WO2012147403A1 - 細胞解析方法、細胞解析装置、および細胞解析プログラム - Google Patents

細胞解析方法、細胞解析装置、および細胞解析プログラム Download PDF

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WO2012147403A1
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optical path
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circular shape
colony
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範和 杉山
智親 竹嶋
浩一 兼子
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浜松ホトニクス株式会社
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    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Definitions

  • the present invention relates to a cell analysis method, a cell analysis device, and a cell analysis program.
  • Stem cells such as human-derived ES cells and iPS cells have the ability to differentiate into many types of cells, and human cells that have been difficult to date, such as elucidation of diseases, drug discovery screening, toxicity tests, and regenerative medicine, were used. It is attracting attention because it can be applied to large-scale drug efficacy evaluation and medical treatment. It is said that the differentiation efficiency at the time of inducing differentiation from these stem cells to a target cell depends largely on the state of the stem cell as a starting material. That is, if stem cells maintain pluripotency and do not maintain an undifferentiated state, the efficiency of differentiation induction decreases.
  • stem cells in order to industrially apply these stem cells, it is extremely important to manage the quality of the stem cells in the process of culturing the stem cells, and it is necessary to monitor the stem cells and determine the state. Moreover, in this management process, it is necessary to determine cells non-invasively in a cultured state. Further, these stem cells form a colony (a cell population composed of several thousands to several tens of thousands of cells), and a technique for judging the quality in the state of the colonies is required. A colony is not necessarily composed of cells of uniform quality, and the characteristics of the cells differ depending on the site. Therefore, it is desirable to obtain information such as a map that can grasp the distribution of the state of cells inside the colony using the state of individual cells constituting the colony as an index.
  • Patent Document 1 analyzes a cell image, identifies a region forming a colony from a region where a region where a colony is formed and a region where a colony is not formed, and determines the position and size of the colony region.
  • a cell image analysis apparatus that acquires the above information.
  • the single cell region that forms a colony has a shape close to a circular shape, and is different from the colony region according to the roundness (such as a value that is small when it is a circle and large when it is outside the circle). It is distinguished from the colony area.
  • the living cell and the dead cell Identify by using the polarization characteristics of cells and comparing the light intensity between the inside of the cell and the end of the cell, the living cell and the dead cell Identify.
  • living cells are said to be dark inside and bright outside, and an image having a high contrast can be obtained using a phase contrast microscope.
  • the judgment result is easily influenced by the subjectivity and experience of the observer. It can also be an obstacle to mass culture. Furthermore, since the number of cells constituting the cell distribution in the colony is large, the difficulty is further increased compared with visual observation of a single cell. Therefore, it is considered that there is an industry need for a cell colony state determination method, apparatus, and program that are quantitative and can be automated.
  • an object of the present invention is to provide a method, apparatus, and program for discriminating the state of a cell colony with high accuracy, which is quantitative and can be automated.
  • the cell analysis method of the present invention is a cell analysis method in a cell analysis apparatus for analyzing a cell colony using an optical path length image of a cell colony composed of a large number of cells.
  • the acquisition unit of the cell analysis device acquires an optical path length image of the cell colony, and the extraction unit of the cell analysis device corresponds to a circular shape corresponding to the cell nucleus of the cell in the acquired optical path length image.
  • An extraction step for extracting a shape, a comparison unit for comparing the optical path length on the inner side and an outer optical path length with respect to the extracted circular shape, and an analysis unit on the cell analysis device for extracting the shape And an analysis step of analyzing the cell colony based on the comparison result.
  • the cell analysis device of the present invention is a cell analysis device that analyzes the cell colony using an optical path length image of a cell colony composed of a large number of cells, and acquires the optical path length image of the cell colony In the acquired optical path length image, the extraction means for extracting a circular shape corresponding to the cell nucleus of the cell, and the inner optical path length and the outer optical path length are compared with the extracted circular shape. Comparing means, and analyzing means for analyzing the cell colony based on the comparison result.
  • the cell analysis program of the present invention uses a computer to analyze an optical path length image of the cell colony in a cell analysis apparatus that analyzes the cell colony using an optical path length image of a cell colony composed of a large number of cells.
  • cell colony analysis can be performed with high accuracy by a quantitative and automated technique. That is, by providing both a procedure for extracting a circular shape corresponding to the cell nucleus and a procedure for comparing the inner optical path length and the outer optical path length for the circular shape, the analysis of the cell colony is quantitative and It can be performed with high accuracy by an automated method.
  • the unique information of high-quality cells is used for analysis of cell colonies This is because cell colony analysis can be realized by a quantitative and automated technique. Furthermore, by focusing on the quantitative difference in the optical path length as well as the information on the shape of the round shape, it is possible to compensate for the fact that proper analysis could not be performed simply by extracting the circular shape. This is because high-level analysis can be realized.
  • Patent Document 3 since the brightness of the inside of the cell and the brightness of the outside of the cell are compared, it is necessary to accurately extract the outline of the cell, but the cells forming the cell colony are adjacent to each other. In some cases, the boundary between cells is not clear, and the outline of the cell cannot always be extracted accurately.
  • the present invention is different in that the optical path lengths inside and outside the cell nucleus are compared. Even if a cell colony is formed, a cell in good condition can be clearly distinguished from the inside and outside of the cell nucleus because the boundary of the cell nucleus can be clearly distinguished by the difference in refractive index between the cell nucleus and the cytoplasm. Therefore, according to the present invention, highly accurate cell colony analysis can be realized.
  • the state of cell colonies can be objectively compared with anyone who has been evaluated by the experience of the examiner by performing quantitative and automated techniques with high accuracy. It becomes a numerical value, and ambiguous elements such as the subjectivity of the examiner, physical condition, and variation between examiners can be eliminated. This makes it possible to analyze a uniform cell colony based on a certain criterion that does not depend on the skill of the examiner. In addition, the physical pain of the examiner who has been judged by observing a large number of cells and cell colonies with the naked eye can be alleviated. In addition, for example, by applying a stepped numerical value, it is possible to grasp a change with time of the state.
  • the cell in the comparison step and the analysis step, when the outer optical path length is larger than the inner optical path length in the circular shape, the cell may be determined as a high-quality cell. .
  • the determination method according to the present invention is based on the following consideration by the inventor. That is, from the experimental results by the inventors, it has been found that the shape of the cell nucleus is circular only in high-quality cells, and the optical path length inside the cell nucleus is smaller than the optical path length outside the cell nucleus. On the other hand, cells of poor quality are found to have a non-circular shape of the cell nucleus, or the optical path length inside the cell nucleus is the same or larger than the optical path length outside the cell nucleus even if it is circular. It was. Therefore, the difference in the optical path length between the inner side and the outer side of the cell nucleus is compared, and when the outer optical path length is larger than the inner optical path length, the cell can be determined as a cell of good quality.
  • the cell colony in the analysis step, when the number of cells per unit area determined to be high quality cells is greater than or equal to a threshold value, the cell colony may be determined as a high quality cell colony. .
  • a specific method for discriminating cell colonies with good quality from those with no quality is provided. This is consistent with the purpose of industrial application of quality control per cell colony. This is because evaluating each cell individually does not increase the throughput. This technique is based on the characteristics of cell colonies. In other words, since a cell colony is formed by dividing and proliferating cells, there are many cells with good quality around them, and many cells with poor quality around cells with poor quality. Tend to exist. From this point of view, the number of cells per unit area determined to be high-quality cells can be said to be appropriate as a criterion for distinguishing cell colonies with good quality from those with low quality.
  • the display unit of the cell analysis device may further include a display step of specifying and displaying a region included in the cell colony determined to have the good quality.
  • the optical path length image may be a quantitative optical path length image.
  • the present invention it is possible to easily compare the inner optical path length and the outer optical path length in the circular shape by the quantitative optical path length image.
  • the circular shape may be a true circular shape.
  • a primary judgment criterion for high-quality cells is provided. Depending on the accuracy and purpose of cell analysis, it can be adopted as the criterion that the circular shape is a true circular shape.
  • the true circular shape may be a true circular shape having a predetermined range of diameters.
  • a primary judgment criterion for high-quality cells is provided.
  • the circular shape is a true circular shape having a predetermined range of diameters.
  • the circular shape may be an elliptical shape.
  • a primary judgment criterion for high-quality cells is provided.
  • the determination that the circular shape is an elliptical shape can be adopted.
  • the cell may be a stem cell.
  • the present invention can be used for industrial applications of stem cells including iPS cells and ES cells.
  • stem cells including iPS cells and ES cells.
  • the determination of stem cells and stem cell colonies in culture can be performed by a quantitative and automated method, and can be performed with higher accuracy, thus saving labor. And mass production becomes possible.
  • a cell analysis method it is possible to provide a cell analysis method, a cell analysis apparatus, and a cell analysis program that are quantitative and can be automated and that can determine the state of a cell colony with higher accuracy.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of a cell analysis system 1.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a functional configuration of a cell analysis device D.
  • FIG. It is a schematic diagram which shows the hardware constitutions of the cell analyzer D.
  • 3 is a flowchart showing an operation performed by the cell analysis system 1. It is a figure which shows the cell colony judged to be good quality by the method of step S5 of FIG. It is a figure which shows the cell colony judged not to be good quality by the method of step S5 of FIG.
  • FIG. 1 is an image of a quantitative phase microscope showing an example of a stem cell with good quality ((A) in FIG. 1) and a stem cell with poor quality ((B) in FIG. 1).
  • An object of the present invention is to provide a method, an apparatus, and a program for discriminating between cells and cells of poor quality quantitatively and automatically, and with higher accuracy, thereby discriminating the state of cell colonies.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the characteristics of high-quality stem cells as shown in FIG.
  • the solid line shows the outline of the stem cell
  • the broken line shows the outline of the nucleus of the stem cell
  • the alternate long and short dash line shows the line profile.
  • FIG. 2A high-quality stem cells tend to have a perfect circle in their nuclei (see broken line).
  • FIG. 2B is a diagram showing the optical path length by associating the line profile indicated by the alternate long and short dash line in FIG. 2A with the horizontal axis. As shown in FIG. 2 (B), it can be seen that a high-quality stem cell has a smaller optical path length inside the cell nucleus than that outside.
  • the “optical path length” in the present embodiment can also be understood as “phase difference” or “optical thickness”. However, for convenience of explanation, the term is collectively described as “optical path length” below.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the characteristics of stem cells with poor quality as shown in FIG. 3A.
  • the solid line indicates the outline of the stem cell
  • the broken line indicates the outline of the nucleus of the stem cell
  • the alternate long and short dash line indicates the line profile.
  • the nucleus may form a perfect circle (see broken line).
  • FIG. 3B is a diagram illustrating the optical path length by associating the line profile indicated by the alternate long and short dash line in FIG. 3A with the horizontal axis. As shown in FIG. 3 (B), it can be seen that a stem cell with poor quality has an optical path length on the inner side of the cell nucleus smaller than that on the outer side even if the cell nucleus is a perfect circle. .
  • the decisive difference between high-quality stem cells and poor-quality stem cells is the optical path length inside and outside the cell nucleus, not whether or not the cell nucleus is a perfect circle.
  • the stem cell tends to be a poor quality stem cell. Therefore, in the present invention, by comparing whether or not the cell nucleus is a perfect circle and the optical path lengths inside and outside the cell nucleus, it is possible to quantitatively determine the quality cells and the poor quality cells that are the object of the invention.
  • FIG. 4 and FIG. 5 are diagrams for further explaining that the decisive difference between a high quality stem cell and a poor quality stem cell is the optical path length inside and outside the cell nucleus.
  • FIG. 4A shows the result of measuring the optical path length of the cell nucleus.
  • Graph A shows the optical path length of the cell nucleus of a high quality stem cell
  • graph B shows the optical path length of the cell nucleus of a stem cell of poor quality.
  • FIG. 4B shows the result of measuring the optical path length of the cytoplasm (outside the cell nucleus).
  • Graph A shows the optical path length of the cytoplasm of a good quality stem cell
  • graph B shows the stem quality of a poor quality. The optical path length of the cytoplasm is shown.
  • the cell analysis system 1 analyzes a cell colony using an optical path length image of a cell colony composed of a large number of cells.
  • 6 is a configuration diagram of the cell analysis system 1
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing a functional configuration of the cell analysis device D
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing a hardware configuration of the cell analysis device D.
  • the cell analysis system 1 is mainly composed of a quantitative phase microscope A and a cell analyzer D.
  • the quantitative phase microscope A includes a microscope main body A1 including a sample stage A4 that supports the measurement sample S, an objective lens A5, a reflection part A6, and a light interference part A7.
  • a lens A2 facing the emission-side end face B1 of the optical fiber B that guides irradiation light H0 (laser light) from a light emission unit (not shown) and the lens A2 pass.
  • a reflection part A3 that reflects the light H0 is provided.
  • an imaging device C such as a CCD camera that images an interference fringe (not shown, the same applies hereinafter) generated by the optical interference unit A7, and the interference fringe is connected to the imaging device C.
  • a cell analysis device D for analyzing the above.
  • the sample stage A4 is, for example, substantially plate-shaped having a light transmission part A41 capable of transmitting light at the center and having a placement surface A42 on which the measurement sample S can be placed.
  • a light transmission part A41 capable of transmitting light at the center
  • a placement surface A42 on which the measurement sample S can be placed.
  • the light transmitting portion A41 may be formed from a member that can transmit light, such as glass, or may be a simple hole.
  • the objective lens A5 expands incident measurement light H1 at a predetermined magnification according to the operation based on an operation of an operation unit (not shown), and emits it as parallel light (measurement light H1). Is.
  • the reflection part A6 is, for example, a total reflection type mirror, and allows the light to be measured H1 from the objective lens A5 to be totally reflected and introduced into the light interference part A7.
  • the optical interference unit A7 separates the measured light H1 into two light beams H1a and H1b, and the measured light H1 (H1a and H1b) emitted from the light separation device A71 is converged light H2 (H2a).
  • the light separating element A71 is configured using a diffraction grating. Furthermore, the light separation element A71 may be a polarization separation element that separates two light beams having different polarization directions. In that case, the optical interference unit A7 separates the measured light H1 into two light beams H1a and H1b having different polarization directions, and a condensing lens A72 that converts the light beam to be converged light H2 (H2a and H2b).
  • a spatial filter A73 disposed at the convergence position of the convergent light H2, an object light H3 and reference light H4 transmitted through the spatial filter A73, a half-wave plate A74 disposed on the emission side of the spatial filter A73, and the half-wavelength And a synthetic lens A75 that generates interference fringes by superimposing the object light H3 and the reference light H4 whose polarization directions are aligned by the plate A74.
  • a polarizer may be disposed to align the polarization directions of the object light H3 and the reference light H4.
  • the cell analysis device D physically includes a main storage device such as a CPU D11, a ROM D12, and a RAM D13, an input device D14 such as a keyboard and a mouse, and an output device D15 such as a display, for example, imaging. It is configured as a normal computer system including a communication module D16 such as a network card for transmitting / receiving data to / from other devices such as the device C, an auxiliary storage device D17 such as a hard disk, and the like.
  • a communication module D16 such as a network card for transmitting / receiving data to / from other devices such as the device C, an auxiliary storage device D17 such as a hard disk, and the like.
  • Each function of the cell analysis apparatus D to be described later has an input device D14, an output device D15, and a device under the control of the CPU D11 by reading predetermined computer software on hardware such as the CPU D11, ROM D12, and RAM D13. This is realized by operating the communication module D16 and reading and writing data in the main storage devices D12 and D13 and the auxiliary storage device D17.
  • the cell analysis device D includes, as functional components, an acquisition unit D1 (corresponding to “acquisition means” and “acquisition step” in the claims) and an extraction unit D2 (in the claims).
  • acquisition unit D1 corresponding to “acquisition means” and “acquisition step” in the claims
  • extraction unit D2 in the claims.
  • comparison unit D3 corresponding to” comparison means “and” comparison step “in the claims
  • analysis unit D4 (equivalent to” analysis means “and” comparison steps “in the claims) Analysis section ”)
  • a display unit D5 corresponding to“ display means ”and“ display step ”in the claims).
  • the acquisition unit D1 acquires an optical path length image of a cell colony from the imaging device C.
  • the extraction unit D2 extracts a circular shape corresponding to the cell nucleus of the cell in the acquired optical path length image.
  • the comparison unit D3 compares the inner optical path length and the outer optical path length with respect to the extracted circular shape.
  • the analysis unit D4 analyzes cells and cell colonies based on the comparison result.
  • the comparison unit D3 and the analysis unit D4 determine that the cell is a high-quality cell when the outer optical path length is larger than the inner optical path length in the circular shape.
  • the analysis unit D4 determines that the cell colony is a high-quality cell colony when the number of cells per unit area determined to be a high-quality cell is equal to or greater than a threshold value.
  • the display unit D5 identifies and displays a region included in a cell colony determined to have good quality.
  • FIG. 9 is a flowchart showing operations performed by the cell analysis system 1.
  • the acquisition unit D1 acquires an optical path length image of a cell colony.
  • the optical path length image of the cell colony is a quantitative optical path length image, and is obtained by imaging the output of the quantitative phase microscope A by the imaging device C and outputting it to the acquisition unit D1 of the cell analysis device D.
  • the following operation will be described with stem cells as an example of cells.
  • the quantitative optical path length image acquired in step S1 includes the following five types.
  • the following “non-stem cell” refers to, for example, a “dead stem cell”.
  • (A) good stem cells (b) bad stem cells with round nuclei (c) bad stem cells with irregular nuclei (d) non-stem cells with round shapes (e) stem cells Of those that are not, variants
  • the extraction unit D2 extracts a circular shape corresponding to the cell nucleus of the cell from the acquired quantitative optical path length image.
  • the extraction unit D2 may first specify the area of the stem cell colony from the quantitative optical path length image, and then extract a circular shape corresponding to the cell nucleus of each stem cell.
  • contour extraction may be first performed as preprocessing, and then a circular shape may be extracted by obtaining a portion with a high voter turnout by Hough transform on the contour image.
  • the Hough transform is a technique suitable for efficiently extracting a circular shape, but is not limited thereto, and for example, a circular shape may be extracted based on a curvature or the like.
  • the circular shape extracted by the extraction unit D2 may be a true circular shape, the true circular shape may be a true circular shape having a diameter in a predetermined range (for example, about 11 to 14 ⁇ m), or an elliptical shape. There may be.
  • step S2 By extracting the circular shape in step S2, the following three types remain.
  • the comparison unit D3 compares the inner optical path length and the outer optical path length with respect to the circular shape extracted in step S2. As a result of the optical path length comparison, the comparison unit D3 has a value of the optical path length of the circular outer region (portion constituting the cytoplasm) compared to the value of the optical path length of the circular inner region (portion constituting the cell nucleus). Extract large ones.
  • the comparison unit D3 may perform extraction based on the determination that the average value of the optical path length outside the circular shape is equal to or greater than a predetermined threshold value compared to the average value of the optical path length inside the circular shape. good.
  • the comparison unit D3 may perform extraction based on a criterion that the gradient of the horizontal and vertical profiles orthogonal to the circular shape is in the minus direction from the outer side to the inner side of the circular shape.
  • the analysis unit D4 performs an analysis in units of cells on the one extracted in step S3.
  • the analysis unit D4 determines that the cell is a good quality cell when the outer optical path length is larger than the inner optical path length in the circular shape extracted in step S3, that is, the circular shape extracted in step S2. This is because only (a) of (a), (b) and (d) is left in the extraction in step S3.
  • optical path length is obtained by multiplying the “refractive index” by “physical thickness” as shown in the following formula (1).
  • the difference in optical path length is quantified. It is expressed as a light and dark image with characteristics.
  • Optical path length refractive index ⁇ physical thickness (1)
  • the refractive index of the cell nucleus is generally lower than the refractive index of the cytoplasm (outside of the cell nucleus) as shown in the following formula (2) (for example, the following reference).
  • Refractive index inside cell nucleus ⁇ Refractive index outside cell nucleus ...
  • ⁇ Reference 1> Syntheticaperture tomographic phase microscopy for 3D imaging of live cells intranslational motion, Niyom Lue, Wonshik Choi, Gabrielippo, Kamran Badizadegan, Ramachandra R. Dasari, and Michael S. Feld, Optics Express, Vol. 16, Issue 20, pp. 16240-16246, 2008
  • a high-quality stem cell has substantially the same physical thickness inside the cell nucleus and outside the cell nucleus as shown in the following formula (3). This is because high-quality stem cells have a close cytoplasm between cell nuclei because the distance between adjacent stem cells is short.
  • (High quality stem cells) Physical thickness inside cell nucleus ⁇ Physical thickness outside cell nucleus ... (3)
  • a stem cell with poor quality has a much thicker physical thickness inside the cell nucleus than the physical thickness outside the cell nucleus, as shown in the following equation (4). This is because a stem cell with poor quality has a thin cytoplasm between cell nuclei because the distance between adjacent stem cells is long.
  • (Poor quality stem cells) Physical thickness inside the cell nucleus >> Physical thickness outside the cell nucleus ... (4)
  • the following equation (5) is established for the optical path length when the relationship between the above equations (2) and (3) is considered in equation (1).
  • (High quality stem cells) Optical path length inside cell nucleus ⁇ Optical path length outside cell nucleus ... (5)
  • the following equation (6) is established for the optical path length when the relationship between the above equations (2) and (4) is considered in equation (1).
  • (Poor quality stem cells) Optical path length inside cell nucleus> Optical path length outside cell nucleus ... (6)
  • the difference in optical path length is expressed as light and dark information (luminance) with quantitativeness in the quantitative optical path length image
  • the luminance value inside the cell nucleus is low in the quantitative optical path length image, and the luminance outside the cell nucleus. If the value looks high, that is, if the inside of the nucleus looks dark, it can be said that the stem cell is a good quality stem cell. On the other hand, if the luminance value inside the cell nucleus is high and the luminance value outside the cell nucleus appears low, that is, if the inside of the nucleus does not appear dark, it can be said that the stem cell is a stem cell of poor quality.
  • the comparison unit D3 compares the optical path length in step S3, and as a result, the circular outer region (forms the cytoplasm) as compared with the optical path length value of the circular inner region (part constituting the cell nucleus).
  • the extracted cell is a high-quality stem cell. In other words, it can be said that this extraction excludes “better stem cells whose nuclei have a circular shape” in (b).
  • the circular shape is also excluded because the luminance difference between the inside and outside of the circular shape does not match.
  • the reason will be described below. That is, it is mainly dead cells that are considered as particles other than stem cells in a culture environment, and the refractive index of dead cells is higher than that of surrounding solutions. Therefore, the optical path length of dead cells is higher than the surroundings, and the luminance value inside the circular shape is high and the luminance value outside the circular shape is low in the quantitative optical path length image, that is, the inside of the circular shape is lower than the surroundings. Since it looks bright, it is excluded by extraction in step S3.
  • the analysis unit D4 determines that the number of stem cells determined as the high quality stem cells per unit area is greater than or equal to the threshold value.
  • the cell colony is determined to be a high-quality stem cell colony. Specifically, for example, when the density (number / mm 2 ) of stem cells determined to be high-quality stem cells is equal to or higher than a threshold value, the cell colony is determined to be a high-quality stem cell colony.
  • FIGS. 10 to 12 are diagrams showing “good stem cells” of (a) extracted by the method described in step S4 in both (A) and (B).
  • the “good stem cell” extracted in step S4 is indicated by a round, white solid line.
  • FIG. 10 shows a case where the density [cells / mm 2 ] of cells determined to be high quality cells by the method of step S5 is equal to or higher than a threshold value. “Good stem cells”.
  • FIG. 11 shows “good stem cells” in a stem cell colony determined as a cell colony of poor quality by the method of step S5.
  • FIG. 12 shows “good stem cells” in a case where a portion determined to have good quality and a portion determined to have poor quality are mixed by the method of step S5.
  • FIG. 10 shows a case where the density [cells / mm 2 ] of cells determined to be high quality cells by the method of step S5 is equal to or higher than a threshold value.
  • FIG. 11 shows “good stem cells” in a stem
  • the upper half corresponds to a portion determined to have poor quality
  • the lower half corresponds to a portion determined to have good quality
  • the upper half corresponds to a portion determined to have good quality
  • the lower half corresponds to a portion determined to have poor quality.
  • all the circular shapes may be extracted and then the optical path lengths of each circular shape may be compared to perform analysis in units of cells.
  • one circular shape may be extracted, the optical path lengths may be compared with the circular shape, and the analysis may be performed on a cell basis by repeating these procedures.
  • FIG. 13 shows an example of display by the display unit D5.
  • the display unit D5 performs display by pseudo color mapping.
  • FIG. 13 displays the information amount determined to be a high-quality stem cell (for example, the perfect circle shape extracted in steps S3 and S4) and the other information in a shaded manner.
  • the dark portion indicated by the symbol A there is an amount of information determined to be a high quality stem cell.
  • the light part indicated by the symbol B there is an amount of information determined as a stem cell with poor quality.
  • FIG. 13 is displayed in color in the actual embodiment by the inventor, but FIG. 13 attached to the application is a black and white figure in the application procedure.
  • the applicant of the present application separately submits the actual color drawing of FIG.
  • FIG. 13 it is possible to grasp at a glance a two-dimensional distribution indicating which region of the stem cell colony has a high quality stem cell. That is, the left side of FIG. 13 is a portion where there are many stem cells in a poor quality state (symbol B) and is judged to be a poor quality region.
  • the right side of FIG. 13 has many stem cells in good quality (symbol A) and is a portion judged to be a high quality region.
  • FIG. 14 shows a result of displaying the density of the amount of information determined to be a high-quality stem cell (for example, the perfect circle shape extracted in steps S3 and S4) on the vertical axis, and determining the quality of the stem cell visually by the observer. Is displayed along the horizontal axis.
  • FIG. 14 shows a result of displaying the density of the amount of information determined to be a high-quality stem cell (for example, the perfect circle shape extracted in steps S3 and S4) on the vertical axis, and determining the quality of the stem cell visually by the observer. Is displayed along the horizontal axis.
  • the determination method of the analysis unit D4 that determines a high-density portion (for example, a density of 200 [pieces / mm 2 ] or more) as a high-quality region is determined to be good quality visually. It is consistent with the result. That is, it can be said that the result similar to the visual result was obtained by the determination method in the present embodiment.
  • a high-density portion for example, a density of 200 [pieces / mm 2 ] or more
  • the present invention relates to a method for displaying a high-quality stem cell colony (including a partial region of the stem cell colony) using these densities.
  • a description will be given with reference to FIG.
  • a portion indicated by a round and white solid line in FIGS. 10 to 12 is referred to as a “perfect circle object”.
  • FIGS. 10 to 12 First, an image displaying a perfect circle object as shown in FIGS. 10 to 12 is input. Based on the input image, an image displaying the center coordinates of the perfect circle object is created.
  • FIG. 15A shows an image in which the center coordinates of a perfect circle object are displayed.
  • the center coordinates of the perfect circle object can be displayed by binarization, for example.
  • a rectangular mask having an appropriate size is prepared for the image shown in FIG. 15A, and the number of perfect circle objects existing in the mask is substituted into the center coordinates (pixels) of the mask. .
  • This operation is performed for all the pixels while moving the mask.
  • the size of the mask There is no particular limitation on the size of the mask, but if the size of the mask is too small, the gap between cells cannot be filled. Therefore, it is necessary to appropriately set a mask size according to the distance between cells where cells exist, here the distance between the cell nucleus and the cell nucleus. For example, if the distance between cells is about 15 ⁇ m, a mask having a diameter of 15 ⁇ m or more may be used.
  • FIG. 15F shows an example in which the mask size is too small to be successful. In terms of treating the distance from the center coordinates equally, a rectangular mask is more preferable than a rectangular mask because a rectangular mask is a mask having a long distance in a 45 degree diagonal direction.
  • the density image of perfect circle objects having a distribution that increases in value according to the density of perfect circle objects.
  • the low density portion of the true circle object can be removed by increasing the luminance value of the pixel according to the density of the true circle object.
  • FIG. 15B shows the density image of the perfect circle object created by the above method, and the brightness value of the high density portion of the perfect circle object is high and displayed in white.
  • the outline of the region is obtained using an appropriate threshold value.
  • the obtained contour line is displayed as a broken line. Note that the region specified by the obtained outline matches the high density portion of the perfect circle object, as shown in FIG.
  • the region specified by the contour line in FIGS. 15C and 15D is applied to the image of the stem cell colony.
  • region can be specified and it can be displayed.
  • E of FIG. 15 shows the state, and an area specified by being surrounded by a broken line is a high quality area in the stem cell colony.
  • information such as position coordinates can be extracted from the image shown in FIG. 15E and used for cell manipulation (cutting out and collecting).
  • the luminance value of the pixel of the density image of the perfect circle object is increased according to the density of the true circle object (see FIG. 15B), and for the density image of the perfect circle object
  • the contour line of the region using an appropriate threshold see FIGS. 15C and 15D
  • the density of the perfect circle object is 200 [number / mm 2 ] or more.
  • the brightness value can be adjusted and the contour line can be obtained by using the determined stem cell as a guide. Note that the density of the perfect circle object is 200 [number / mm 2 ] or more is consistent with the result in FIG. 14 described above.
  • the operation of the display unit D5 described above is based on the following concept. That is, since the cells form cell colonies while proliferating, cells having the same properties tend to be adjacent to each other to form a population. In other words, there are a lot of cells of good quality around the cells of good quality, and if the detected circular object has a certain density, it is judged that the region is formed of good cells. It will be possible. With this concept, even if the determination for each stem cell is a little wrong, the correct determination can be made for the entire cell colony.
  • the present invention can also be configured as a cell analysis program, and the above description regarding the cell analysis device D can also be understood as a description regarding a cell analysis program that causes a computer to operate as the cell analysis device D. Although overlapping description is omitted, the cell analysis program causes the computer to function as the acquisition unit D1, the extraction unit D2, the comparison unit D3, the analysis unit D4, and the display unit D5 described above.
  • the cell analysis program is provided by being stored in a recording medium, for example. Examples of the recording medium include a flexible disk, a recording medium such as a CD and a DVD, a recording medium such as a ROM, or a semiconductor memory.
  • analysis of stem cell colonies can be performed with high accuracy by a quantitative and automated technique.
  • the analysis of stem cell colonies is quantitatively provided by providing both a procedure for extracting a circular shape corresponding to the nucleus of the stem cell and a procedure for comparing the inner optical path length and the outer optical path length for the circular shape. And can be performed with high accuracy by an automated method.
  • the brightness of the inside of the stem cell and the brightness of the outside of the stem cell are compared. Therefore, it is necessary to accurately extract the outline of the stem cell, but the stem cells forming the stem cell colony are adjacent to each other. In this case, the boundary between stem cells is not clear, and the outline of the stem cells cannot always be extracted accurately.
  • the present embodiment is different in that the optical path lengths inside and outside the nucleus of the stem cell are compared. Even if a stem cell colony is formed, a stem cell in a good state can be clearly distinguished from the inside and outside of the stem cell nucleus because the nucleus boundary of the stem cell can be clearly distinguished by the refractive index difference between the nucleus and the cytoplasm. Therefore, according to this embodiment, a highly accurate analysis of a stem cell colony can be realized.
  • a specific method for determining high-quality stem cells is provided.
  • the determination method according to the present embodiment is based on the following consideration by the inventors. That is, from the experiment results by the inventor, it was found that the stem cell nucleus shape was circular only in high-quality stem cells, and the optical path length inside the nucleus was smaller than the optical path length outside the nucleus. .
  • stem cells with poor quality are found to have a nuclear shape that is not circular, or that the optical path length inside the nucleus is the same or larger than the optical path length outside the nucleus, even though it is circular. It was. Therefore, the difference in the optical path length between the inner side and the outer side of the nucleus of the stem cell is compared, and when the outer optical path length is larger than the inner optical path length, the stem cell can be determined as a high quality stem cell.
  • a specific method for distinguishing a stem cell colony having a high quality from a stem cell colony that is not so is provided. This is consistent with the purpose of industrial application of quality control of stem cell colony units. This is because evaluating the stem cells one by one does not increase the throughput. This technique is based on the characteristics of stem cell colonies. In other words, since stem cell colonies are formed by dividing and proliferating stem cells, there are many high-quality stem cells around them, and many poor-quality stem cells are around the poor-quality stem cells. Tend to exist. From this viewpoint, the number of stem cells per unit area determined to be high quality stem cells can be said to be appropriate as a criterion for distinguishing between high quality stem cell colonies and other stem cell colonies.
  • a specific method for allowing the user to easily confirm the analysis result of the stem cell colony according to the present embodiment is provided.
  • a primary criterion for determining high quality stem cells is provided.
  • the criterion that the circular shape is a true circular shape it can be adopted as the determination criterion that the circular shape is a true circular shape having a predetermined range of diameters.
  • the determination criterion that the circular shape is an elliptical shape it can be adopted as the determination criterion that the circular shape is an elliptical shape.
  • This embodiment can be used for industrial applications of stem cells including iPS stem cells and ES stem cells.
  • this embodiment is applied to a stem cell culture apparatus, etc., the determination of the stem cells and stem cell colonies being cultured can be performed by a quantitative and automated method, and can be performed with higher accuracy. And mass production become possible.
  • the configuration in which the cell analysis system 1 includes the quantitative phase microscope A has been described in order to obtain an optical path length image of a cell or a cell colony, but the present invention is not limited thereto.
  • an optical path length image of a cell or a cell colony may be obtained using a phase contrast microscope.
  • the apparatus becomes inexpensive and leads to cost saving.
  • DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Cell analysis system, A ... Quantitative phase microscope, A1 ... Microscope main body, B ... Optical fiber, C ... Imaging apparatus, D ... Cell analysis apparatus, D1 ... Acquisition part, D2 ... Extraction part, D3 ... Comparison part, D4 ... Analysis unit, D5... Display unit.
  • the present invention provides a cell analysis method, a cell analysis apparatus, and a cell analysis program that are quantitative and can be automated and that determine the state of a stem cell colony with higher accuracy.

Abstract

多数の細胞から構成される細胞コロニーの光路長画像を用いて、細胞コロニーの解析を行う細胞解析装置Ｄにおける細胞解析方法であって、細胞解析装置Ｄの取得部Ｄ１が、細胞コロニーの光路長画像を取得するステップと、細胞解析装置Ｄの抽出部Ｄ２が、当該取得した光路長画像中において、細胞の細胞核に対応する円形形状を抽出するステップと、細胞解析装置Ｄの比較部Ｄ３が、当該抽出した円形形状に対し、その内側の光路長および外側の光路長を比較するステップと、細胞解析装置Ｄの解析部Ｄ４が、当該比較結果に基づき、細胞コロニーの解析を行うステップと、を備える。

Description

細胞解析方法、細胞解析装置、および細胞解析プログラム
　本発明は、細胞解析方法、細胞解析装置、および細胞解析プログラムに関するものである。
　ヒト由来のＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの幹細胞は、多種類の細胞に分化する能力を持ち、病気の解明や創薬スクリーニング、毒性試験、再生医療など、これまで困難であったヒト細胞を用いた大規模な薬効評価や医療への応用が可能であることで注目されている。これらの幹細胞から目的の細胞に分化誘導を行う際の分化効率は、出発材料である幹細胞の状態に大きく依存するとされている。つまり幹細胞が多能性を維持し、未分化な状態を保持していないと、分化誘導の効率が低下する。そのためこれらの幹細胞を産業応用するためには、幹細胞を培養している工程において幹細胞の品質を管理することが極めて重要であり、幹細胞をモニタリングし、状態を判別する必要がある。なおかつこの管理工程では細胞を培養状態で非侵襲に判定する必要がある。またこれらの幹細胞はコロニー（数千～数万個程度の複数の細胞からなる細胞集団）を形成しており、コロニーの状態で品質を判断する技術が必要とされている。コロニーは均一な品質の細胞で構成されるとは限らず、部位によって細胞の特性は異なる。そのため、コロニーを構成する個々の細胞の状態を指標としてコロニー内部の細胞の状態の分布を把握することのできるマップなどの情報が得られることが望ましい。
　特許文献１は、細胞画像を解析し、コロニーを形成している領域と形成していない領域とが混在する領域から、コロニーを形成している領域を特定し、コロニー領域の位置や大きさ等の情報を取得する細胞画像解析装置を開示する。特に、コロニーを形成する単一細胞領域は、円形形状に近い形状となるとし、真円度（円であると小さく、円から外れると大きくなるような値など）に応じて、コロニー領域と非コロニー領域とを区別している。
　特許文献２に記載の細胞状態判定装置では、浮遊細胞の活性状態を判定する装置において、細胞の状態が良いほど、浮遊細胞の形状が円形に近く、状態が悪いほど楕円度が強くなったり、いびつな形状になる見地から、最初に、浮遊細胞の画像を取得する。次に、取得された位相画像中の浮遊細胞の輪郭を抽出し、当該抽出した浮遊細胞の輪郭がどれだけ円形に近いかを判定する。
　特許文献３に記載の培養液の評価装置では、細胞の偏光特性を利用し、細胞の内側と、細胞の端との光の強度を比較することで、生きている細胞と死んでいる細胞とを識別する。特に、生きている細胞は細胞の内側が暗く、細胞の外側が明るいとしており、また、位相差顕微鏡を用いると、コントラストが大きい像を取得できるとしている。
特開２０１１－２４４８５号公報 特開２００８－２１２０１７公報 特表２００３－５２９７４号公報
　光学顕微鏡を用いて目視にて細胞やコロニーの形状を観察し判断する方法は、判断結果が観察者の主観や経験に左右されやすい。また大量培養の障害ともなり得る。更にコロニー内の細胞分布に至っては、構成する細胞の数が多いことから、細胞単体の目視観察に比べていっそう困難さが増大する。したがって、定量的で且つ自動化が可能な細胞コロニーの状態判別方法、装置、プログラムに対する業界のニーズがあると考えられる。
　上記の特許文献１および２に記載の例では、取得された細胞画像から円形形状を抽出し、当該抽出された円形の真円度、面積、円周などにより細胞を評価している。しかし、品質の良くない細胞でも円形形状となる場合があり、上記方法では、コロニーを形成する細胞が品質の良い細胞かどうかを正確に評価・識別することはできない。
　また、上記の特許文献３に記載の例では、細胞の内側と細胞の端を比較している。しかし、コロニーでは、複数の細胞が密集しており、細胞と細胞が接触している場合が多く、細胞の端を正確に抽出することは容易なことではない。したがって、細胞の端の抽出に誤りが発生した場合には、細胞判別の結果にもその悪影響が及ぶこととなってしまう。
　そこで、本発明は上記に鑑みてなされたもので、定量的で且つ自動化が可能で、更に精度高く細胞コロニーの状態を判別する方法、装置、およびプログラムを提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、本発明の細胞解析方法は、多数の細胞から構成される細胞コロニーの光路長画像を用いて、前記細胞コロニーの解析を行う細胞解析装置における細胞解析方法であって、前記細胞解析装置の取得手段が、前記細胞コロニーの光路長画像を取得する取得ステップと、前記細胞解析装置の抽出手段が、当該取得した光路長画像中において、前記細胞の細胞核に対応する円形形状を抽出する抽出ステップと、前記細胞解析装置の比較手段が、当該抽出した円形形状に対し、その内側の光路長および外側の光路長を比較する比較ステップと、前記細胞解析装置の解析手段が、当該比較結果に基づき、前記細胞コロニーの解析を行う解析ステップと、を備える。
　また、本発明の細胞解析装置は、多数の細胞から構成される細胞コロニーの光路長画像を用いて、前記細胞コロニーの解析を行う細胞解析装置であって、前記細胞コロニーの光路長画像を取得する取得手段と、当該取得した光路長画像中において、前記細胞の細胞核に対応する円形形状を抽出する抽出手段と、当該抽出した円形形状に対し、その内側の光路長および外側の光路長を比較する比較手段と、当該比較結果に基づき、前記細胞コロニーの解析を行う解析手段と、を備える。
　また、本発明の細胞解析プログラムは、コンピュータを、多数の細胞から構成される細胞コロニーの光路長画像を用いて、前記細胞コロニーの解析を行う細胞解析装置における、前記細胞コロニーの光路長画像を取得する取得手段と、当該取得した光路長画像中において、前記細胞の細胞核に対応する円形形状を抽出する抽出手段と、当該抽出した円形形状に対し、その内側の光路長および外側の光路長を比較する比較手段と、当該比較結果に基づき、前記細胞コロニーの解析を行う解析手段、として動作させる。
　このような本発明の細胞解析方法、細胞解析装置、および細胞解析プログラムによれば、細胞コロニーの解析を定量的で且つ自動化された手法により精度高く行うことができる。すなわち、細胞核に対応する円形形状を抽出する手順と、当該円形形状に対し、その内側の光路長および外側の光路長を比較する手順を両方とも備えることにより、細胞コロニーの解析を定量的で且つ自動化された手法により精度高く行うことができる。細胞核の内側および外側の光路長の違い、つまり細胞核における光路長と細胞核の周りの細胞質における光路長との違いに着目したことで、品質の良い細胞の特有の情報を細胞コロニーの解析に利用することができ、これにより定量的で且つ自動化された手法による細胞コロニーの解析が実現できるからである。更に、形が丸いという形状の情報のみならず、光路長の定量的な違いに着眼したことで、円形形状の抽出だけでは適切な解析が不可能だったことを補うことができ、これにより精度の高い解析が実現できるからである。
　なお、上述の特許文献３では、細胞の内側と細胞の外側の明るさを比較するので、細胞の輪郭を正確に抽出する必要があるが、細胞コロニーを形成している細胞が隣接している場合は、細胞間の境界ははっきりしておらず、細胞の輪郭が正確に抽出できるとは限らない。一方で、本発明では、細胞核の内外の光路長を比較している点で相違する。細胞コロニーを形成していても、良い状態の細胞は、細胞核と細胞質の屈折率差によって、細胞核の境界がはっきり区別できるので、細胞核の内側と外側が正確に区別できる。したがって、本発明によれば、精度の高い細胞コロニーの解析を実現できる。
　以上のように、細胞コロニーの状態を定量的で且つ自動化された手法により精度高く行うことによって、これまで検査者の経験により評価されていたものが、だれが行っても客観的に比較可能な数値となり、検査者の主観、体調、検査者間のばらつきといったあいまいな要素を排除できる。これにより、検査者の技能によらない一定の判断基準に基づいた均一な細胞コロニーの解析を行うことが可能になる。また、数多くの細胞および細胞コロニーを肉眼で観察して判断していた検査者の肉体的苦痛を緩和することができる。また、例えば段階化された数値を適用することによって、状態の経時変化を把握することができ、この場合には、例えば培養開始後、早期に状態が悪くなる予兆等を判断することができる。そのため、状態が悪くなる前にリカバリできる機会が増え、工程全体での良品率が向上するとともに、無駄に培養資材を浪費することが避けられ、生産コストの低減につながる。さらには、同じ判断基準を別の生産者の工程に容易に持ち込むことができ、異なる生産者間同士で共通の品質の細胞を提供することが可能になる。
　また、本発明において、前記比較ステップおよび前記解析ステップでは、前記円形形状における前記内側の光路長に比べて前記外側の光路長が大きい場合に、当該細胞が品質の良い細胞と判断されても良い。
　この発明によれば、品質の良い細胞を判断するための具体的な手法が提供される。この発明による判断手法は、発明者による以下の考察に基づくものである。すなわち、発明者による実験結果から、品質の良い細胞のみにおいて細胞核の形状が円形形状であり、かつ細胞核の内側の光路長が細胞核の外側の光路長に比べて小さいことが見出された。一方、品質の良くない細胞は細胞核の形状が円形形状でないか、または円形形状であっても細胞核の内側の光路長が細胞核の外側の光路長に比べて、同じかまたは大きいことが見出された。よって、細胞核の内側と外側の光路長の違いを比較し、内側の光路長に比べて外側の光路長が大きい場合に、当該細胞を品質の良い細胞と判断することができる。
　また、本発明において、前記解析ステップでは、前記品質の良い細胞と判断された細胞の単位面積当たりの数が閾値以上である場合に、当該細胞コロニーが品質の良い細胞コロニーと判断されても良い。
　この発明によれば、品質の良い細胞コロニーとそうでない細胞コロニーを見分けるための具体的な手法が提供される。これは、細胞コロニー単位の品質管理という産業応用の目的に合致している。細胞一つ一つを評価していたのでは、スループットが上がらないからである。また、本手法は細胞コロニーの特性に基づいた手法である。すなわち、細胞コロニーは細胞が分裂増殖して形成されるので、品質の良い細胞はその周りにも品質の良い細胞が多く存在し、品質の良くない細胞の周りには品質の良くない細胞が多く存在する傾向がある。この見地からすると、品質の良い細胞と判断された細胞の単位面積当たりの数は、品質の良い細胞コロニーとそうでない細胞コロニーを区別するための判断基準として適切なものといえる。
　また、本発明において、前記細胞解析装置の表示手段が、前記品質が良いと判断された細胞コロニーに含まれる領域を特定し表示する表示ステップを更に備えても良い。
　この発明によれば、本発明の利用者が本発明による細胞コロニーの解析結果を容易に確認できるようにするための具体的な手法が提供される。
　また、本発明において、前記光路長画像は、定量光路長画像であっても良い。
　この発明によれば、定量光路長画像によって、円形形状における内側の光路長と外側の光路長との比較を容易に行うことができる。
　また、本発明において、前記円形形状は真円形形状であっても良い。
　この発明によれば、品質の良い細胞の一次的な判断基準が提供される。細胞解析の精度や目的等に応じ、円形形状が真円形形状であることを当該判断基準として採用することができる。
　また、本発明において、前記真円形形状は、所定範囲の直径を有する真円形形状であっても良い。
　この発明によれば、品質の良い細胞の一次的な判断基準が提供される。細胞解析の精度や目的等に応じ、円形形状が所定範囲の直径を有する真円形形状であることを当該判断基準として採用することができる。
　また、本発明において、前記円形形状は楕円形形状であっても良い。
　この発明によれば、品質の良い細胞の一次的な判断基準が提供される。細胞解析の精度や目的等に応じ、円形形状が楕円形形状であることを当該判断基準として採用することができる。
　また、本発明において、前記細胞は幹細胞であっても良い。
　この発明はｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞をはじめとする幹細胞の産業応用に利用することができる。例えば幹細胞の培養装置等にこの発明を応用すれば、培養している幹細胞や幹細胞コロニーの判定を定量的で且つ自動化された手法により行うことができ、更に精度高く行うことができるため、省力化と大量生産が可能になる。
　本発明によれば、定量的で且つ自動化が可能で、更に精度高く細胞コロニーの状態を判別することが可能な細胞解析方法、細胞解析装置、および細胞解析プログラムを提供することができる。
品質の良い幹細胞と、品質の良くない幹細胞の例を示す定量位相顕微鏡の画像である。 品質の良い幹細胞の特性を説明するための図である。 品質の良くない幹細胞の特性を説明するための図である。 （Ａ）は細胞核の光路長を測定した結果を示す図であり、（Ｂ）は細胞質（細胞核の外側）の光路長を測定した結果を示す図である。 図４の光路長の測定結果に基づき、細胞核と細胞質の光路長の比（図中（Ａ））、および幹細胞の総数を１００にした場合の光路長の平均比率（図中（Ｂ））を示す図である。 細胞解析システム１の構成図である。 細胞解析装置Ｄの機能的構成を示す概要図である。 細胞解析装置Ｄのハードウェア的構成を示す概要図である。 細胞解析システム１により行われる動作を示すフローチャートである。 図９のステップＳ５の方法により、品質の良いと判断された細胞コロニーを示す図である。 図９のステップＳ５の方法により、品質の良くないと判断された細胞コロニーを示す図である。 図９のステップＳ５の方法により、品質の良いと判断された部分と、品質の良くないと判断された部分とが混在する場合の細胞コロニーを示す図である。 表示部Ｄ５による表示の一例を示す図である。 本実施形態における判断手法により、目視での結果と同様の結果が得られることを示すための図である。 表示部Ｄ５による動作を詳細に説明するための図である。
　以下、添付図面を参照して本発明にかかる細胞解析方法、細胞解析装置、および細胞解析プログラムの好適な実施形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
　（基本概念）
　まず、本発明の基本概念を先に説明する。図１は、品質の良い幹細胞と（図１の（Ａ））、品質の良くない幹細胞（図１の（Ｂ））の例を示す定量位相顕微鏡の画像であり、本発明は、品質の良い細胞と品質の良くない細胞とを、定量的で且つ自動化が可能で、更に精度高く判別し、それによって細胞コロニーの状態を判別する方法、装置、およびプログラムを提供することを目的とする。
　図２は、図１の（Ａ）で示したような品質の良い幹細胞の特性を説明するための図である。図２の（Ａ）において、実線は当該幹細胞の輪郭を示し、破線は当該幹細胞の核の輪郭を示し、一点鎖線はラインプロファイルを示す。図２の（Ａ）に示すように、品質の良い幹細胞は、その核が真円をなしている傾向が強い（破線参照）。図２の（Ｂ）は、図２の（Ａ）にて一点鎖線で示したラインプロファイルを横軸に対応させ、光路長を示した図である。図２の（Ｂ）に示すように、品質の良い幹細胞は、細胞核の内側の光路長が外側のそれよりも小さいことが分かる。なお、本実施形態における「光路長」は、「位相差」または「光学厚さ」としても理解できるが、説明の便宜のため、以下では用語を「光路長」として統一して説明する。
　図３は、図１の（Ｂ）で示したような品質の良くない幹細胞の特性を説明するための図である。図３の（Ａ）において、実線は当該幹細胞の輪郭を示し、破線は当該幹細胞の核の輪郭を示し、一点鎖線はラインプロファイルを示す。図３の（Ａ）に示すように、品質の良くない幹細胞においても、その核が真円をなしている場合がある（破線参照）。図３の（Ｂ）は、図３の（Ａ）にて一点鎖線で示したラインプロファイルを横軸に対応させ、光路長を示した図である。図３の（Ｂ）に示すように、品質の良くない幹細胞は、たとえ細胞核が真円をなしている場合であっても、細胞核の内側の光路長が外側のそれよりも小さくないことが分かる。
　図２および図３で分かるように、品質の良い幹細胞および品質の良くない幹細胞における決定的な違いは、細胞核の内側および外側における光路長にあり、細胞核が真円か否かではない。なお、図示まではしないが、細胞核が真円でなければ、その幹細胞は品質の良くない幹細胞である傾向が強い。したがって、本発明では、細胞核が真円か否か、および細胞核の内側および外側における光路長を比較することにより、発明の目的である、品質の良い細胞と品質の良くない細胞とを、定量的で且つ自動化が可能で、更に精度高く判別し、それによって細胞コロニーの状態を判別する方法、装置、およびプログラムを提供することを実現する。
　図４および図５は、品質の良い幹細胞および品質の良くない幹細胞における決定的な違いが、細胞核の内側および外側における光路長にあることを更に説明するための図である。図４の（Ａ）は細胞核の光路長を測定した結果を示しており、グラフＡが品質の良い幹細胞の細胞核の光路長を示し、グラフＢが品質の良くない幹細胞の細胞核の光路長を示す。また、図４の（Ｂ）は細胞質（細胞核の外側）の光路長を測定した結果を示しており、グラフＡが品質の良い幹細胞の細胞質の光路長を示し、グラフＢが品質の良くない幹細胞の細胞質の光路長を示す。また、図５の（Ａ）および（Ｂ）は、図４の光路長の測定結果に基づき、細胞核と細胞質の光路長の比（図５の（Ａ））、および幹細胞の総数を１００にした場合の光路長の平均比率（図５の（Ｂ））を示すものである。図５の（Ａ）において、グラフＡが品質の良い幹細胞の場合を示し、グラフＢが品質の良くない幹細胞の場合を示す。また、図５の（Ｂ）において、左側の棒（符号Ａ）が品質の良い幹細胞の場合を示し、右側の棒（符号Ｂ）が品質の良くない幹細胞の場合を示す。これらの図に示されるように、品質の良い幹細胞と品質の良くない幹細胞との間では、光路長において明確な差異があり、これに基づけば、品質の良い幹細胞と品質の良くない幹細胞とを、定量的で且つ自動化が可能で、更に精度高く判別することができる。
　（細胞解析システム１の構成）
　引き続き、本発明の実施形態に係る細胞解析システム１の構成について説明する。細胞解析システム１は、多数の細胞から構成される細胞コロニーの光路長画像を用いて、当該細胞コロニーの解析を行うものである。図６は細胞解析システム１の構成図であり、図７は細胞解析装置Ｄの機能的構成を示す概要図であり、図８は細胞解析装置Ｄのハードウェア的構成を示す概要図である。
　図６に示すように、細胞解析システム１は、主に、定量位相顕微鏡Ａと細胞解析装置Ｄにより構成される。定量位相顕微鏡Ａは、測定試料Ｓを支持する試料台Ａ４、対物レンズＡ５、反射部Ａ６、光干渉部Ａ７を備える顕微鏡本体Ａ１を具備する。この顕微鏡本体Ａ１の光の入射側には、図示しない光出射部からの照射光Ｈ０（レーザ光）を導く光ファイバＢの出射側端面Ｂ１に臨ませたレンズＡ２と、このレンズＡ２を通過する光Ｈ０を反射する反射部Ａ３とが具備されている。一方、光の出射側には、光干渉部Ａ７で生成される干渉縞（図示せず、以下同様）を撮像するＣＣＤカメラ等の撮像装置Ｃと、この撮像装置Ｃに接続され、当該干渉縞を解析等するための細胞解析装置Ｄとが具備されている。
　［定量位相顕微鏡Ａの構成］
　試料台Ａ４は、例えば、中央に光を透過可能な光透過部Ａ４１を備えるとともに、上向き面に測定試料Ｓを載置可能な載置面Ａ４２を有する略板状のものである。載置面Ａ４２に測定試料Ｓを載置した状態で上方から光を照射することにより、測定試料Ｓを透過した光（被測定光Ｈ１）が光透過部Ａ４１を透過して対物レンズＡ５に向かうようにしている。なお、光透過部Ａ４１は、例えばガラス等の光を透過可能な部材より形成したものであってもよいし、単なる孔であってもよい。対物レンズＡ５は、例えば、操作部（図示しない）の操作に基づいて、入射してくる被測定光Ｈ１をその操作に係る所定の倍率で拡大させて平行光（被測定光Ｈ１）として出射するものである。反射部Ａ６は、例えば全反射型のミラーであって、対物レンズＡ５からの被測定光Ｈ１を全反射させて光干渉部Ａ７に導入できるようにしている。光干渉部Ａ７は、被測定光Ｈ１を、２つの光Ｈ１ａ、Ｈ１ｂに分離する光分離素子Ａ７１と、この光分離素子Ａ７１が出射する被測定光Ｈ１（Ｈ１ａ、Ｈ１ｂ）を収束光Ｈ２（Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ）に変換する集光レンズＡ７２と、収束光Ｈ２の収束位置に配した空間フィルタＡ７３と、空間フィルタＡ７３を透過した物体光Ｈ３と参照光Ｈ４とを重ね合わせて干渉縞を生成する合成レンズＡ７５とを具備するものである。ここで、光分離素子Ａ７１は、回折格子を用いて構成したものである。さらには、光分離素子Ａ７１は、偏光方向が互いに異なる２つの光に分離する偏光分離素子であっても良い。その場合、光干渉部Ａ７は、被測定光Ｈ１を、偏光方向が互いに異なる２つの光Ｈ１ａ、Ｈ１ｂに分離する光分離素子Ａ７１と、収束光Ｈ２（Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ）に変換する集光レンズＡ７２と、収束光Ｈ２の収束位置に配した空間フィルタＡ７３と、空間フィルタＡ７３を透過した物体光Ｈ３と参照光Ｈ４と、この空間フィルタＡ７３の出射側に配した半波長板Ａ７４と、この半波長板Ａ７４により偏光方向を揃えられた物体光Ｈ３と参照光Ｈ４とを重ね合わせて干渉縞を生成する合成レンズＡ７５と、を具備するものである。もしくは、空間フィルタＡ７３の出射側に配した半波長板Ａ７４に代えて偏光子を配して物体光Ｈ３と参照光Ｈ４の偏光方向を揃えても良い。なお、以上で説明した定量位相顕微鏡Ａの構成は一つの例に過ぎず、本発明はこの構成例に限定されるものではない。
　［細胞解析装置Ｄの構成］
　引き続き、細胞解析装置Ｄの構成について説明する。図８に示すように、細胞解析装置Ｄは、物理的には、ＣＰＵ　Ｄ１１、ＲＯＭ　Ｄ１２及びＲＡＭ　Ｄ１３等の主記憶装置、キーボード及びマウス等の入力デバイスＤ１４、ディスプレイ等の出力デバイスＤ１５、例えば撮像装置Ｃ等の他の装置との間でデータの送受信を行うためのネットワークカード等の通信モジュールＤ１６、ハードディスク等の補助記憶装置Ｄ１７などを含む通常のコンピュータシステムとして構成される。後述する細胞解析装置Ｄの各機能は、ＣＰＵ　Ｄ１１、ＲＯＭ　Ｄ１２、ＲＡＭ　Ｄ１３等のハードウェア上に所定のコンピュータソフトウェアを読み込ませることにより、ＣＰＵ　Ｄ１１の制御の元で入力デバイスＤ１４、出力デバイスＤ１５、通信モジュールＤ１６を動作させると共に、主記憶装置Ｄ１２，Ｄ１３や補助記憶装置Ｄ１７におけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで実現される。
　図７に示すように、細胞解析装置Ｄは、機能的構成要素として、取得部Ｄ１（特許請求の範囲における「取得手段」および「取得ステップ」に相当）、抽出部Ｄ２（特許請求の範囲における「抽出手段」および「抽出ステップ」に相当）、比較部Ｄ３（特許請求の範囲における「比較手段」および「比較ステップ」に相当）、解析部Ｄ４（特許請求の範囲における「解析手段」および「解析ステップ」に相当）、および表示部Ｄ５（特許請求の範囲における「表示手段」および「表示ステップ」に相当）を備える。
　取得部Ｄ１は、細胞コロニーの光路長画像を撮像装置Ｃより取得するものである。抽出部Ｄ２は、当該取得した光路長画像中において、細胞の細胞核に対応する円形形状を抽出するものである。比較部Ｄ３は、当該抽出した円形形状に対し、その内側の光路長および外側の光路長を比較するものである。解析部Ｄ４は、当該比較結果に基づき、細胞および細胞コロニーの解析を行うものである。比較部Ｄ３および解析部Ｄ４は、円形形状における内側の光路長に比べて外側の光路長が大きい場合に、当該細胞が品質の良い細胞と判断する。解析部Ｄ４は、品質の良い細胞と判断された細胞の単位面積当たりの数が閾値以上である場合に、当該細胞コロニーが品質の良い細胞コロニーと判断する。表示部Ｄ５は、品質が良いと判断された細胞コロニーに含まれる領域を特定し表示するものである。
　（細胞解析システム１の動作）
　引き続き、以上のように構成された細胞解析システム１により行われる動作について詳細に説明する。図９は、細胞解析システム１により行われる動作を示すフローチャートである。
　［画像取得手順：ステップＳ１］
　最初に、取得部Ｄ１が細胞コロニーの光路長画像を取得する。細胞コロニーの光路長画像は、定量光路長画像であり、定量位相顕微鏡Ａの出力を撮像装置Ｃが撮像し、これを細胞解析装置Ｄの取得部Ｄ１に出力することで得られる。なお、本実施形態では、幹細胞を細胞の一例として挙げて以下の動作説明を行うものとする。
　ステップＳ１にて取得された定量光路長画像には、以下の５つの種類のものが含まれている。なお、下記の「幹細胞でないもの」とは、例えば「死んだ幹細胞」を指す。
　（ａ）良い幹細胞
　（ｂ）良くない幹細胞のうち、核が円形形状のもの
　（ｃ）良くない幹細胞のうち、核が異形のもの
　（ｄ）幹細胞でないもののうち、円形形状のもの
　（ｅ）幹細胞でないもののうち、異形のもの
　［円形形状抽出手順：ステップＳ２］
　次に、抽出部Ｄ２が、当該取得した定量光路長画像中において、細胞の細胞核に対応する円形形状を抽出する。抽出部Ｄ２は、定量光路長画像から幹細胞コロニーの領域をまず特定し、その後に各幹細胞の細胞核に対応する円形形状の抽出を行っても良い。円形形状の抽出の際には、前処理として輪郭抽出をまず行い、その後に当該輪郭画像に対してハフ変換で投票率の高い部分を求めることにより、円形形状の抽出を行うようにしても良い。ハフ変換は効率よく円形形状を抽出するに適した手法であるが、これに限らず、例えば曲率等に基づいて円形形状を抽出するようにしても良い。抽出部Ｄ２が抽出する円形形状は真円形形状であっても良く、当該真円形形状は所定範囲（例えば１１～１４ｕｍ程度）の直径を有する真円形形状であっても良く、または楕円形形状であっても良い。
　ステップＳ２にて円形形状を抽出することにより、以下の３つの種類のものが残るようになる。
　（ａ）良い幹細胞
　（ｂ）良くない幹細胞のうち、核が円形形状のもの
　（ｄ）幹細胞でないもののうち、円形形状のもの
　［光路長比較抽出手順：ステップＳ３］
　次に、比較部Ｄ３が、ステップＳ２にて当該抽出した円形形状に対し、その内側の光路長および外側の光路長を比較する。比較部Ｄ３は、光路長比較の結果、円形形状の内側領域（細胞核を構成する部分）の光路長の値に比べて、円形形状の外側領域（細胞質を構成する部分）の光路長の値が大きいものを抽出する。ここで、比較部Ｄ３は、円形形状の内側の光路長の平均値に比べて、円形形状の外側の光路長の平均値が所定の閾値以上であることを判断基準として、抽出を行っても良い。または、比較部Ｄ３は、円形形状に直交する水平垂直のプロファイルの勾配が、円形形状の外側から内側に向かってマイナス方向になることを判断基準として、抽出を行っても良い。
　［解析手順その１、細胞単位での解析：ステップＳ４］
　次に、解析部Ｄ４が、ステップＳ３にて当該抽出したものに対し、細胞単位での解析を行う。解析部Ｄ４は、ステップＳ３にて抽出したもの、つまりステップＳ２にて抽出した円形形状における内側の光路長に比べて外側の光路長が大きい場合に、当該細胞が品質の良い細胞と判断する。なぜなら、ステップＳ３における抽出にて、上記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）のうち、（ａ）のみが残るからである。
　上記（ｂ）の「良くない幹細胞のうち、核が円形形状のもの」は、円形形状の内外の輝度差が合致しないので除外される。その理由を以下に説明する。すなわち、「光路長」は、下記の式（１）に示すように、「屈折率」に「物理的厚さ」をかけたものであって、定量光路長画像では、光路長の違いが定量性をもった明暗の画像として表される。
　　光路長＝屈折率×物理的厚さ…（１）
　ここで、細胞核（細胞核の内側）の屈折率は、下記の式（２）に示すように、一般に、細胞質（細胞核の外側）の屈折率よりも低いことが知られている（例えば下記の参考文献１を参照）。
　　細胞核の内側の屈折率＜細胞核の外側の屈折率…（２）
　＜参考文献１＞
　Syntheticaperture
tomographic phase microscopy for 3D imaging of live cells intranslational
motion, Niyom Lue, Wonshik Choi, Gabriel Popescu, Kamran
Badizadegan,Ramachandra R. Dasari, and Michael S. Feld, Optics Express, Vol.
16, Issue 20,pp. 16240 - 16246, 2008
　また、物理的厚さに関しては、品質の良い幹細胞は、下記の式（３）に示すように、細胞核の内側の物理的厚さと、細胞核の外側の物理的厚さがほぼ同じである。なぜなら、品質の良い幹細胞は、隣接する幹細胞間の距離が近いので、細胞核間の細胞質が厚くなるからである。
　　（品質の良い幹細胞）
　　細胞核の内側の物理的厚さ≒細胞核の外側の物理的厚さ…（３）
　一方で、品質の良くない幹細胞は、下記の式（４）に示すように、細胞核の内側の物理的厚さが、細胞核の外側の物理的厚さに比べて、遥かに厚い。なぜなら、品質の良くない幹細胞は、隣接する幹細胞の距離が遠いので、細胞核間の細胞質が薄くなるからである。
　　（品質の良くない幹細胞）
　　細胞核の内側の物理的厚さ＞＞細胞核の外側の物理的厚さ…（４）
　以上より、品質の良い幹細胞に関しては、上記式（２）と（３）の関係を式（１）において考慮すると、光路長について下記の式（５）が成立する。
　　（品質の良い幹細胞）
　　細胞核の内側の光路長＜細胞核の外側の光路長…（５）
　一方、品質の良くない幹細胞に関しては、上記式（２）と（４）の関係を式（１）において考慮すると、光路長について下記の式（６）が成立する。
　　（品質の良くない幹細胞）
　　細胞核の内側の光路長＞細胞核の外側の光路長…（６）
　そして、これらの光路長の違いが定量光路長画像では定量性をもった明暗情報（輝度）として表されることから、定量光路長画像において細胞核の内側の輝度値が低く、細胞核の外側の輝度値が高く見える場合、つまり核の内側が暗く見える場合には、その幹細胞は品質の良い幹細胞であることがいえる。一方で、細胞核の内側の輝度値が高く、且つ細胞核の外側の輝度値が低く見える場合、つまり核の内側が暗く見えない場合には、その幹細胞は品質の良くない幹細胞であることがいえる。
　以上の理由により、比較部Ｄ３が、ステップＳ３にて光路長比較の結果、円形形状の内側領域（細胞核を構成する部分）の光路長の値に比べて、円形形状の外側領域（細胞質を構成する部分）の光路長の値が大きいものを抽出した場合には、当該抽出されたものは品質の良い幹細胞であるといえる。つまり、当該抽出により、（ｂ）の「良くない幹細胞のうち、核が円形形状のもの」は除外されるといえる。
　また、ステップＳ３における抽出にて、（ｄ）の「幹細胞でないもののうち、円形形状のもの」も、円形形状の内外の輝度差が合致しないので除外される。その理由を以下に説明する。すなわち、培養環境下で幹細胞以外の粒子として考えられるのは主に死細胞であり、死細胞の屈折率は周りの溶液よりも高い。したがって、死細胞の光路長は周りよりも高い値となり、定量光路長画像において円形形状の内側の輝度値が高く、且つ円形形状の外側の輝度値が低い、つまり円形形状の内側が周りよりも明るく見えるため、ステップＳ３における抽出にて除外されることとなる。
　なお、以上の方法により唯一取り除けないのは幹細胞間の隙間が偶然にも円形形状になっている場合である。隙間なので屈折率が周りよりも低くなり、（ａ）の「良い幹細胞」と見分けにくくなる。しかし、これらは頻度が少なく、更に、下記のステップＳ５における判断において「品質の良い幹細胞と判断された幹細胞の単位面積当たりの数」を用いて幹細胞コロニーの解析をする場合には、特に問題とはならない。
　［解析手順その２、細胞コロニー単位での解析：ステップＳ５］
　以上のステップＳ４における手法により、品質の良い幹細胞と品質の良くない幹細胞を判断した後に、解析部Ｄ４は、当該品質の良い幹細胞と判断された幹細胞の単位面積当たりの数が閾値以上である場合に、当該細胞コロニーが品質の良い幹細胞コロニーと判断する。具体的には、例えば品質の良い幹細胞と判断された幹細胞の密度（個／mm2）が閾値以上である場合に、当該細胞コロニーが品質の良い幹細胞コロニーと判断する。
　図１０～図１２は、それぞれの（Ａ）および（Ｂ）ともに、上記ステップＳ４にて説明した方法により抽出した（ａ）の「良い幹細胞」を示す図である。各図では、丸くて白い実線により、上記ステップＳ４にて当該抽出した「良い幹細胞」を示している。図１０は、上記ステップＳ５の方法により、例えば品質の良い細胞と判断された細胞の密度［個／mm2］が閾値以上であることから、品質の良い細胞コロニーと判断された幹細胞コロニーにおける「良い幹細胞」を示す。図１１は、上記ステップＳ５の方法により、品質の良くない細胞コロニーと判断された幹細胞コロニーにおける「良い幹細胞」を示す。図１２は、上記ステップＳ５の方法により、品質の良いと判断された部分と、品質の良くないと判断された部分とが混在する場合の「良い幹細胞」を示す。図１２の（Ａ）では、上半分が品質の良くないと判断された部分に該当し、下半分が品質の良いと判断された部分に該当する。図１２の（Ｂ）では、上半分が品質の良いと判断された部分に該当し、下半分が品質の良くないと判断された部分に該当する。
　以上のステップＳ２～Ｓ４の手順は、全ての円形形状を抽出してから、それぞれの円形形状に対し、光路長を比較することにより、細胞単位での解析を行うようにしても良い。または、１つの円形形状を抽出し、その円形形状に対し、光路長を比較し、これらの手順を繰り返すことにより、細胞単位での解析を行うようにしても良い。
　［表示手順：ステップＳ６］
　次に、表示部Ｄ５が、上記ステップＳ５にて品質の良いと判断された幹細胞コロニーに含まれる領域を特定し表示する。図１３は、表示部Ｄ５による表示の一例を示す。図１３の例では、表示部Ｄ５が擬似カラーマッピングによる表示を行っている。図１３は、品質の良い幹細胞と判断された情報量（例えばステップＳ３およびＳ４で抽出された真円形状）と、それ以外を濃淡で区別つけて表示している。符号Ａで表示されている濃い部分には、品質の良い幹細胞と判断された情報量が存在する。一方、符号Ｂで表示されている淡い部分には、品質の良くない幹細胞と判断された情報量が存在する。なお、符号Ｃで表示されている部分には何も存在しない。発明者による実際の実施態様では図１３がカラーで表示されるが、出願手続き上、願書に添付する図１３は白黒の図である点に注意されたい。なお、本出願人は図１３の実際のカラーの図面を例えば上申書にて別途提出することとする。以上のような図１３により、幹細胞コロニーのどの領域に品質の良い状態の幹細胞が存在しているかを示す２次元分布を一目で把握することができる。すなわち、図１３の左側は品質の良くない状態の幹細胞が多く存在しており（符号Ｂ）、品質の良くない領域と判断される部分である。図１３の右側は品質の良い状態の幹細胞が多く存在しており（符号Ａ）、品質の良い領域と判断される部分である。
　図１４は、品質の良い幹細胞と判断された情報量（例えばステップＳ３およびＳ４で抽出された真円形状）の密度を縦軸に表示し、観察者の目視にて幹細胞の品質を判断した結果を横軸に沿って表示している。図１４の左側には目視にて品質が良いと判断された検体（検体数＝８）における情報量が点で示されており（Ｇｏｏｄ）、右側には目視にて品質が悪いと判断された検体（検体数＝２９）における情報量が点で示されている（Ｎｏ　Ｇｏｏｄ）。図１４に示されるように、密度が高い部分（例えば密度２００［個／mm2］以上）を品質の良い領域と判断するという解析部Ｄ４の判断手法は、目視にて品質の良いと判断した結果と一致している。つまり、本実施形態における判断手法により、目視での結果と同様の結果が得られたといえる。
　以下、表示部Ｄ５による動作を更に詳細に説明する。以下に説明する表示部Ｄ５の動作は、上記ステップＳ２～Ｓ４を経て（ａ）の「良い幹細胞」が抽出され、当該「良い幹細胞」を示すものが例えば図１０～図１２の丸くて白い実線により示された場合に、これらの密度を用いて品質の良い幹細胞コロニー（幹細胞コロニーの一部の領域を含む。）を表示する方法に関するものである。以下では、図１５を参照しながら説明する。なお、以下の説明では、図１０～図１２にて丸くて白い実線により示された部分のことを「真円オブジェクト」とする。
　最初に、図１０～図１２のような真円オブジェクトが表示された画像を入力する。そして、当該入力した画像を元に、真円オブジェクトの中心座標を表示した画像を作成する。図１５の（Ａ）は、真円オブジェクトの中心座標が表示された画像を示す。なお、真円オブジェクトの中心座標の表示は、例えば２値化等により行うことができる。
　次に、図１５の（Ａ）に示した画像に対して適当な大きさの例えば矩形のマスクを用意し、マスク内に存在する真円オブジェクトの数をマスクの中心座標（画素）に代入する。この動作をマスクを移動させながら、全画素について行う。なお、マスクのサイズに特に制限はないが、マスクのサイズが小さ過ぎると細胞間の隙間を埋めることができなくなる。したがって、細胞の存在する細胞間距離、ここでは細胞核と細胞核との間の距離に応じたマスクサイズを適宜設定する必要がある。例えば、細胞間距離が１５μｍ程度であれば、直径１５μｍ以上のマスクを使用するようにしても良い。なお、図１５の（Ｆ）はマスクのサイズが小さ過ぎてうまくいかなかった例を示す。なお、中心座標からの距離を等しく扱うという点では、矩形のマスクは４５度の対角方向に距離が長いマスクとなるため、矩形のマスクよりも円形のマスクの方が好ましい。
　次に、上記によりマスクの中心座標に代入された当該マスク内に存在する真円オブジェクトの数に基づき、真円オブジェクトの密度に応じて値が高くなるような分布を持つ真円オブジェクトの密度画像を作成する。真円オブジェクトの密度画像では、真円オブジェクトの密度に応じて画素の輝度値を高くすることにより、真円オブジェクトの密度の低い部分を除くことができる。図１５の（Ｂ）は、以上の方法により作成した真円オブジェクトの密度画像を示しており、真円オブジェクトの密度の高い部分の輝度値が高く、白く表示されている。
　次に、図１５の（Ｂ）に示した真円オブジェクトの密度画像に対して、適当な閾値を用いて領域の輪郭線を求める。図１５の（Ｃ）は、求めた輪郭線が破線で表示されている。なお、求めた輪郭線により特定される領域は、図１５の（Ｄ）に示すように、真円オブジェクトの密度の高い部分と一致する。
　次に、図１５の（Ｃ）および（Ｄ）における輪郭線で特定される領域を幹細胞コロニーの画像に当てはめる。これにより、幹細胞コロニーを特定する領域内において、品質の良い領域を特定することができ、それを表示することができる。図１５の（Ｅ）はその様子が示されており、破線で囲まれて特定される領域が当該幹細胞コロニーにおいて品質の良い領域である。なお、図１５の（Ｅ）に示す画像から例えば位置座標等の情報を取り出し、細胞のマニピュレーション（切り出し、回収）に利用することもできる。
　なお、以上の動作において、真円オブジェクトの密度に応じて真円オブジェクトの密度画像の画素の輝度値を高くする際（図１５の（Ｂ）参照）、および真円オブジェクトの密度画像に対して、適当な閾値を用いて領域の輪郭線を求める際（図１５の（Ｃ）および（Ｄ）参照）には、真円オブジェクトの密度が２００［個数／ｍｍ２］以上の場合に目視でも品質の良い幹細胞と判定されたことを目安として、輝度値を調整したり、輪郭線を求めたりすることができる。なお、真円オブジェクトの密度が２００［個数／ｍｍ２］以上ということは、上述した図１４での結果とも合致している。
　以上で説明した表示部Ｄ５の動作は以下のような考え方に基づく。すなわち、細胞は増殖しながら細胞コロニーを形成するので、同じ性質をもった細胞が隣り合って集団を形成する傾向が強い。つまり、良い品質の細胞の周りには良い品質の細胞がたくさん存在することになり、検出した真円オブジェトがある程度の密度をもって存在していれば、その領域は良い細胞から形成されていると判断できることとなる。このような考え方により、たとえ個々の幹細胞に対する判定が少し間違ったとしても、細胞コロニー全体としては正しい判定を行うことができる。
　（細胞解析プログラムとしての構成例）
　本発明は、細胞解析プログラムとして構成されることもでき、以上の細胞解析装置Ｄに関する説明は、コンピュータを細胞解析装置Ｄとして動作させる細胞解析プログラムに関する説明としても捉えることができる。重複する説明は省略するが、細胞解析プログラムは、コンピュータを、以上で説明した取得部Ｄ１、抽出部Ｄ２、比較部Ｄ３、解析部Ｄ４、および表示部Ｄ５として機能させる。細胞解析プログラムは、例えば、記録媒体に格納されて提供される。なお、記録媒体としては、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ等の記録媒体、ＲＯＭ等の記録媒体、または半導体メモリ等が例示される。
　（本実施形態の作用及び効果）
　続いて、本実施形態にかかる細胞解析システム１の作用及び効果について説明する。本実施形態の細胞解析システム１によれば、幹細胞コロニーの解析を定量的で且つ自動化された手法により精度高く行うことができる。すなわち、幹細胞の核に対応する円形形状を抽出する手順と、当該円形形状に対し、その内側の光路長および外側の光路長を比較する手順を両方とも備えることにより、幹細胞コロニーの解析を定量的で且つ自動化された手法により精度高く行うことができる。幹細胞の核の内側および外側の光路長の違い、つまり幹細胞の核における光路長と幹細胞の核の周りの細胞質における光路長との違いに着目したことで、品質の良い幹細胞の特有の情報を幹細胞コロニーの解析に利用することができ、これにより定量的で且つ自動化された手法による幹細胞コロニーの解析が実現できるからである。更に、形が丸いという形状の情報のみならず、光路長の定量的な違いに着眼したことで、円形形状の抽出だけでは適切な解析が不可能だったことを補うことができ、これにより精度の高い解析が実現できるからである。
　なお、上述の特許文献３では、幹細胞の内側と幹細胞の外側の明るさを比較するので、幹細胞の輪郭を正確に抽出する必要があるが、幹細胞コロニーを形成している幹細胞が隣接している場合は、幹細胞間の境界ははっきりしておらず、幹細胞の輪郭が正確に抽出できるとは限らない。一方で、本実施形態では、幹細胞の核の内外の光路長を比較している点で相違する。幹細胞コロニーを形成していても、良い状態の幹細胞は、核と細胞質の屈折率差によって、幹細胞の核の境界がはっきり区別できるので、幹細胞の核の内側と外側が正確に区別できる。したがって、本実施形態によれば、精度の高い幹細胞コロニーの解析を実現できる。
　以上のように、幹細胞コロニーの状態を定量的で且つ自動化された手法により精度高く行うことによって、これまで検査者の経験により評価されていたものが、だれが行っても客観的に比較可能な数値となり、検査者の主観、体調、検査者間のばらつきといったあいまいな要素を排除できる。これにより、検査者の技能によらない一定の判断基準に基づいた均一な幹細胞コロニーの解析を行うことが可能になる。また、数多くの幹細胞および幹細胞コロニーを肉眼で観察して判断していた検査者の肉体的苦痛を緩和することができる。また、例えば段階化された数値を適用することによって、状態の経時変化を把握することができ、この場合には、例えば培養開始後、早期に状態が悪くなる予兆等を判断することができる。そのため、状態が悪くなる前にリカバリできる機会が増え、工程全体での良品率が向上するとともに、無駄に培養資材を浪費することが避けられ、生産コストの低減につながる。さらには、同じ判断基準を別の生産者の工程に容易に持ち込むことができ、異なる生産者間同士で共通の品質の幹細胞を提供することが可能になる。
　また、本実施形態によれば、品質の良い幹細胞を判断するための具体的な手法が提供される。本実施形態による判断手法は、発明者による以下の考察に基づくものである。すなわち、発明者による実験結果から、品質の良い幹細胞のみにおいて幹細胞の核の形状が円形形状であり、かつ核の内側の光路長が核の外側の光路長に比べて小さいことが見出された。一方、品質の良くない幹細胞は核の形状が円形形状でないか、または円形形状であっても核の内側の光路長が核の外側の光路長に比べて、同じかまたは大きいことが見出された。よって、幹細胞の核の内側と外側の光路長の違いを比較し、内側の光路長に比べて外側の光路長が大きい場合に、当該幹細胞を品質の良い幹細胞と判断することができる。
　また、本実施形態によれば、品質の良い幹細胞コロニーとそうでない幹細胞コロニーを見分けるための具体的な手法が提供される。これは、幹細胞コロニー単位の品質管理という産業応用の目的に合致している。幹細胞一つ一つを評価していたのでは、スループットが上がらないからである。また、本手法は幹細胞コロニーの特性に基づいた手法である。すなわち、幹細胞コロニーは幹細胞が分裂増殖して形成されるので、品質の良い幹細胞はその周りにも品質の良い幹細胞が多く存在し、品質の良くない幹細胞の周りには品質の良くない幹細胞が多く存在する傾向がある。この見地からすると、品質の良い幹細胞と判断された幹細胞の単位面積当たりの数は、品質の良い幹細胞コロニーとそうでない幹細胞コロニーを区別するための判断基準として適切なものといえる。
　また、本実施形態によれば、利用者が本実施形態による幹細胞コロニーの解析結果を容易に確認できるようにするための具体的な手法が提供される。
　また、本実施形態によれば、定量光路長画像によって、円形形状における内側の光路長と外側の光路長との比較を容易に行うことができる。
　また、本実施形態によれば、品質の良い幹細胞の一次的な判断基準が提供される。例えば、幹細胞解析の精度や目的等に応じ、円形形状が真円形形状であることを当該判断基準として採用することができる。更に、円形形状が所定範囲の直径を有する真円形形状であることを当該判断基準として採用することができる。または、円形形状が楕円形形状であることを当該判断基準として採用することができる。
　本実施形態はｉＰＳ幹細胞、ＥＳ幹細胞をはじめとする幹細胞の産業応用に利用することができる。例えば幹細胞の培養装置等に本実施形態を応用すれば、培養している幹細胞や幹細胞コロニーの判定を定量的で且つ自動化された手法により行うことができ、更に精度高く行うことができるため、省力化と大量生産が可能になる。
　以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明が上記実施形態に限定されないことは言うまでもない。
　例えば、上記実施形態においては、細胞や細胞コロニーの光路長画像を得るために、細胞解析システム１が定量位相顕微鏡Ａを備える構成を例示して説明したが、本発明はこれに限られることなく、例えば位相差コントラスト顕微鏡を用いて、細胞や細胞コロニーの光路長画像を得るようにしても良い。この場合は、装置が安価となり、コスト節約につながる。
１…細胞解析システム、Ａ…定量位相顕微鏡、Ａ１…顕微鏡本体、Ｂ…光ファイバ、Ｃ…撮像装置、Ｄ…細胞解析装置、Ｄ１…取得部、Ｄ２…抽出部、Ｄ３…比較部、Ｄ４…解析部、Ｄ５…表示部。
　本発明は、定量的で且つ自動化が可能で、更に精度高く幹細胞コロニーの状態を判別する細胞解析方法、細胞解析装置、および細胞解析プログラムを提供する。

Claims (11)

  1. 　多数の細胞から構成される細胞コロニーの光路長画像を用いて、前記細胞コロニーの解析を行う細胞解析装置における細胞解析方法であって、
    　前記細胞解析装置の取得手段が、前記細胞コロニーの光路長画像を取得する取得ステップと、
    　前記細胞解析装置の抽出手段が、当該取得した光路長画像中において、前記細胞の細胞核に対応する円形形状を抽出する抽出ステップと、
    　前記細胞解析装置の比較手段が、当該抽出した円形形状に対し、その内側の光路長および外側の光路長を比較する比較ステップと、
    　前記細胞解析装置の解析手段が、当該比較結果に基づき、前記細胞コロニーの解析を行う解析ステップと、
    　を備えることを特徴とする細胞解析方法。
  2. 　前記比較ステップおよび前記解析ステップでは、前記円形形状における前記内側の光路長に比べて前記外側の光路長が大きい場合に、当該細胞が品質の良い細胞と判断される、
    　ことを特徴とする請求項１に記載の細胞解析方法。
  3. 　前記解析ステップでは、前記品質の良い細胞と判断された細胞の単位面積当たりの数が閾値以上である場合に、当該細胞コロニーが品質の良い細胞コロニーと判断される、
    　ことを特徴とする請求項２に記載の細胞解析方法。
  4. 　前記細胞解析装置の表示手段が、前記品質が良いと判断された細胞コロニーに含まれる領域を特定し表示する表示ステップを更に備える、
    　ことを特徴とする請求項３に記載の細胞解析方法。
  5. 　前記光路長画像は、定量光路長画像である、
    　ことを特徴とする請求項１～４の何れか１項に記載の細胞解析方法。
  6. 　前記円形形状は真円形形状である、
    　ことを特徴とする請求項１～５の何れか１項に記載の細胞解析方法。
  7. 　前記真円形形状は、所定範囲の直径を有する真円形形状である、
    　ことを特徴とする請求項６に記載の細胞解析方法。
  8. 　前記円形形状は楕円形形状である、
    　ことを特徴とする請求項１～５の何れか１項に記載の細胞解析方法。
  9. 　前記細胞は幹細胞である、
    　ことを特徴とする請求項１～８の何れか１項に記載の細胞解析方法。
  10. 　多数の細胞から構成される細胞コロニーの光路長画像を用いて、前記細胞コロニーの解析を行う細胞解析装置であって、
    　前記細胞コロニーの光路長画像を取得する取得手段と、
    　当該取得した光路長画像中において、前記細胞の細胞核に対応する円形形状を抽出する抽出手段と、
    　当該抽出した円形形状に対し、その内側の光路長および外側の光路長を比較する比較手段と、
    　当該比較結果に基づき、前記細胞コロニーの解析を行う解析手段と、
    　を備えることを特徴とする細胞解析装置。
  11. 　コンピュータを、
    　多数の細胞から構成される細胞コロニーの光路長画像を用いて、前記細胞コロニーの解析を行う細胞解析装置における、
    　前記細胞コロニーの光路長画像を取得する取得手段と、
    　当該取得した光路長画像中において、前記細胞の細胞核に対応する円形形状を抽出する抽出手段と、
    　当該抽出した円形形状に対し、その内側の光路長および外側の光路長を比較する比較手段と、
    　当該比較結果に基づき、前記細胞コロニーの解析を行う解析手段、
    　として動作させることを特徴とする細胞解析プログラム。
     
     
     
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