung eines flüssigen Kationenaustauschers. Fig. 4 zeigt den Effekt der Verwendung eine flüssigen Kationenaustauschers auf die Toxizität anhand der Veränderung der Lebendzellzahl von einem E. coli-W3110-Stamm in Gegenwart von ALSME 0,2 %, mit Ammoniak eingestelltem DEHPA („D2EHPNH3 2%") bzw. einer DEHPA/LSME Mischung (2 %/98 %) („D/L") in Anwesenheit von ALSME 0,2%. Fig. 5 zeigt den Effekt verschiedener flüssiger Kationenaustauscher auf die OTR von Aminolaurinsäuremethylester produzierenden E. co/z-Stammes. Das Experiment wurde wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt.
Fig. 6 zeigt den Einfluss verschiedener flüssiger Kationenaustauscher auf die Ausbeute an Aminolaurinsäuremethylester, die ein E. coli -Stamm mit geeigneter genetischer Modifikation herstellt. Das Experiment wurde wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt.
Beispiel 1 : Untersuchung zur Toxizität des Lösungsmittels LSME, das in Zusammensetzungen mit flüssigen Kationenaustauschern verwendet wird.
Mit diesem Versuch wurde die relativ geringe Toxizität von LSME mit Hinblick auf biotechnologisch relevante Mikroorganismen gezeigt, die LSME zu einem geeigneten organischen Lösungsmittel für das erfindungsgemäße Verfahren macht.
Bevor die Bestimmung der CFU durchgeführt werden konnte, wurde eine Platte LB (10 g/L Pepton aus Casein, 5 g/L Hefeextrakt, 10 g/L NaCl) mit E. coli BW3110 ausgestrichen und für 24 h inkubiert. Am Abend des darauf folgenden Tages wurde eine Vorkultur von dieser zuvor ausgestrichenen Platte angeimpft. Diese Vorkultur hatte ein Volumen von 50 mL LB-Medium, und wurde über Nacht für ca. 16 h inkubiert. Am folgenden Tag wurde die Vorkultur mit einer OD60o von 0,2 in 200 mL M9-Medium (Na2HP04 6,79 g/L; KH2P04 3,0 g/L; NaCl 0,5 g/L; NH4C1 lg/L; 1 mL/L Spurenelementelösung, pH 7,4. Spurenelementlösung: HCl 37 % (=455,8 g/L) 36,50 g/L; MnC12*7H20 1,91 g/L; ZnS04*7H20 1,87 g/L; Na-EDTA*2H20 (Titriplex III) 0,84 g/L; H3B03 0,30 g/L; Na2Mo04*2H20 0,25 g/L; CaC12*2H20 4,70 g/L; FeS04*7H20 17,80 g/L; CuC12*2H20 0, 15 g/L) mit 3 % Glucose (w/v) überimpft und für ca. 20 h inkubiert. Nach der Inkubation der Hauptkultur wurden die Zellen geerntet, bei 5258 g und 4 °C für 10 min zentrifugiert und mit einer OD60o von 30 in 10 mL 50mM KprPuffer bei pH 7,4 (oder 25mM HEPES-Puffer pH 7,4, wenn CFU-Bestimmungen mit ALSME durchgeführt wurden) resuspendiert. Beide verwendeten Pufferlösungen enthielten 5 % Glucose (w/v). Anschließend wurde die Bakteriensuspension in die Schüttelkolben überführt und mit den jeweiligen Substanzlösungen versetzt. Nach erfolgter Durchmischung durch Schwenken des Kolbens wurden 100 der Suspension heraus pipettiert und in 900 vorgelegte sterile Saline gefüllt. Dies entsprach der Probenahme zum Zeitpunkt t0. Es folgte die Inkubation der Ansätze bei 250 Upm und 30 °C. Die CFUs wurden über einen Zeitraum von 22 h ermittelt. Die Probenahmen fanden zunächst zu den Zeitpunkten t0, Ϊ3, ΐβ und t22 statt. Bei manchen Ansätzen wurde ein weiterer Probenahmezeitpunkt ti>5 hinzugefügt und darüber hinaus eine weitere zusätzliche Verdünnungsreihe ausplattiert, um Abweichungen zu minimieren.
Die OD60o lag bei 60. Die Zellen wurden in 10 mL Kpi-Puffer resuspendiert und anschließend im Kolben mit 5 mL LSME 98 % (w/w) vermischt. Es wurde eine Verdünnungsstufe pro Ansatz ausplattiert.. Die Anzahl der CFU/mL blieb über den Zeitraum von 6 h konstant. Nach 22 h war ein prozentueller Rückgang der Lebendzellzahl von lediglich 30,3 % zu verzeichnen. Beispiel 2: Vergleichsversuche zur Toxizität verschiedener flüssiger Kationenaustauscher gegenüber biotechnologisch relevanten Mikroorganismen
Dieses Beispiel zeigt die niedrigere Toxizität von unverzweigten Fettsäuren gegenüber anderen flüssigen Kationenaustauschern wie DEHPA sowie verzweigten und unverzweigten gesättigten Fettsäuren.
Zunächst wurde eine Vorkultur umfassend 20 ml LB-Medium in einem 100 ml-Schikanekolben mit einer Kryokultur des entsprechenden Stammes angeimpft. Die Kultur wurde über Nacht bei 37°C und Schütteln bei 200 Upm kultiviert und am nächsten Tag verwendet, um eine gleiche Hauptkultur auf eine OD von 0,2 anzuimpfen. Die Hauptkulturen (je 30mL LB-Medium) wurde anschließend unter den gleichen Bedingungen weiter inkubiert. Bei einer OD von 0,4 bis 0,5 wurde die Hauptkultur mit jeweils gleichen Volumina (30 ml) Lösungsmittel überschichtet und anschließend weiter inkubiert.
Für die Bestimmung der Zahl der cfu (colony-forming units oder koloniebildende Einheiten) wurden bei den folgenden Versuchen 0, 1 ml-Proben entnommen und in steriler 0,9 % NaCl-Lösung verdünnt. Geeignete Verdünnungsstufen wurden auf LB-Agarplatten ausplattiert. Nach Inkubation bei 34 °C über Nacht wurden die gebildeten Kolonien ausgezählt und die cfus bestimmt.
Versuch 1 : Vergleich der Toxizität zwischen DE2HPA und einer gesättigten Fettsäure als flüssiger Kationenaustauscher
Es wurden 50 % DEHPA bzw. Laurinsäure (15%), jeweils in LSME gelöst und äquimolar bzw. 25 mol% mit ALSME beladen, als flüssige Kationenaustauscher mit einem E. coli BL21 (DE3)-Stamm kontaktiert und der Einfluss dieser beiden Verbindungen auf die Fähigkeit des Stammes untersucht, Kolonien zu bilden, ausgedrückt in cfus. In Vorversuchen konnte gezeigt werden, dass Laurinsäuremethylester - der aufgrund fehlender Ladung nicht als flüssiger Kationenaustauscher fungieren kann - von den verwendeten Stämmen gut vertragen wird. Tabelle 1:
Figure imgf000025_0001
Es zeigt sich, dass beide flüssige Kationenaustauscher die Zahl der cfus deutlich senken, bei Verwendung von Laurinsäure im Gegensatz zu DEHPA aber noch einige lebensfähige Zellen vorhanden sind und die gesättigte Fettsäure als flüssiger Kationenaustauscher daher vorzuziehen ist.
Versuch 2: Vergleich der Toxizität zwischen verzweigten gesättigten Fettsäuren und verschiedenen Mengen Ölsäure als flüssiger Kationenaustauscher
Hierbei wurden zwei verschiedene Konzentrationen an Ölsäure eingesetzt und das Volumen durch Zugabe der entsprechenden Menge LSME (Laurinsäuremethylester) angepasst.
Tabelle 2:
Versuch Verwendeter E. coli- Verwendeter flüssiger Zahl der cfus nach Nr. Stamm Kationenaustauscher 22 bzw. 24 h relativ zu t = 0 h
2a E. coli BL21(DE3) Isononansäure 0
2b E. coli BL21(DE3) 2-Ethylhexansäure 0
2c E. coli BL21(DE3) LSME/25% Ölsäure 11 %
2d E. coli BL21(DE3) LSME/75% Ölsäure 18 %
2e E. coli W3110 Isononansäure 0
2f E. coli W3110 2-Ethylhexansäure 0
2g E. coli W3110 LSME/25% Ölsäure 29 %
2h E. coli W3110 LSME/75% Ölsäure 17 % Es zeigt sich, dass die Zahl der lebensfähigen Zellen bei der Verwendung der ungesättigten Fettsäure Ölsäure zusammen mit LSME konsistent deutlich höher liegt als bei der Verwendung von verzweigten gesättigten Fettsäuren. Versuch 3 : Vergleich der Toxizität zwischen unverzweigten gesättigten Fettsäuren und ungesättigten Fettsäuren als flüssiger Kationenaustauscher
Hier wurden verschiedene Mengen einer ungesättigten Fettsäure mit einer ungesättigten Fettsäure verglichen hinsichtlich ihrer Toxizität bei der Verwendung als flüssiger Kationenaustauscher verglichen. Aufgrund der geringeren Löslichkeit der ungesättigten Fettsäure Laurinsäure wurde diese in geringerer Menge eingesetzt. Die Volumina der verschiedenen Kationenaustauscher wurden mit LSME angeglichen. Die Zahl der cfus wurde zu Beginn, nach 4,5 h und nach 24 h bestimmt.
Wie aus Fig. 2 zu entnehmen ist, bewirkt die Zugabe der gesättigten Fettsäure als flüssigen Kationenaustauscher selbst in geringerer Konzentration als der der ungesättigten Fettsäure eine Abnahme der cfus, wohingegen im Falle der ungesättigten Fettsäure eine Zunahme der cfus festzustellen ist.
Es zeigt sich insgesamt eine Abnahme der Toxizität bei den verschiedenen untersuchten flüssigen Kationenaustauschern in folgender Reihenfolge: DEHPA > gesättigte Fettsäuren > ungesättigten Fettsäuren.
Beispiel 3: Entfernung von Diaminoisoidit (DAI) und Diaminoisosorbit (DAS) unter Verwendung verschiedener flüssiger Kationenaustauscher aus einer wässrigen Phase
Dieses Beispiel zeigt, dass ein flüssiger Ionenaustauscher, hier D2EHPA oder Ölsäure, als Bestandteile einer organischen hydrophoben Phase die Aufnahmefähigkeit der hydrophoben Phase für eine positiv geladene Verbindung erhöht.
Als organische Lösungsmittel fanden hierbei Kerosin (K), Benzylbenzoat (B), Laurinsäuremethylester (ML), cis-9-Octadecen-l-ol (OD) Verwendung. Als flüssige Kationenaustauscher wurden Ölsäure und D2EHPA in ihrer Wirkung mit dem jeweiligen reinen Lösungsmittel verglichen.
Die experimentelle Vorgehensweise lief in allen Fällen identisch ab: Die wässrige Phase enthielt 2 Gewichts-% Diamin und die organische Phase bestand aus dem entsprechenden Lösungsmittel und 20 Gew.-% des jeweiligen flüssigen Kationenaustauschers. Das Volumenverhältnis der beiden Phasen war 1 : 1 (jeweils 4,5 ml). Bei einer konstanten Temperatur von T=30°C wurden die Proben 2 Stunden im Wasserbad geschüttelt. Anschließend erfolgte nach Zentrif gation und Phasentrennung die Analytik der Phasen. Die Einstellung des pH-Wertes erfolgte in allen Fällen mit wässrigem Ammoniak bzw. Schwefelsäure.
Fig. 3a zeigt die Ergebnisse der Reaktivextraktion mit D2EHPA als flüssigem Kationenaustauscher. Ohne Zugabe von Säure oder Lauge liegt der Extraktionsgrad bei einem pH-Bereich von 5,4 bis 6,2 bei ca. 100%. Die Zugabe von Säure führt zu einer deutlichen Abnahme des Extraktionsgrades. Bei der Zugabe von wenig Lauge ist bei den Versuchen mit Benzylbenzoat kein Einfluss auf den Extraktionsgrad erkennbar. Wurde viel Lauge hinzugegeben, Anfangs-pH-Wert von 11 bis 12, waren die Versuche nicht auswertbar. Bei der Verwendung von DAS mit cis-9-Octadecen-l-ol als Lösungsmittel ist eine Absenkung des Extraktionsgrades mit ansteigendem pH-Wert zu beobachten, jedoch waren die Proben milchig/trüb, bei der Extraktion von DAI ist bei der Zugabe von wenig Lauge kein eindeutiger Einfluss auf den Extraktionsgrad erkennbar, bei einem Anfangs-pH-Wert von 11 bis 12 sinkt der Extraktionsgrad deutlich ab, wobei beide Phasen trotz mehrmaligem Zentrif gieren milchig/trüb blieben, auf der Phasengrenze war eine ca. 1,5 cm dicke weiße Schicht zu sehen. Wurde Laurinsäuremethylester als Lösungsmittel eingesetzt, führte die Zugabe von wenig Lauge, Anfangs-pH-Wert 10 bis 11, zu einem leichten Absinken des pH-Wertes, wobei die Phase milchig/trüb war. Die Zugabe von viel Lauge führte zur Bildung einer einzigen klaren Phase.
Die Ergebnisse der Verwendung von Ölsäure als flüssigen Kationenaustauscher sind in Fig. 3b dargestellt. Im Rahmen der Versuche wurde kein Extraktionsgrad von 100% erreicht. Die Versuche mit Laurinsäuremethylester als Lösungsmittel waren nur auswertbar, wenn bei der Vorbereitung Schwefelsäure zum Absenken des pH-Wertes eingesetzt wurde. Der maximal erreichte Extraktionsgrad betrug 4% bei der Extraktion von DAS und 48% bei der von DAI. Die Versuche zur Extraktion von DAS mit cis-9-Octadecen-l-ol als Lösungsmittel waren ebenfalls nur auswertbar, wenn der Anfangs-pH-Wert mit H2S04 abgesenkt wurde. Ein maximaler Extraktionsgrad von 5,5% bei pH-Wert 6 wurde erreicht. Bei der Extraktion von DAI wurde ein maximaler Extraktionsgrad von 85% bei pH 7,9 erreicht, wenn weder Lauge noch Säure hinzugegeben wurde. Die Zugabe von Lauge führte zu einem deutlichen Absenken des Extraktionsgrades. Bei dem Einsatz von Kerosin als Lösungsmittel zur Extraktion von DAS wird bei einem pH-Wert von 8,5 ein maximaler Extraktionsgrad von 85% und bei der Extraktion von DAI ein maximaler Extraktionsgrad von 77,5% bei pH 8,4. Die Zugabe von Lauge führt zu einem sehr leichten Absinken des Extraktionsgrades. Die Versuche mit Benzylbenzoat waren nur in den Fällen auswertbar, in denen der pH-Wert der wässrigen Phase vor Versuchsbeginn mit Schwefelsäure abgesenkt worden war. Der maximale Extraktionsgrad bei der Extraktion von DAS ist 61,5% bei pH 7,3, jener von DAI 15,3 bei pH 1, 1. Ab pH 6 führt eine weitere Absenkung zu einem Anstieg des Extraktionsgrades. Die wässrige Phase blieb auch nach 45 minütigem Zentrifugieren trüb. Die bei den entsprechenden Vergleichsversuchen mit den gleichen Lösungsmitteln, aber ohne flüssigen Kationenaustauscher erhaltenen Extraktionsgrade, aufgetragen über den pH-Wert, sind in Fig. 3c dargestellt. Es ist keine eindeutige Abhängigkeit des Extraktionsgrades von dem pH- Wert erkennbar. In jedem Fall liegen die Extraktionsgrade deutlich unterhalb 20%.
Beispiel 4: Senkung der Toxizität einer organischen Verbindung mit positiver Ladung durch Kontaktieren mit einem flüssigen Kationenaustauscher
Dieser Versuch zeigt, dass durch die Anwesenheit eines flüssigen Kationenaustauschers die toxische Wirkung einer positiv geladenen organischen Verbindung in einer wässrigen Phase, bei der es sich um Fermentationsbrühe handelt, gesenkt werden kann, indem diese Verbindung in die organische Phase extrahiert wird.
Das grundsätzliche experimentelle Vorgehen entsprach dem in Beispiel 1.
Da ALSME 0,2 % (w/v), in wässrigen Systemen gelöst, bakterizid wirkte, wurde dieser Versuch in Kombination mit D2EHPNH3/LSME 2/98 % (w/w) erneut im Schüttelkolben durchgeführt, dabei bedeutet D2EHPNH3 quantitativ mit Ammonium beladenes D2EHPA. . Durch den Einsatz des flüssigen Ionenaustauschers wird der Übergang von ALSME in die organische Phase verbessert, wodurch sich dessen Konzentration in der wässrigen Phase, in der sich auch die Zellen befinden, verringert. Um eine toxische Wirkung bedingt durch D2EHPA zu verringern, wurden niedrige Konzentrationen von 2 % (w/w) D2EHPNH3 verwendet.
Die Bakterien wurden zunächst in 5 mL, (entspricht der Hälfte des Puffervolumens) resuspendiert. Weitere 5 mL Puffer wurden ggf. mit 0,4 % (w/v) ALSME versetzt und anschließend ggf. mit 5 mL D2EHPNH3/LSME 2/98 % (w/w) 1 min bei 3000 Upm| gevortext. Diese Lösung wurde zu der im Schüttelkolben vorgelegten Bakteriensuspension hinzu gegeben und vermischt. Danach erfolgte die erste Probenahme. Die Lösung hatte eine schaumige Konsistenz zu Beginn der Versuche, die jedoch bei der 2. Probenahme in beiden Versuchen verschwunden war. Die Abkürzung "D/L" wurde für D2EHPNH3 (mit Ammoniak beladenes D2EHPA)/LSME 2/98 % (w/w) verwendet. Zwischen den Probenahmen t0 und ti>5 h erhöhte sich die Anzahl der CFU/mL um 34,3 %. Von der Probenahme (ti>5) bis zur letzten Probenahme (t22) verringerte sich die Anzahl der CFU/mL um 54,9 %. Im Vergleich zum Ansatz mit D2EHPNH3/LSME 2/98 % (w/w) ohne Zusatz von ALSME 0,2 % (w/v), war die Anzahl der vermehrungsfähigen Zellen nach 22 h 4,5 mal höher und mit 3,4 % nicht signifikant niedriger als der Mittelwert der Kontrollansätze in HEPES-Puffer (siehe Fig. 4). Im Vergleich zu dem Ansatz mit ALSME 0,2 % (w/v) im Schüttelkolben, ohne Hinzugabe einer organischen Phase, war die Anzahl der CFU/mL 2800-mal höher.
Es zeigt sich, dass die Anwesenheit des flüssigen Kationenaustauschers die Toxizität der positiv geladenen Verbindung, hier festgestellt durch die Zahl der verbliebenen cftis, verringert.
Beispiel 5: Vergleichsversuche zur Toxizität verschiedener flüssiger Kationenaustauscher gegenüber einem ω-Aminolaurinsäure (ALS) und dem Methylester (ALSME) produzierenden Mikroorganismus Die Biotransformation von Laurinsäuremethylester zu Aminolaurinsäuremethylester wurde im 8-fach Paralellfermentationssystem von DasGip mit verschiedenen Ionentauschern getestet.
Für die Fermentation wurden lL-Reaktoren verwendet. Die pH-Sonden wurden mittels einer Zwei-Punkt- Kalibration mit Maßlösungen von pH 4,0 und pH 7,0 kalibriert. Die Reaktoren wurden mit 300 mL Wasser befüllt und 20 min bei 121°C autoklaviert, um Sterilität zu gewährleisten. Anschließend wurden die p02-Sonden über Nacht (mindestens 6 h lang) polarisiert. Am nächsten Morgen wurde das Wasser unter der Clean Bench entnommen und durch Hochzelldichtemedium mit 50 mg/L Kanamycin und 34 mg/L Chloramphenicol ersetzt. Im Folgenden wurden die p02-Sonden mit einer Einpunkt-Kalibration (Rührer: 600 rpm / Begasung: 10 sL/h Luft) kalibriert und die Feed-, Korrekturmittel- und Induktionsmittelstrecken mittels Clean-in-Place gereinigt. Dazu wurden die Schläuche mit 70% Ethanol, anschließend mit 1 M NaOH, dann mit sterilem VE-Wasser gespült und zuletzt mit den jeweiligen Medien befüllt. Der ALS und ALSME produzierende E. co/z-Stamm BL21 (DE3) Tlr pBTIO pACYC:Duet[TAcv] wurde zuerst aus Cryokultur in LB-Medium (25 mL in einem 100 mL Schikanekolben) mit 50 mg/L Kanamycin und 34 mg/L Chloramphenicol über Nacht bei 37°C und 200 rpm ca. 18 h lang angezogen. Anschließend wurden je 2 mL in Hochzelldichtemedium (Glucose 15 g/L (30 mL / L einer separat autoklavierten 500 g/L Stammlösung mit 1% MgS04*7H20 und 2,2% NH4C1), (NH4)2S04 1,76 g/L, K2HP04 19,08 g/L, KH2P0 12,5 g/L, Hefeextrakt 6,66 g/L, Trinatriumcitrat-Dihydrat 11,2 g, Ammoniumeisencitrat-Lösung 17 mL/L einer separat autoklavierten 1% igen Stammlösung, Spurenelementlösung 5 mL/L separat autoklavierten Stammlösung (HCl (37 %) 36,50 g/L, MnCl2*4H20 1,91 g/L, ZnS04*7H20 1,87 g/L, Ethylendiamintetraessigsäure-Dihydrat 0,84 g/L, H3B03 0,30 g/L. Na2Mo04*2H20 0,25 g/L, CaCl2*2H20 4,70 g/L, FeS04*7H20 17,80 g/L, CuCl2*2H20 0, 15 g/L)) (3 mal je 25mL in einem 100 mL Schikanekolben) mit 50 mg/L Kanamycin und 34 mg/L Chloramphenicol überimpft und bei 37°C / 200 rpm weitere 6 h lang inkubiert.
Die 3 Kulturen wurden in einem Schüttelkolben vereinigt und die optische Dichte mit 7,2 bestimmt. Um die Reaktoren mit einer optischen Dichte von 0, 1 anzuimpfen wurden je 4,2 mL in einer 5 mL Spritze aufgezogen und die Reaktoren mittels Kanüle über ein Septum beimpft.
Folgendes Standardprogramm wurde verwendet:
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000030_0002
Script
Trigger scharf 31% DO (l/60h)
Induktion 2 h nach
IPTG Feedtstart
Feedtrigger 50% DO I Feedrate | 3 [mL/h] |
Das durchgeführte Experiment lässt sich in zwei Phasen gliedern, die Anzucht, bei der die Zellen eine bestimmte optische Dichte erreichen sollten, und die nachfolgende Biotransformation, bei der die Expression der für das biotechnologische Verfahren zur Herstellung von ALSME erforderlichen Gene induziert wurde. Der pH Werte wurde einseitig mit Ammoniak (12,5 %) auf pH 6,8 geregelt. Während Anzucht und Biotransformation wurde der gelöste Sauerstoff (DO, dissolved oxygen) in der Kultur über Rührerdrehzahl und Begasungsrate bei 30% geregelt. Die Fermentation wurde als Feedbatch durchgeführt, wobei der Feedstart, 5 g/Lh Glucosefeed (500 g/L Glucose mit 1% MgS04*7H20 und 2,2% NH4C1), über einen DO-Peak getriggert wurde. Mit Feedstart wurde auch die Temperatur von 37°C auf 30°C gesenkt. Die Expression der Transaminase wurde 2 h nach Feedstart durch die automatische Zugabe von IPTG (1 mM) induziert. Die Induktion der alk-Gene erfolgte durch die manuelle Zugabe von DCPK (0,025 % v/v) 10 h nach Feedstart. Vor Start der Biotrasformation wurde die optische Dichte der Kulturbrühen bestimmt. Der Start der Biotransformationsphase erfolgte 14 h nach Feedstart. Dazu wurden 150 mL eines Gemischs aus Laurinsäuremethylesther und dem jeweiligen Ionentauscher (10% w/w) als Batch zu der Fermentationsbrühe zugegeben. Als Ionenaustauscher wurden Di-(2-ethylhexyl-)phosphorsäure (DEHPA), Laurinsäure, Ölsäure, Palmitinsäure, Palmitoleinsäure, Stearinsäure und ein Gemisch aus freien Fettsäuren aus der Verseifung von Kugeldistelöl eingesetzt. Um einen Aminogruppendonor für die Transaminase zur Verfügung zu stellen wurden zeitgleich mit der Zugabe der organischen Phase 10,7 mL einer Alaninlösung (125 g/L) zu der Fermentationsbrühe zugegeben. Zur Probennahme wurden 2 mL Fermentationsbrühe aus dem Kessel entnommen und ein Teil davon 1/20 in einem Aceton-HCl-Gemisch (c(HCl) = 0, 1 mol/L) verdünnt und extrahiert. Proben wurden bei 1,25 h, 3 h, 5 h, 20 h, 22 h und 25 h nach Start der Biotransformation von allen 8 Reaktoren genommen. Die Umsatzraten für Sauerstoff (OTR = oxygen transfer rate) und Kohlenstoff (CTR = carbon transfer rate) wurden währen der Fermentation über die Abgasanalytik an den DasGip-Systemen bestimmt. Die Fermentation wurde 22 h nach Start der Biotransformation beendet.
Die Quantifizierung von ALS, ALSME, DDS, DDSME, LS, LSME, HLS, HLSME, OLS und OLSME in Fermentationsproben erfolgte mittels LC-ESI/MS2 anhand einer externen Kalibrierung für alle Analyten und unter Verwendung des internen Standards Aminoundekansäure (AUD). Dabei kamen folgende Geräte zum Einsatz:
• HPLC Anlage 1260 (Agilent; Böblingen) mit Autosampier (G1367E), binärer Pumpe (G1312B) und Säulenofen (G1316A)
• Massenspektrometer TripelQuad 6410 (Agilent; Böblingen) mit ESI-Quelle
• HPLC-Säule: Kinetex C18, 100 x 2, 1 mm, Partikelgröße: 2,6 μιη, Porengröße 100 Ä (Phenomenex; Aschaffenburg)
• Vorsäule: KrudKatcher Ultra HPLC In-Line Filter; 0,5 μιη Filtertiefe und 0,004 mm Innendurchmesser (Phenomenex; Aschaffenburg)
Die Proben wurden vorbereitet, indem 1900 Lösungsmittel (Aceton/ 0, 1 N HCl-Gemisch = 1 : 1) und 100 μί^ Probe in ein 2-mL-Reaktionsgefäß pipettiert wurden. Das Gemisch wurde ca. 10 Sekunden gevortext und anschließend bei ca. 13000 rpm für 5 min zentrifügiert. Der klare Überstand wurde mit einer Pipette entnommen und nach entsprechender Verdünnung mit Diluent (80% (v/v) ACN, 20% bidest. H20 (v/v), + 0.1% Ameisensäure) analysiert. Zu je 900 μί^ Probe wurden 100 μί^ ISTD hinzupipettiert (10 μΐ^ bei einem Probenvolumen von 90 μί).
Die HPLC-Trennung erfolgte mit oben genannter Säule bzw. Vorsäule. Das Injektionsvolumen betrug 0,7 μί^, die Säulentemperatur 50°C, die Flussrate 0,6 mL/min. Die mobile Phase bestand aus Eluent A (0,l%ige (v/v) wässrige Ameisensäure) und Eluent B (Acetonitril mit 0, 1% (v/v) Ameisensäure). Folgendes Gradientenprofil wurde genutzt
Zeit [min] Eluent A [%] Eluent B [%]
0 77 23
0.3 77 23
0.4 40 60
2.5 40 60
2.6 2 98
5.5 2 98
5.6 77 23
9 77 23 Die ESI-MS2-Analyse erfolgte im positiven Modus mit folgenden Parametern der ESI-Quelle:
• Gastemperatur 280°C
• Gasfluss 1 1 L/min
· Nebulizerdruck 50 psi
• Kapillarspannung 4000 V
Die Detektion und Quantifizierung der einzelnen Verbindungen erfolgte mit den folgenden Parametern, wobei jeweils ein Produkt-Ion als Qualifier und eines als Quantifier genutzt wurde:
Analyt Vorläufer-Ion Produkt-Ion Verweilzeit Kollisionsenergie [eV]
[m/z] [m/z] [ms]
DDSME 245,2 167, 1 25 6
DDSME 245,2 149, 1 50 8
HLSME 231,3 181,2 15 2
HLSME 231,3 163,2 25 5
DDS 231,2 213,2 50 0
DDS 231,2 149, 1 25 9
ALSME 230,3 198, 1 25 10
ALSME 230,3 163,2 15 10
OLSME 229,2 197,2 50 0
OLSME 229,2 161, 1 25 5
HLS 217,2 181,2 35 0
HLS 217,2 163, 1 20 4
OLS 215,2 161,2 25 0
OLS 215,2 95,2 60 13
Ergebnisse: Wird DEHPA wie im Stand der Technik beschrieben als Kationenaustauscher eingesetzt, so kommt es unmittelbar nach Zusatz der Verbindung zur Kultur zu einem Einbruch der OTR. Die Kurve sinkt innerhalb kurzer Zeit auf 0, was anzeigt, dass in der Kultur keine stoffwechselaktiven Zellen mehr vorhanden sind. DEHPA wirkt also hochgradig toxisch auf Zellen. Wird statt DEHPA Laurinsäure als flüssiger Kationenaustauscher eingesetzt, so kommt es zwar ebenfalls zu einem Einbruch der OTR, dieser ist jedoch nicht so stark, und im Verlauf der nächsten 22 h erholen sich die Zellen und zeigen eine steigende Stoffwechselaktivität. Laurinsäure ist demnach merklich weniger toxisch als DEHPA. Noch deutlich bessere Ergebnisse können bei Verwendung gesättigter Fettsäuren mit längeren Kohlenstoffketten beobachtet werden. Werden Palmitin- und Stearinsäure eingesetzt, so fallt die OTR- Kurve deutlich seichter als im Falle der Verwendung von Laurinsäure oder gar DEHPA. Daraus kann geschlossen werden, dass diese Fettsäuren deutlich weniger toxisch wirken.
Die Verwendung von ungesättigten Fettsäuren wie Palmitoleinsäure, verseiftem Kugeldistelöl (enthält überwiegend Linolsäure) und Ölsäure führt überraschend zu noch deutlich besseren Ergebnissen. Diese Fettsäuren zeigen überraschend eine noch geringere Toxizität als die gesättigten Fettsäuren.
Literatur stellen:
J. Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997
Asano, Y., Fukuta, y., Yoshida, Y., and Komeda, H. (2008): The Screening, Characterisation, and Use of w-Laurolactam Hydrolase: A New Enzymatic Synthesis of 12-Aminolauric Acid, Biosc. Biotechn. Biochem., 72 (8), 2141-2150
DE10200710060705 (2007): ω-Aminocarbonsäuren oder ihre Lactame, herstellende, rekombinante Zellen

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Entfernen einer eine oder mehrere positive Ladungen aufweisenden organischen Verbindung aus einer wässrigen Lösung, umfassend die Schritte a) Bereitstellen der die organische Verbindung enthaltenden wässrigen Lösung und einer hydrophoben organischen Lösung, die einen flüssigen Kationenaustauscher umfasst, wobei der flüssige Kationenaustauscher hydrophob ist, b) Kontaktieren der wässrigen Lösung und der organischen Lösung, und c) Abtrennen der organischen Lösung von der wässrigen Lösung, wobei es sich bei dem flüssigen Kationenaustauscher um eine Fettsäure handelt, und wobei die organische Verbindung wenigstens zwei Aminogruppen und keine negativ geladene funktionelle Gruppe aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Temperatur bei Schritt b) 28 bis 70, bevorzugt 30 bis 37 °C beträgt.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei der pH-Wert bei Schritt b) 6 bis 8, bevorzugt 6,2 bis 7,2, beträgt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei der organischen Verbindung um eine Verbindung der Formel H2N - (CH2)X - NH2, handelt und x 1 bis 20, bevorzugt 6 bis 10 ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei dem organischen Diamin um einen ringförmigen Zucker mit wenigstens zwei Aminogruppen handelt, bevorzugt um Diaminoisoidit und Diaminoisosorbit.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Stoffmengenverhältnis von flüssigem Kationenaustauscher zu organischer Verbindung wenigstens 1 beträgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Volumenverhältnis von organischer Lösung zu wässriger Lösung 1 : 10 bis 10: 1 beträgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der flüssige Kationenaustauscher eine Fettsäure mit mehr als 12, bevorzugt mit 14 bis 22, noch bevorzugter 16 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der flüssige Kationenaustauscher eine ungesättigte Fettsäure, bevorzugt Ölsäure oder Erukasäure, ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bi 9, wobei die wässrige Lösung weiterhin ein biologisches Agens mit katalytischer Aktivität umfasst.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das biologische Agens eine Zelle, bevorzugt eine bakterielle Zelle ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 11, wobei es sich bei der organischen Verbindung um eine für die Zelle toxische organische Verbindung handelt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die organische Lösung darüber hinaus mindestens ein organisches Lösungsmittel enthält, bevorzugt eine Fettsäure und/oder einen Fettsäureester.
14. Reaktionsmischung umfassend eine wässrige Lösung und eine hydrophobe organische Lösung, wobei die hydrophobe organische Lösung eine Fettsäure, bevorzugter eine Fettsäure mit mehr als 12 oder 14 bis 22 oder 16 bis 18 Kohlenstoffatomen, noch bevorzugter eine ungesättigte Fettsäure als flüssigen Kationenaustauscher umfasst, und wobei die wässrige Lösung eine organische Verbindung umfasst, die wenigstens zwei Aminogruppen und keine negativ geladene funktionelle Gruppe aufweist.
15. Reaktionsmischung nach Anspruch 14, wobei die wässrige Lösung weiterhin eine intakte Zelle mit wenigstens einer katalytischen Aktivität, bevorzugt eine bakterielle Zelle, bevorzugter um E. coli umfasst.
16. Reaktionsmischung nach einem der Ansprüche 14 bis 15, wobei es sich bei der organischen Verbindung um eine Verbindung der Formel H2N - (CH2)x - NH2, handelt und x 1 bis 20, bevorzugt 6 bis 10 ist.
17. Reaktionsmischung nach einem der Ansprüche 14 bis 15, wobei es sich bei dem organischen Diamin um einen ringförmigen Zucker mit wenigstens zwei Aminogruppen handelt, bevorzugt um Diaminoisoidit und Diaminoisosorbit.
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WO (3) WO2012110125A1 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9315443B2 (en) 2011-02-16 2016-04-19 Evonik Degussa Gmbh Liquid cation exchanger
US9765370B2 (en) 2012-04-02 2017-09-19 Evonik Degussa Gmbh Method for aerobically producing alanine or a compound produced using alanine

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2604335T3 (es) 2011-07-20 2017-03-06 Evonik Degussa Gmbh Oxidación y aminación de alcoholes primarios
EP2602328A1 (de) 2011-12-05 2013-06-12 Evonik Industries AG Verfahren zur Oxidation von Alkanen unter Verwendung einer AlkB Alkan 1-Monooxygenase
EP2607479A1 (de) 2011-12-22 2013-06-26 Evonik Industries AG Biotechnologische Herstellung von Alkoholen und Derivaten davon
EP2607490A1 (de) 2011-12-22 2013-06-26 Evonik Industries AG Verfahren zur verbesserten Abtrennung einer hydrophoben organischen Lösung von einem wässrigen Kulturmedium
EP2631298A1 (de) 2012-02-22 2013-08-28 Evonik Industries AG Biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Butanol und Buttersäure
EP2639308A1 (de) 2012-03-12 2013-09-18 Evonik Industries AG Enzymatische omega-Oxidation und -Aminierung von Fettsäuren
EP2700448A1 (de) * 2012-08-21 2014-02-26 Evonik Industries AG Verzweigte Fettsäuren als flüssige Kationenaustauscher
EP2730655A1 (de) * 2012-11-12 2014-05-14 Evonik Industries AG Verfahren zur Umsetzung eines Carbonsäureesters unter Verwendung BioH-defizienter Zellen
EP2746397A1 (de) 2012-12-21 2014-06-25 Evonik Industries AG Herstellung von Omega-Aminofettsäuren
EP2746400A1 (de) 2012-12-21 2014-06-25 Evonik Industries AG Herstellung von Aminen und Diaminen aus einer Carbonsäure oder Dicarbonsäure oder eines Monoesters davon
EP2759598A1 (de) 2013-01-24 2014-07-30 Evonik Industries AG Verfahren zur Herstellung von alpha, omega-Alkandiol
FR3031738B1 (fr) * 2015-01-19 2018-10-05 Adionics Dispositif et methode de dessalement d'eau par deionisation thermique et liquide d'extraction ionique liquide applicable audit dispositif
EP3280697A1 (de) 2015-04-08 2018-02-14 INVISTA Textiles (U.K.) Limited Materialien und verfahren zur selektiven rückgewinnung monovalenter produkte aus wässrigen lösungen mit kontinuierlichem ionenaustausch
US10343084B2 (en) 2015-04-10 2019-07-09 Invista North America S.A.R.L. Process for separation of diamines and/or omega-aminoacids from a feed mixture
US10767237B2 (en) * 2016-07-06 2020-09-08 Virdia, Inc. Methods of refining a lignocellulosic hydrolysate
EP3477176A1 (de) 2017-10-25 2019-05-01 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur herstellung eines mit einem inliner ausgekleideten rohres

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998002411A1 (en) * 1996-07-15 1998-01-22 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem A process for the separation of amino acids and their salts from an aqueous solution
DE19919490A1 (de) * 1999-04-29 2000-11-23 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur Abtrennung organischer Substanzen aus einem wässrigen Gemisch
DE102007060705A1 (de) 2007-12-17 2009-06-18 Evonik Degussa Gmbh ω-Aminocarbonsäuren oder ihre Lactame, herstellende, rekombinante Zellen

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5455530A (en) * 1977-10-12 1979-05-02 Mitsui Petrochem Ind Ltd Preparation of dihydric phenols
US4661606A (en) 1984-06-06 1987-04-28 Henkel Corporation Extraction of amino acids from aqueous mixtures and quaternary ammonium salt intermediates produced therein
DE3602374A1 (de) * 1986-01-28 1987-07-30 Basf Ag Verfahren zur herstellung von 6-aminocapronsaeure
JPH0819230B2 (ja) * 1988-10-07 1996-02-28 宇部興産株式会社 ポリアミド複合材料の製造方法
US5248720A (en) 1988-09-06 1993-09-28 Ube Industries, Ltd. Process for preparing a polyamide composite material
RU2056941C1 (ru) * 1992-08-03 1996-03-27 Советско-австрийско-германское предприятие "БиоХимМак" Способ выделения лизина из культуральной жидкости
US5681728A (en) * 1995-06-07 1997-10-28 Chronopol, Inc. Method and apparatus for the recovery and purification of organic acids
DE10054347A1 (de) 2000-11-02 2002-05-08 Degussa Verfahren zur katalytischen Hydrierung organischer Verbindungen und Trägerkatalysatoren hierfür
DE10142621A1 (de) 2001-08-31 2003-03-20 Degussa Aufarbeitung der Ammoximationsprodukte von Ketonen durch Flüssig-Flüssig-Extraktion in einem ternären Lösemittelsystem
DE10142620A1 (de) 2001-08-31 2003-03-20 Degussa Ammoximation von Ketonen und Aufarbeitung durch Pervaporation/Dampfpermeation
CN100448818C (zh) * 2001-09-20 2009-01-07 江崎格力高株式会社 萃取方法和提纯有效物质的方法
DE10153546A1 (de) 2001-10-30 2003-05-22 Degussa Direktsynthese von Wasserstoffperoxid und deren Integration in Oxidationsprozesse
EP1350788A3 (de) 2002-03-28 2003-11-12 Degussa AG Verfahren zur Herstellung von Hexamethylendiamin aus Butadien
DE10220235A1 (de) * 2002-05-06 2003-12-04 Forschungszentrum Juelich Gmbh Integrierte Abtrennung organischer Substanzen aus einem wässrigen Bioprozessgemisch
ATE422962T1 (de) 2002-05-31 2009-03-15 Evonik Degussa Gmbh Geträgerter rutheniumkatalysator und verfahren zur hydrierung eines aromatischen amins in gegenwart dieses katalysators
DE10231119A1 (de) 2002-07-10 2004-02-05 Degussa Ag Verfahren zur Selektivitätserhöhung der Hydrierung von 4,4'-Diaminodiphenylmethan zu 4,4'-Diaminodicyclohexylmethan in Gegenwart eines N-Alkyl-4,4'-Diaminodiphenylmethans
WO2004015094A1 (en) * 2002-08-06 2004-02-19 Dsm Ip Assets B.V. Process for the preparation of l-3,4-dihydroxyphenylalanine by aerobic fermentation of a microorganism
DE10247495A1 (de) 2002-10-11 2004-04-22 Degussa Ag Verfahren zur Epoxidierung cyclischer Alkene
EP1424332A1 (de) 2002-11-26 2004-06-02 Degussa AG Verfahren zur Reinigung rohen Propenoxids
US6878836B2 (en) 2003-06-18 2005-04-12 Degussa Ag Process for the epoxidation of propene
JP5065003B2 (ja) * 2004-02-27 2012-10-31 ダウ グローバル テクノロジーズ エルエルシー 有機化合物を含有する水性流からの有機化合物の回収方法
US20050267529A1 (en) 2004-05-13 2005-12-01 Heber Crockett Devices, systems and methods for tissue repair
CN102974264B (zh) * 2005-04-13 2015-09-02 路博润高级材料公司 分散剂
DE102006025821A1 (de) 2006-06-02 2007-12-06 Degussa Gmbh Ein Enzym zur Herstellung von Mehylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd
DE102007021199B4 (de) 2006-07-17 2016-02-11 Evonik Degussa Gmbh Zusammensetzungen aus organischem Polymer als Matrix und anorganischen Partikeln als Füllstoff, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung und damit hergestellte Formkörper
DE102007027006A1 (de) 2007-06-08 2008-12-11 Evonik Degussa Gmbh Mikrobiologische Herstellung von Aldehyden, insbesondere von 3-Hydroxypropionaldehyd
DE102007031689A1 (de) 2007-07-06 2009-01-08 Evonik Goldschmidt Gmbh Enzympräparate
DE102007050833A1 (de) * 2007-10-24 2009-04-30 Lanxess Deutschland Gmbh Amphotere Ionenaustauscher
DE102008002090A1 (de) 2008-05-30 2009-12-03 Evonik Degussa Gmbh Ungesättigte Dicarbonsäuren aus ungesättigten cyclischen Kohlenwasserstoffen und Acrylsäure mittels Metathese, deren Verwendung als Monomere für Polyamide, Polyester, Polyurethane sowie weitere Umsetzung zu DIolen und Diaminen
DE102008002715A1 (de) 2008-06-27 2009-12-31 Evonik Röhm Gmbh 2-Hydroxyisobuttersäure produzierende rekombinante Zelle
DE102008040193A1 (de) 2008-07-04 2010-01-07 Evonik Röhm Gmbh Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren
DE102008040415A1 (de) 2008-07-15 2010-01-21 Evonik Röhm Gmbh Thermisches Salzspalten von Ammoniumcarboxylaten
DE102009000662A1 (de) 2009-02-06 2010-08-12 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von Aldehyden und Ketonen aus primären und sekundären Alkoholen
DE102009009580A1 (de) 2009-02-19 2010-08-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung freier Säuren aus ihren Salzen
DE102009002371A1 (de) 2009-04-15 2010-10-21 Evonik Goldschmidt Gmbh Verfahren zur Herstellung von geruchlosen Polyetheralkoholen mittels DMC-Katalysatoren und deren Verwendung in kosmetischen und/oder dermatologischen Zubereitungen
DE102009002811A1 (de) 2009-05-05 2010-11-11 Evonik Degussa Gmbh Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Aldehyden
DE102009029651A1 (de) 2009-09-22 2011-03-24 Evonik Röhm Gmbh Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren
DE102009046626A1 (de) 2009-11-11 2011-05-12 Evonik Degussa Gmbh Candida tropicalis Zellen und deren Verwendung
DE102009046910A1 (de) 2009-11-20 2011-05-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Aufarbeitung eines Laurinlactam enthaltenen Stoffstroms für die Rückgewinnung aller enthaltene Wertstoffkomponenten durch Kombination von Kristallisation mit nachgeschalteter Destillation
AU2010335313C1 (en) 2009-12-23 2015-07-02 Evonik Operations Gmbh Sweetener and method for the production thereof
DE102010015807A1 (de) 2010-04-20 2011-10-20 Evonik Degussa Gmbh Biokatalytisches Oxidationsverfahren mit alkL-Genprodukt
WO2011157573A2 (de) 2010-06-14 2011-12-22 Evonik Röhm Gmbh Ein enzym zur herstellung von methylmalonatsemialdehyd
DE102010026196A1 (de) 2010-06-25 2011-12-29 Evonik Degussa Gmbh Synthese von omega-Aminocarbonsäuren und deren Estern aus ungesättigten Fettsäurederivaten
DE102010030991A1 (de) 2010-07-06 2012-01-12 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von 2,5-Diformylfuran und seiner Derivate
DE102011004465A1 (de) 2010-09-10 2012-03-15 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur direkten Aminierung sekundärer Alkohole mit Ammoniak zu primären Aminen
DE102011075162A1 (de) 2010-12-08 2012-06-14 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur homogen-katalysierte, hochselektiven direkten Aminierung von primären Alkoholen mit Ammoniak zu primären Aminen bei hohem Volumenverhältnis von Flüssig- zu Gasphase und/oder hohen Drücken
UA112980C2 (uk) 2011-02-16 2016-11-25 Евонік Дегусса Гмбх Рідкі катіоніти
RU2013142804A (ru) 2011-02-21 2015-03-27 Эвоник Дегусса Гмбх Способ прямого аминирования спиртов аммиаком до первичных аминов с помощью каталитической системы на основе ксантфоса
DE102011015150A1 (de) 2011-03-25 2012-09-27 Evonik Degussa Gmbh Syntese von alpha, omega-Dicarbonsäuren und deren Estern aus ungesättigten Fettsäurederivaten
DE102011006362A1 (de) 2011-03-29 2012-10-04 Evonik Goldschmidt Gmbh Isopentylester zur Verwendung in kosmetischen, dermatologischen oder pharmazeutischen Kompositionen
BR112013026186A2 (pt) 2011-04-12 2016-07-26 Evonik Degussa Gmbh processo operável continuamente para a preparação de compostos de carbonila por meio de um catalisador contendo um radical nitroxila
EP2557176A1 (de) 2011-06-15 2013-02-13 Evonik Degussa GmbH Enzymatische Aminierung
ES2604335T3 (es) 2011-07-20 2017-03-06 Evonik Degussa Gmbh Oxidación y aminación de alcoholes primarios
WO2013020839A1 (de) 2011-08-05 2013-02-14 Evonik Degussa Gmbh Oxidation und aminierung von sekundären alkoholen
DE102011110945A1 (de) 2011-08-15 2013-02-21 Evonik Degussa Gmbh Biotechnologisches Syntheseverfahren von organischen Verbindungen mit alkIL-Genprodukt
DE102011110946A1 (de) 2011-08-15 2016-01-21 Evonik Degussa Gmbh Biotechnologisches Syntheseverfahren von omegafunktionalisierten Carbonsäuren und Carbonsäure-Estern aus einfachen Kohlenstoffquellen
EP2602328A1 (de) 2011-12-05 2013-06-12 Evonik Industries AG Verfahren zur Oxidation von Alkanen unter Verwendung einer AlkB Alkan 1-Monooxygenase
EP2607490A1 (de) 2011-12-22 2013-06-26 Evonik Industries AG Verfahren zur verbesserten Abtrennung einer hydrophoben organischen Lösung von einem wässrigen Kulturmedium
EP2620504A1 (de) 2012-01-25 2013-07-31 Evonik Industries AG Verfahren zur Oxidation von Alkenen unter Verwendung der Pseudomonas putida GPo1 AlkB Monooxygenase
EP2639308A1 (de) 2012-03-12 2013-09-18 Evonik Industries AG Enzymatische omega-Oxidation und -Aminierung von Fettsäuren
EP2730655A1 (de) 2012-11-12 2014-05-14 Evonik Industries AG Verfahren zur Umsetzung eines Carbonsäureesters unter Verwendung BioH-defizienter Zellen
EP2746397A1 (de) 2012-12-21 2014-06-25 Evonik Industries AG Herstellung von Omega-Aminofettsäuren
DE102013203470A1 (de) 2013-03-01 2014-09-04 Evonik Industries Ag Verfahren zur Herstellung von Ketonen aus Epoxiden

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998002411A1 (en) * 1996-07-15 1998-01-22 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem A process for the separation of amino acids and their salts from an aqueous solution
DE19919490A1 (de) * 1999-04-29 2000-11-23 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur Abtrennung organischer Substanzen aus einem wässrigen Gemisch
DE102007060705A1 (de) 2007-12-17 2009-06-18 Evonik Degussa Gmbh ω-Aminocarbonsäuren oder ihre Lactame, herstellende, rekombinante Zellen

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ASANO, Y.; FUKUTA, Y.; YOSHIDA, Y.; KOMEDA, H.: "The Screening, Characterisation, and Use of w-Laurolactam Hydrolase: A New Enzymatic Synthesis of 12-Aminolauric", ACID, BIOSC. BIOTECHN. BIOCHEM., vol. 72, no. 8, 2008, pages 2141 - 2150
J. SANGSTER: "Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry", vol. 2, 1997, WILEY SERIES IN SOLUTION CHEMISTRY, JOHN WILEY & SONS
J. SANGSTER: "Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry", 1997, JOHN WILEY & SONS
TEMPLE D M, ET AL: "Liquid Ion-exchange Extraction of some Physiologically Active Amines", NATURE, vol. 209, no. 5024, 12 February 1966 (1966-02-12), pages 714 - 715, XP002637507, ISSN: 0028-0836, DOI: 10.1038/209714a0 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9315443B2 (en) 2011-02-16 2016-04-19 Evonik Degussa Gmbh Liquid cation exchanger
US9765370B2 (en) 2012-04-02 2017-09-19 Evonik Degussa Gmbh Method for aerobically producing alanine or a compound produced using alanine

Also Published As

Publication number Publication date
RU2592287C2 (ru) 2016-07-20
WO2012110124A1 (de) 2012-08-23
EP2489432A2 (de) 2012-08-22
CA2826414C (en) 2019-04-23
EP2489432A3 (de) 2012-12-19
MY164856A (en) 2018-01-30
KR20140016285A (ko) 2014-02-07
RU2013141946A (ru) 2015-03-27
CN103459033A (zh) 2013-12-18
US9315443B2 (en) 2016-04-19
US20140054224A1 (en) 2014-02-27
JP2014511263A (ja) 2014-05-15
EP2489432B1 (de) 2017-08-23
MX344165B (es) 2016-12-07
CN103459032A (zh) 2013-12-18
CN103459033B (zh) 2016-08-10
CN103459032B (zh) 2017-02-15
US10071951B2 (en) 2018-09-11
MX2013009463A (es) 2013-09-06
KR101867119B1 (ko) 2018-07-17
SG192823A1 (en) 2013-09-30
AU2011359126A1 (en) 2013-09-05
SG192825A1 (en) 2013-09-30
CA2826414A1 (en) 2012-08-23
AU2011359126B2 (en) 2016-06-09
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