WO2016170938A1 - Non-human animal model of cancer and method for constructing same, cancer stem cell and method for producing same - Google Patents

Non-human animal model of cancer and method for constructing same, cancer stem cell and method for producing same Download PDF

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妹尾　昌治
智成 笠井
良章 岩▲崎▼
利章 大原
聡 廣畑
博貴 加来田
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国立大学法人岡山大学
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    • A01K67/027—New breeds of vertebrates

Abstract

Provided is a non-human animal model of cancer that is constructed by transplanting a cancer stem cell, said cancer stem cell having characteristics of an organ or tissue, into a non-human mammal so as to induce cancer of the organ or tissue therein.

Description

がんの非ヒトモデル動物及びその作製方法、がん幹細胞及びその製造方法Non-human animal model of cancer and production method thereof, cancer stem cell and production method thereof
　本発明は、がんの非ヒトモデル動物及びその作製方法、がん幹細胞及びその製造方法に関する。 The present invention relates to a non-human model animal for cancer, a production method thereof, a cancer stem cell, and a production method thereof.
　被検物質の発がん性リスク評価は、変異原性試験や反復投与毒性試験、統計学的にヒトに与える影響の評価などによって行われてきた。しかし、近年のがん研究ではがん及びがん組織は特定の遺伝子変異だけによる均一な細胞の集合体では無く、不均一な性質・特性をもつ細胞の集団であること、「がん誘導性の微小環境」によってがんの基となる「がん幹細胞」が作られること、がん幹細胞の分化や増殖、浸潤ががん組織の成長や転移、また、がん治療における再発の原因であることが明らかとなってきた。がん幹細胞は際限なく分化を継続してがん細胞を生みだし、自身も増殖を繰り返す。この分化増殖を促進するシグナルを提供するのが微小環境（ニッチ）である。一方、この分化過程は詳細には解明されていないが、本発明者らはiPS 細胞を用いることで，がん由来細胞株の培養液にがん幹細胞を誘導する“ニッチ” が存在することを証明してきた（特許文献1）。  The carcinogenicity risk assessment of test substances has been performed by mutagenicity tests, repeated dose toxicity tests, statistical evaluation of effects on humans, and the like. However, in recent cancer research, cancers and cancer tissues are not uniform cell aggregates only due to specific gene mutations, but are a group of cells with heterogeneous properties and characteristics. The “microenvironment” creates cancer stem cells that are the basis of cancer, and the differentiation, proliferation, and invasion of cancer stem cells are the cause of cancer tissue growth and metastasis, and recurrence in cancer treatment It has become clear. Cancer stem cells continue to differentiate indefinitely to produce cancer cells, which themselves repeat proliferation. It is the microenvironment (niche) that provides signals that promote this differentiation and proliferation. On the other hand, although this differentiation process has not been elucidated in detail, the present inventors have found that by using iPS sputum cells, there exists a “niche” sputum that induces cancer stem cells in the culture solution of cancer-derived cell lines. It has been proven (Patent Document 1).
　従来の、がんのモデルは、例えばヒトのがんをヌードマウス、スキッドマウスなどの免疫不全マウスの皮下に移植することで作製され使用されてきた。 Conventional cancer models have been produced and used, for example, by transplanting human cancer subcutaneously into immunodeficient mice such as nude mice and skid mice.
WO2014/148562WO2014 / 148562
　本発明は、ある臓器もしくは組織の特性を有するがん幹細胞(delay phaseのがん幹細胞)と特定の臓器もしくは組織の特性を有するに至っていない初期のがん幹細胞(early phaseのがん幹細胞)を作出し、これを免疫不全動物に移植し、生着増殖させることで作出する担がん動物モデルを提供する。移植部位は、当該臓器もしくは組織と同じことが望ましいが、異なっていてもよい。更に、宿主と同じMHC(主要組織適合遺伝子複合体)を有するがん細胞・組織を宿主内で簡便かつ再現性良く生み出すことができ、その結果として治療上大きな意味をもつ宿主等の免疫系等の関与も含めた、がんの治療薬、治療法等の評価が出来る、画期的な担がん動物モデルを提供することを目的とする。 The present invention relates to cancer stem cells having characteristics of a certain organ or tissue (delay phase cancer stem cells) and early cancer stem cells not having the characteristics of a specific organ or tissue (early phase cancer stem cells). A cancer-bearing animal model that is produced by transplanting it into an immunodeficient animal and engrafting it is provided. The transplant site is preferably the same as the organ or tissue, but may be different. Furthermore, cancer cells / tissues that have the same MHC (major histocompatibility complex) as the host can be easily and reproducibly generated in the host, and as a result, the immune system of the host, etc. that has significant therapeutic significance, etc. The purpose is to provide an epoch-making animal model for cancer, which can evaluate cancer therapeutics, treatments, etc.
　本発明は、以下のがんの非ヒトモデル動物及びその作製方法を提供するものである。
項１．　ある臓器もしくは組織の特性を有するがん幹細胞を非ヒト哺乳動物に移植して、前記臓器もしくは組織のがんを作製してなる、がんの非ヒトモデル動物。
項２．　前記非ヒト哺乳動物が免疫不全の非ヒト哺乳動物であり、前記がん幹細胞を前記臓器もしくは組織のがん細胞とともに非ヒト哺乳動物に移植して、がん幹細胞を保有する前記臓器もしくは組織のがんを作製してなる、項１に記載のがんの非ヒトモデル動物。
項３．　前記がん細胞がヒト由来のがん細胞である、項２に記載のがんの非ヒトモデル動物。
項４．　前記がん幹細胞移植して作製したがんを摘出し、がんを再発させてなる、項１に記載のがんの非ヒトモデル動物。
項５．　前記がん幹細胞とがん細胞を移植して作製したがんを摘出し、がんを再発させてなる、項２に記載のがんの非ヒトモデル動物。
項６．　前記非ヒト哺乳動物とがん幹細胞のMHC(主要組織適合遺伝子複合体)が同一である、項１に記載のがんの非ヒトモデル動物。
項７．　前記がん幹細胞がES細胞から誘導されたものであり、ES細胞とモデル動物のMHCが同一である、項６に記載のがんの非ヒトモデル動物。
項８．　前記臓器もしくは組織が、肝臓、腎臓、肺、胃、大腸、膵臓、胆嚢、卵巣、子宮、前立腺、乳房、甲状腺、血液、リンパ液、骨髄、膀胱、副腎、脳/脊髄からなる群から選ばれる、項１～７のいずれか１項に記載のがんの非ヒトモデル動物。
項９．　多能性幹細胞をある臓器もしくは組織の細胞に分化誘導するプロセスにおいて不死化細胞の培地に含まれる培養成分を含む培地を使用して特定の臓器もしくは組織の性質を有するがん幹細胞を作製する工程、前記がん幹細胞を非ヒト哺乳動物に移植して、前記がん幹細胞と同じ特定の臓器もしくは組織にがんを作製する工程を含む、がんの非ヒトモデル動物の作製方法。
項１０．　多能性幹細胞をがん細胞と共培養して特定の臓器もしくは組織の性質を有するがん幹細胞を作製する工程、前記がん幹細胞と前記がん細胞を非ヒト哺乳動物に移植して、前記がん幹細胞の特性と同じ臓器もしくは組織にがんを作製する工程を含む、がんの非ヒトモデル動物の作製方法。
項１１．　初期のがん幹細胞を、前記がん幹細胞と同一のMHC(主要組織適合遺伝子複合体)を有する非ヒト哺乳動物に移植してがんを作製してなり、初期のがん幹細胞が臓器もしくは組織の特性を有しないがん幹細胞である、がんの非ヒトモデル動物。
項１２．　がん幹細胞が、ES細胞或いはiPS細胞に由来する、項１１に記載のがんの非ヒトモデル動物。
項１３．　前記がん幹細胞を同一のMHCを有するがん細胞とともに同一のMHCを有する非ヒト哺乳動物に移植してがん幹細胞を保有するがんを作製してなる、項１１又は１２に記載のがんの非ヒトモデル動物。
項１４．　非ヒトモデル動物の体内のがんに含まれる前記がん幹細胞が特定の臓器もしくは組織の性質を有し、その臓器もしくは組織のがんを保有する、項１１～１３のいずれか１項に記載のがんの非ヒトモデル動物。
項１５．　前記臓器もしくは組織が、肝臓、腎臓、肺、胃、大腸、膵臓、胆嚢、卵巣、子宮、前立腺、乳房、甲状腺、血液、リンパ液、骨髄、膀胱、副腎、脳/脊髄からなる群から選ばれる、項１１～１４のいずれか１項に記載のがんの非ヒトモデル動物。
項１６．　がん幹細胞を、前記がん幹細胞と同一のMHC(主要組織適合遺伝子複合体)を有する非ヒト哺乳動物に移植してがんを作製した後にがんを摘出し、がんを再発させてなる、項１１～１５のいずれか１項に記載のがんの非ヒトモデル動物。
項１７．　がん幹細胞と同じMHCを有する非ヒト哺乳動物に前記がん幹細胞を移植してがんを作製する工程を含む、がんの非ヒトモデル動物の作製方法。
項１８．　がん幹細胞と同じMHCを有する非ヒト哺乳動物に前記がん幹細胞とがん細胞を移植してがんを作製する工程を含む、項１７に記載のがんの非ヒトモデル動物の作製方法。
項１９．　さらにがんを摘出してがんを再発させる工程を含む、項１７又は１８に記載のがんの非ヒトモデル動物の作製方法。
項２０．　ある臓器もしくは組織の特性を有し、多能性幹細胞に由来するがん幹細胞。
項２１．　多能性幹細胞を不死化細胞の培地に含まれる培養成分を含む分化誘導培地で培養して、前記培地で誘導される臓器もしくは組織の特性を有するがん幹細胞を得る工程を含む、臓器もしくは組織の特性を有するがん幹細胞の製造方法。
項２２．　多能性幹細胞をがん細胞と共培養して前記がん細胞と同じ臓器もしくは組織の特性を有するがん幹細胞を得る工程を含む、臓器もしくは組織の特性を有するがん幹細胞の製造方法。 The present invention provides the following non-human animal model for cancer and a method for producing the same.
Item 1. A non-human animal model for cancer, wherein cancer stem cells having characteristics of a certain organ or tissue are transplanted into a non-human mammal to produce cancer of the organ or tissue.
Item 2. The non-human mammal is an immunodeficient non-human mammal, and the cancer stem cell is transplanted into the non-human mammal together with the cancer cell of the organ or tissue, and the organ or tissue having the cancer stem cell is transplanted. Item 2. A non-human animal model of cancer according to item 1, wherein the animal is prepared from cancer.
Item 3. Item 3. The nonhuman model animal for cancer according to Item 2, wherein the cancer cell is a human-derived cancer cell.
Item 4. Item 2. The non-human animal model for cancer according to Item 1, wherein the cancer produced by transplanting the cancer stem cells is removed and the cancer is relapsed.
Item 5. Item 3. The non-human model animal for cancer according to Item 2, wherein the cancer prepared by transplanting the cancer stem cell and the cancer cell is removed and the cancer is relapsed.
Item 6. Item 2. The non-human animal model of cancer according to Item 1, wherein the non-human mammal and the cancer stem cell have the same MHC (major histocompatibility gene complex).
Item 7. Item 7. The non-human animal model of cancer according to Item 6, wherein the cancer stem cell is derived from an ES cell, and the MHC of the ES cell and the model animal is the same.
Item 8. The organ or tissue is selected from the group consisting of liver, kidney, lung, stomach, large intestine, pancreas, gallbladder, ovary, uterus, prostate, breast, thyroid, blood, lymph, bone marrow, bladder, adrenal gland, brain / spinal cord, Item 8. The non-human animal model for cancer according to any one of Items 1 to 7.
Item 9. A process of producing cancer stem cells having specific organ or tissue properties using a medium containing culture components contained in an immortalized cell medium in the process of inducing differentiation of pluripotent stem cells into cells of an organ or tissue A method for producing a non-human animal model of cancer, comprising a step of transplanting the cancer stem cell to a non-human mammal and producing cancer in the same specific organ or tissue as the cancer stem cell.
Item 10. A step of co-culturing pluripotent stem cells with cancer cells to produce cancer stem cells having specific organ or tissue properties, transplanting the cancer stem cells and the cancer cells to a non-human mammal, A method for producing a non-human animal model of cancer, comprising a step of producing cancer in the same organ or tissue as the characteristics of cancer stem cells.
Item 11. An early cancer stem cell is transplanted to a non-human mammal having the same MHC (major histocompatibility complex) as the cancer stem cell to produce cancer, and the initial cancer stem cell is an organ or tissue A non-human animal model of cancer, which is a cancer stem cell that does not have the above characteristics.
Item 12. Item 12. The non-human animal model of cancer according to Item 11, wherein the cancer stem cells are derived from ES cells or iPS cells.
Item 13. Item 11. The cancer according to Item 11 or 12, wherein the cancer stem cell is transplanted to a non-human mammal having the same MHC together with a cancer cell having the same MHC to produce a cancer having cancer stem cells. Non-human animal model.
Item 14. Item 14. The cancer cell according to any one of Items 11 to 13, wherein the cancer stem cells contained in cancer in the body of the non-human model animal have characteristics of a specific organ or tissue and possess cancer of the organ or tissue. Non-human animal model of cancer.
Item 15. The organ or tissue is selected from the group consisting of liver, kidney, lung, stomach, large intestine, pancreas, gallbladder, ovary, uterus, prostate, breast, thyroid, blood, lymph, bone marrow, bladder, adrenal gland, brain / spinal cord, Item 15. The non-human animal model for cancer according to any one of Items 11 to 14.
Item 16. A cancer stem cell is transplanted to a non-human mammal having the same MHC (major histocompatibility complex) as that of the cancer stem cell to produce the cancer, and then the cancer is removed and the cancer is relapsed. Item 16. The non-human animal model of cancer according to any one of Items 11 to 15.
Item 17. A method for producing a non-human model animal of cancer, comprising a step of producing a cancer by transplanting the cancer stem cell to a non-human mammal having the same MHC as the cancer stem cell.
Item 18. Item 18. The method for producing a nonhuman model animal for cancer according to Item 17, comprising a step of producing a cancer by transplanting the cancer stem cell and the cancer cell into a nonhuman mammal having the same MHC as the cancer stem cell.
Item 19. Item 19. The method for producing a non-human model animal for cancer according to Item 17 or 18, further comprising a step of removing the cancer and causing the cancer to recur.
Item 20. Cancer stem cells derived from pluripotent stem cells that have the characteristics of a certain organ or tissue.
Item 21. An organ or tissue comprising a step of culturing a pluripotent stem cell in a differentiation-inducing medium containing a culture component contained in an immortalized cell medium to obtain cancer stem cells having organ or tissue characteristics induced in the medium. Of producing cancer stem cells having the following characteristics:
Item 22. A method for producing cancer stem cells having organ or tissue characteristics, comprising a step of co-culturing pluripotent stem cells with cancer cells to obtain cancer stem cells having the same organ or tissue characteristics as the cancer cells.
　従来のモデル動物は、分化が進んだヒトの肝臓がん細胞、肺がん細胞などを主に用い、これを免疫不全の非ヒト哺乳動物(例えばスキッドマウス/ヌードマウス)の皮下に移植して各種のがん（例えば肝臓がん/肺がん）を皮下で大きくする（腫瘍塊の増殖形成）か、免疫不全動物の同じ臓器への移植（同所移植：非ヒト哺乳動物組織との生着増殖）により作製していた。本願では、非ヒト哺乳動物の「がん幹細胞」（例えば自家移植）を用いることで、宿主と自然発症に近いがん細胞の樹立が期待できる。例えば、本発明を用いると、最近活発化している、「免疫チェックポイント」に働く薬剤の薬理作用検証、併用効果などのスクリーニングなどにも、用いることができると期待される。更に、「同じ」臓器部位あるいは、その周辺部位、その他に、前出「がん幹細胞」を移植することで、従来の、いわゆる「同所移植モデル」よりも、更に、臨床に近いがん組織形態を有する非ヒトモデル動物を作出することができる。 Conventional model animals mainly use human liver cancer cells, lung cancer cells, etc. that have undergone differentiation, and these are transplanted under the skin of immunodeficient non-human mammals (for example, skid mice / nude mice). By enlarging the cancer (eg liver cancer / lung cancer) subcutaneously (tumor mass growth formation) or transplanting an immunodeficient animal into the same organ (spot transplantation: engraftment with non-human mammalian tissue) I was making it. In the present application, by using “cancer stem cells” (for example, autologous transplantation) of non-human mammals, establishment of cancer cells close to spontaneous development with the host can be expected. For example, when the present invention is used, it is expected that the present invention can be used for the verification of pharmacological action of drugs acting on “immune checkpoints”, screening for combined effects, etc., which have recently been activated. Furthermore, by transplanting the above-mentioned “cancer stem cells” to the “same” organ site or its peripheral site, etc., cancer tissue closer to clinical practice than the conventional so-called “sympatric transplant model” A non-human model animal having a morphology can be created.
　また、がん幹細胞とともにがん細胞を移植することで、がん幹細胞を含むがんの非ヒトモデル動物を作製することができる。 Also, non-human animal models of cancer containing cancer stem cells can be produced by transplanting cancer cells together with cancer stem cells.
mES-LLCcm培養36日後のES細胞ES cells after 36 days of mES-LLCcm culture チューブフォーメーションアッセイ（分化能評価）Tube formation assay (Evaluation of differentiation potential) スフェアフォーメーションアッセイ（自己複製能評価）。左：アッセイ開始時、右：無血清培地、非接着培養４日目A sphere formation assay (evaluation of self-replication). Left: At the start of the assay, Right: Serum-free medium, non-adherent culture day 4 腹腔に移植40日後に形成された腫瘍（造腫瘍能評価）Tumor formed 40 days after transplantation into the abdominal cavity (evaluation of tumorigenicity) 培養26日目のプライマリーカルチャーPrimary culture on culture day 26 腫瘍切片観察像Tumor slice observation image 5mm角の腫瘍を移植したマウスに形成された腫瘍。（上段：皮下移植、下段：腹腔移植）Tumor formed in a mouse transplanted with a 5 mm square tumor. (Upper: Subcutaneous transplantation, Lower: Peritoneal transplantation) CM添加条件下での分化誘導。EB:Embryonic Body, DE:Definitive Endoderm, Heps:Hepatocytes。Differentiation induction under conditions of CM addition. EB: Embryonic Body, DE: Definitive Endoderm, Heps: Hepatocytes. マウス担癌から作成したプライマリーカルチャー細胞の誘導　左：ヒト肝がん細胞株PLC/PRF/5（PLC）で誘導し、マウス担癌から抽出したプライマリーカルチャーを肝細胞に誘導。右：マウス肺癌細胞株LLCで誘導し、マウス担癌から抽出したプライマリーカルチャーを幹細胞に誘導。Induction of primary culture cells prepared from mouse cancer-bearing Left: Induced with human liver cancer cell line PLC / PRF / 5 (PLC), and induced primary culture extracted from mouse cancer-bearing into hepatocytes. Right: Induced with mouse lung cancer cell line LLC, and induced primary culture extracted from mouse cancer-bearing stem cells. アルブミン遺伝子発現量の変化。左上：CMなし（通常の分化誘導）、右上：CM添加、左下：miPS-PLCcmのプライマリーカルチャー（ｐ１）　右下：miPS-LLCcmのプライマリーカルチャー（ｐ１）Change in albumin gene expression level. Upper left: No CM (normal differentiation induction), Upper right: CM added, Lower left: miPS-PLCcm primary culture (p1) Lower right: miPS-LLCcm primary culture (p1) アルファフェトプロテイン遺伝子発現量の変化左：CMなし（通常の分化誘導）、右：miPS-PLCcm-p1Change in the expression level of alphafetoprotein gene Left: No CM (normal differentiation induction), Right: miPS-PLCcm-p1 SCID-bgマウス腸管に移植したHeps(+CM)が形成した肝臓の腫瘍と腫瘍から抽出したプライマリーカルチャー。Liver tumor formed by Heps (+ CM) transplanted into the intestine of SCID-bg mice and primary culture extracted from the tumor. 共培養ウェルにおけるがん幹細胞（CSC）検出Cancer stem cell (CSC) detection in co-culture wells colon26＋miPS-LLCcmの腫瘍回収の6-20日後の免疫染色結果（HE＋GFP）を示す。The immunostaining result (HE + GFP) 6-20 days after tumor recovery of colon26 + miPS-LLCcm is shown. colon26＋miPS-LLCcmの腫瘍回収の6-20日後の免疫染色結果（HE+Nanog）を示す。The immunostaining result (HE + Nanog) 6-20 days after tumor recovery of colon26 + miPS-LLCcm is shown. 4T1＋miPS-LLCcmの腫瘍回収の6-20日後の免疫染色結果（HE＋GFP）を示す。The immunostaining result (HE + GFP) 6-20 days after tumor recovery of 4T1 + miPS-LLCcm is shown. 4T1＋miPS-LLCcmの腫瘍回収の6-20日後の免疫染色結果（HE+Nanog）を示す。The immunostaining result (HE + Nanog) 6-20 days after tumor recovery of 4T1 + miPS-LLCcm is shown. colon26又は4T1と共培養したがん幹細胞(CSC)を移植したマウスにおいて形成されたがん組織中の抗サイトケラチン抗体を用いた免疫染色の結果を示す。The result of the immuno-staining using the anti-cytokeratin antibody in the cancer tissue formed in the mouse | mouth which transplanted the cancer stem cell (CSC) cocultured with colon26 or 4T1 is shown. colon26を直腸に同所性移植して得られた腫瘍。GFPとNanogは発現していない。Tumor obtained by orthotopic transplantation of colon26 into the rectum. GFP and Nanog are not expressed. colon26とmiPS-LLCcmを直腸に同所性移植して得られた腫瘍。GFPとNanogを発現している。Tumor obtained by orthotopic transplantation of colon26 and miPS-LLCcm into the rectum. GFP and Nanog are expressed. LLC細胞のCMを用いたB6G細胞の分化誘導の様子Differentiation induction of B6G cells using LLC cell CM B6G-LLCcmによる腫瘍の形成とprimary cultureの作製　a：B6G-LLCcmにより形成した腫瘍　b：形成した腫瘍から作製したprimary cultureTumor formation by B6G-LLCcm and production of primary culture a: Tumor formed by B6G-LLCcm b: Primary culture prepared from formed tumor B6G-CSCのTube formation assayとSphere formation assayの結果。　ａ： B6G-LLCcmのTube formation assay　(20x)　ｂ： B6G-LLCcmのSphere formation assay　(20x)Results of Tube formation assay and Sphere formation assay of B6G-CSC. A: B6G-LLCcm Tube formation assay (20x) b: B6G-LLCcm Sphereformation assay (20x) q-PCRによる未分化マーカー解析　a：作成したmES-CSCの未分化マーカーの発現　b：作成したB6G-LLCcmの未分化マーカーの発現Analysis of undifferentiated marker by q-PCR a: Expression of undifferentiated marker of prepared mES-CSC b: Expression of undifferentiated marker of prepared B6G-LLCcm 形成された腫瘍の病理学的観察（HE染色）(a)腫瘍組織(b)ホスト肝臓組織を含む腫瘍組織　丸印 ; 腺上皮組織　矢印 ; 脂肪組織　点線左側 ; ホスト肝臓組織Pathological observation of formed tumor (HE staining) (a) Tumor tissue (b) Tumor tissue including host liver tissue Round seal Gland epithelial tissue Arrow; Fat tissue 点 dotted left side; Host liver tissue
　本明細書において、「CSC」はがん幹細胞を示し、「cm」は培養培地を示す。 In this specification, “CSC” indicates cancer stem cells, and “cm” indicates culture medium.
　本発明で使用するがん幹細胞は、ある臓器もしくは組織の特性を有するがん幹細胞と、特定の臓器もしくは組織の特性を有しない、より未分化ながん幹細胞のいずれを使用してもよい。 The cancer stem cells used in the present invention may be either cancer stem cells having the characteristics of a certain organ or tissue and more undifferentiated cancer stem cells having no characteristics of a specific organ or tissue.
　本明細書において、ある臓器もしくは組織の特性を有するがん幹細胞は、より分化された「後期(delay phase)」のがん幹細胞と記載することがあり、特定の臓器もしくは組織の特性を有しないがん幹細胞は、未分化な「初期(early phase)」のがん幹細胞と記載することがある。ある臓器もしくは組織の特性を有するがん幹細胞（後期のがん幹細胞）は、例えば、ES細胞、iPS細胞などの多能性幹細胞を分化誘導する過程でがん細胞などの不死化細胞と共培養するか、多能性幹細胞を分化誘導する過程でがん細胞などの不死化細胞の培地に含まれる培養成分を含む培地を使用することで作製できる。特定の臓器もしくは組織の特性を有しないがん幹細胞（初期のがん幹細胞）は、ES細胞、iPS細胞などの多能性幹細胞を分化誘導することなくがん細胞などの不死化細胞と共培養するか、がん細胞などの不死化細胞の培地に含まれる培養成分を含む培地を使用してES細胞、iPS細胞などの多能性幹細胞を培養することで作製できる。なお、ES細胞、iPS細胞などの多能性幹細胞をがん細胞などの不死化細胞と共培養するか、多能性幹細胞を分化誘導する過程でがん細胞などの不死化細胞の培地に含まれる培養成分を含む培地で培養すると、不死化細胞の影響を受けるが、培養期間の初期において特定の臓器もしくは組織の特性を有しないがん幹細胞が生じ、さらに長期間培養を続けた場合には、後期のがん幹細胞になる場合があり、或いは、分化誘導培地で初期のがん幹細胞を培養することで後期のがん幹細胞に変換することができる。 In the present specification, a cancer stem cell having a characteristic of a certain organ or tissue may be described as a more differentiated “delay phase” cancer stem cell, and does not have a specific organ or tissue characteristic. Cancer stem cells may be described as undifferentiated “early phase” cancer stem cells. Cancer stem cells (late cancer stem cells) with characteristics of a certain organ or tissue are co-cultured with immortalized cells such as cancer cells in the process of inducing differentiation of pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells. Or it can produce by using the culture medium containing the culture component contained in the culture medium of immortalized cells, such as a cancer cell, in the process of differentiation-inducing a pluripotent stem cell. Cancer stem cells that do not have specific organ or tissue characteristics (early cancer stem cells) are co-cultured with immortalized cells such as cancer cells without inducing differentiation of pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells Alternatively, it can be produced by culturing pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells using a medium containing culture components contained in a medium for immortalized cells such as cancer cells. In addition, pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells are co-cultured with immortalized cells such as cancer cells, or included in the medium of immortalized cells such as cancer cells in the process of inducing differentiation of pluripotent stem cells When cultured in a medium containing culture components that are affected by immortalized cells, cancer stem cells that do not have the characteristics of a specific organ or tissue are generated at the beginning of the culture period, and if the culture is continued for a long time, In some cases, the cancer stem cells may become late cancer stem cells, or they can be converted into late cancer stem cells by culturing early cancer stem cells in a differentiation-inducing medium.
　臓器もしくは組織の特性は、形態学的特徴、免疫染色、発現するタンパク質、遺伝子の発現パターンなどにより識別可能である。 Organ or tissue characteristics can be identified by morphological characteristics, immunostaining, expressed proteins, gene expression patterns, and the like.
　がん細胞などの不死化細胞と共培養されたがん幹細胞は、比較的速やかに初期のがん幹細胞から後期のがん幹細胞に移行し、がん細胞などの不死化細胞の培地に含まれる培養成分を含む培地を用いて多能性幹細胞を培養した場合には、初期のがん幹細胞から後期のがん幹細胞に移行するのに長期間必要になる。 Cancer stem cells co-cultured with immortalized cells such as cancer cells move from early cancer stem cells to later cancer stem cells relatively quickly and are contained in the medium of immortalized cells such as cancer cells. When pluripotent stem cells are cultured using a culture medium containing culture components, it is necessary for a long period of time to shift from early cancer stem cells to later cancer stem cells.
　本発明の後期のがん幹細胞は、ヌードマウス、SKIDマウスなどの免疫不全哺乳動物或いはがん幹細胞とMHCが同一の哺乳動物の各臓器もしくは組織に直接移植されるか、各臓器もしくは組織に至る血管等に注入されることにより、前記臓器もしくは組織のがんを保有するモデル動物を作製することができる。本発明の初期のがん幹細胞は、ヌードマウス、SKIDマウスなどの免疫不全哺乳動物或いはがん幹細胞とMHCが同一の哺乳動物の任意の臓器もしくは組織に直接移植されるか、任意の臓器もしくは組織に至る血管等に注入されることにより、任意の臓器もしくは組織のがんを保有するモデル動物を作製することができる。 The late stage cancer stem cells of the present invention may be transplanted directly to each organ or tissue of an immunodeficient mammal such as nude mouse or SKID mouse, or cancer stem cell and MHC, or to the same organ or tissue. By being injected into a blood vessel or the like, a model animal having cancer of the organ or tissue can be produced. The initial cancer stem cells of the present invention may be transplanted directly into any organ or tissue of an immunodeficient mammal such as a nude mouse, a SKID mouse, or the same mammal with cancer stem cells and MHC, or any organ or tissue A model animal having cancer of any organ or tissue can be produced.
　後期のがん幹細胞は、前記がん幹細胞が有する特性に係るがん細胞とともに移植してもよい。初期のがん幹細胞は、がんを発生させるべき臓器又は組織のがん細胞とともに移植してもよい。この場合のがん細胞とがん幹細胞は、各々モデル動物と同じ由来であっても異なっていてもよい。例えば免疫不全マウスにマウス由来のがん幹細胞とヒト由来のがん細胞を同時に移植することで、がん幹細胞から自然発症に近いがんが形成され、かつ、ヒトのがんの性質を併せ持つ優れたがんモデルマウスを得ることができる。ヌードマウス、SKIDマウスなどの免疫不全マウスを使用する場合、移植するがん幹細胞とがん細胞がともにヒト由来などの非マウス由来であってもよい。がん幹細胞とがん細胞の組み合わせはマウスとヒトに限らずあらゆる種類の哺乳動物の組み合わせが本発明に含まれる。ある臓器もしくは組織の特性を有するがん幹細胞は、同所性移植によりモデル動物にがんを作製することが好ましいが、移植部位は、がん幹細胞の特性と無関係の臓器もしくは組織に移植することもできる。初期のがん幹細胞は、どのような臓器もしくは組織に移植してもよい。 Late cancer stem cells may be transplanted together with cancer cells related to the characteristics of the cancer stem cells. Early cancer stem cells may be transplanted together with cancer cells of an organ or tissue in which cancer should occur. The cancer cells and cancer stem cells in this case may be the same origin or different from the model animal. For example, by transplanting mouse-derived cancer cells and human-derived cancer cells into immunodeficient mice at the same time, cancer that is close to spontaneous development is formed from the cancer stem cells, and also has the characteristics of human cancer Cancer model mice can be obtained. When immunodeficient mice such as nude mice and SKID mice are used, both cancer stem cells and cancer cells to be transplanted may be derived from non-mouse such as human origin. Combinations of cancer stem cells and cancer cells are not limited to mice and humans, and combinations of all types of mammals are included in the present invention. Cancer stem cells with certain organ or tissue characteristics are preferably produced in model animals by orthotopic transplantation, but the transplant site should be transplanted into an organ or tissue unrelated to the characteristics of cancer stem cells. You can also. Early cancer stem cells may be transplanted into any organ or tissue.
　初期又は後期のがん幹細胞、必要に応じてさらに使用されるがん細胞が、これらを移植する哺乳動物と同じMHCを有する場合には、免疫拒絶が抑制されるので、任意の非ヒト哺乳動物（例えばマウス）を使用することができ、がん幹細胞、必要に応じてさらに使用されるがん細胞が、これらを移植する哺乳動物と異なるMHCを有する場合には、免疫不全マウスなどの免疫不全非ヒト哺乳動物を用いることが好ましい。 Any non-human mammal, since the immune rejection is suppressed when the cancer stem cells in the early stage or late stage, and the cancer cells further used as necessary have the same MHC as the mammal to which they are transplanted, (E.g., mouse) can be used, and if cancer stem cells, and if necessary, cancer cells have a different MHC from the mammal into which they are transplanted, immunodeficiency such as immunodeficient mice It is preferable to use a non-human mammal.
　初期又は後期のがん幹細胞、必要に応じてさらにがん細胞をモデル哺乳動物に移植してがんを形成し、これをそのままがんモデル動物として使用してもよく、いったんがんを摘出し、がんを再発させてがんモデル動物としてもよい。 Early or late cancer stem cells, and if necessary, further cancer cells can be transplanted into model mammals to form cancer, which can be used directly as cancer model animals. Alternatively, cancer may be recurred and used as a cancer model animal.
　本発明の他の１つの実施形態において、がん幹細胞とそれを移植する非ヒト哺乳動物は同一のMHCを有する。すなわち、がん幹細胞とそれを移植する非ヒト哺乳動物はMHC遺伝子群がホモ又はヘテロで同一であり、それにより移植したがん幹細胞は免疫拒絶を受けることなく宿主である非ヒト哺乳動物においてがん組織を形成する。例えば、がん幹細胞の調製にES細胞を使用する場合、移植する宿主の非ヒト哺乳動物と同じMHCを有するES細胞は市販品として入手可能であるので、そのようなES細胞と移植対象の哺乳動物の組み合わせを使用することで、MHCを同一にすることができる。或いは、移植対象の非ヒト哺乳動物からiPS細胞を作製し、このiPS細胞からがん幹細胞を作製して同じ非ヒト哺乳動物に移植してがんを作製することで、MHCが同一のがんの非ヒトモデル動物を得ることができる。応用例として、MHCが「同一でない」組み合わせの非ヒトモデル動物も作出することができる。使用目的により、こうした「組み合わせ」を自由に選択することができる。 In another embodiment of the present invention, the cancer stem cell and the non-human mammal into which it is transplanted have the same MHC. That is, cancer stem cells and non-human mammals that transplant them are homologous or heterologous to the MHC gene group, so that transplanted cancer stem cells are not subject to immune rejection in non-human mammals that are hosts. To form an organization. For example, when ES cells are used for the preparation of cancer stem cells, ES cells having the same MHC as the non-human mammal of the host to be transplanted are commercially available. By using a combination of animals, the MHC can be made identical. Alternatively, by preparing iPS cells from a non-human mammal to be transplanted, preparing cancer stem cells from the iPS cells and transplanting them into the same non-human mammal to produce cancer, cancer with the same MHC Non-human animal models can be obtained. As an application example, a non-human model animal having a combination of “not identical” MHC can also be created. Such a “combination” can be freely selected depending on the purpose of use.
　不死化細胞としては、実験室環境において３カ月以上にわたり培養可能である細胞集団を指し、各種がん細胞が好ましく例示される。不死化細胞としては、CHO細胞、褐色細胞腫NS0細胞、CV-1細胞、COS-1細胞、COS-7細胞、CHO-K1細胞、3T3細胞、NIH/3T3細胞、HeLa細胞、C127I細胞、BS-C-1細胞、MRC-5細胞、HEK-293細胞、PC12細胞、HEK293T細胞、RBL細胞、SH- SY5Y細胞、MDCK細胞、SJ-RH30細胞、HepG2細胞、ND7/23細胞、ベロ細胞、Caco-2細胞、K562細胞、ジャーカット細胞、Per.C6細胞、HUVEC細胞、マウスCRL 2514細胞、CRL 2515細胞、Huh7細胞、A549細胞、乳がん細胞株4T1、大腸がん細胞株colon26、マウスP19-CL6細胞、マウスB16-F10細胞、PLC/PRF5細胞、LLC細胞、IMR-90細胞、MCF-7細胞、U-2 OS細胞、T84細胞などが挙げられる。不死化細胞としては、がん細胞が好ましい。 The immortalized cell refers to a cell population that can be cultured for 3 months or longer in a laboratory environment, and various cancer cells are preferably exemplified. Immortalized cells include CHO cells, pheochromocytoma NS0 cells, CV-1 cells, COS-1 cells, COS-7 cells, CHO-K1 cells, 3T3 cells, NIH / 3T3 cells, HeLa cells, C127I cells, BS -C-1 cells, MRC-5 cells, HEK-293 cells, PC12 cells, HEK293T cells, RBL cells, SH- SY5Y cells, MDCK cells, SJ-RH30 cells, HepG2 cells, ND7 / 23 cells, Vero cells, Caco -2 cells, K562 cells, Jurkat cells, Per.C6 cells, HUVEC cells, mouse CRL 2514 cells, CRL 2515 cells, Huh7 cells, A549 cells, breast cancer cell line 4T1, colon cancer cell line colon26, mouse P19-CL6 Cells, mouse B16-F10 cells, PLC / PRF5 cells, LLC cells, IMR-90 cells, MCF-7 cells, U-2UOS cells, T84 cells and the like. As the immortalized cell, a cancer cell is preferable.
　培養液/培養成分を利用するために用いるがん細胞としては、哺乳類（ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、サルなど）由来のがん細胞であれば特に限定されず、マウス由来がん細胞、ヒト由来がん細胞などを広く用いることができる。また、がんの種類（大腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、前立腺がん、胃がん、肝臓がん、食道がん、膵臓がん、膀胱がん、胆管がん、喉頭がん、黒色腫、肺がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、甲状腺がん、多発性骨髄腫など）にも因らない。 The cancer cells used for using the culture medium / culture components are not particularly limited as long as they are derived from mammals (human, mouse, rat, cow, pig, sheep, rabbit, dog, monkey, etc.). Mouse-derived cancer cells, human-derived cancer cells, and the like can be widely used. The types of cancer (colorectal cancer, breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, prostate cancer, stomach cancer, liver cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, Bile duct cancer, laryngeal cancer, melanoma, lung cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, thyroid cancer, multiple myeloma, etc.).
　不死化細胞（好ましくはがん細胞）の培養液/培養成分は、２種以上を組み合わせて使用してもよい。がん細胞を培養した培地の培養成分としては、培地を遠心分離して得られた培養上清や、培地をカラムクロマトグラフィーなどにより分画したフラクションなどが挙げられる。或いはマイトマイシンＣなどで処理して増殖能を失ったがん細胞を不死化細胞（好ましくはがん細胞）の培養液/培養成分として使用することができる。 The culture solution / culture component of immortalized cells (preferably cancer cells) may be used in combination of two or more. Examples of the culture component of the culture medium in which cancer cells are cultured include a culture supernatant obtained by centrifuging the culture medium, and a fraction obtained by fractionating the culture medium by column chromatography. Alternatively, cancer cells that have been treated with mitomycin C or the like and have lost their proliferation ability can be used as a culture solution / culture component of immortalized cells (preferably cancer cells).
　多能性幹細胞をある臓器もしくは組織の細胞に誘導するプロセスにおいて、不死化細胞の培地に含まれる培養成分を含む培地を使用することで、特定の臓器もしくは組織の細胞の性質を有するがん幹細胞を作製することができる。例えば肝臓の性質を有するがん幹細胞は、アルブミン、αフェトプロテインなどを作製でき、肝細胞としての性質を有し、かつ、動物に移植したときに造腫瘍能を有するがん幹細胞が挙げられる。このような肝細胞としての性質を有するがん幹細胞は、Iwamuroら、Cell Transplant. 2010;19(6):841-7に記載の方法において、不死化細胞の培地に含まれる培養成分を含む培地を使用することで調製できる。肝臓以外の臓器、組織の性質を有するがん幹細胞は、ES細胞、iPS細胞などの多能性幹細胞を各臓器、組織に誘導する公知のプロセスにおいて不死化細胞の培地に含まれる培養成分を含む培地を使用することで、肝細胞の性質を有するがん幹細胞と同様に調製することができる。或いは、多能性幹細胞をがん細胞と共培養して特定の臓器もしくは組織の性質を有するがん幹細胞を作製することができる。がん細胞としては、各種のがん細胞株を使用することができる。 Cancer stem cells having the properties of cells of a specific organ or tissue by using a medium containing culture components contained in the medium of immortalized cells in the process of inducing pluripotent stem cells into cells of an organ or tissue Can be produced. For example, cancer stem cells having liver properties include those that can produce albumin, α-fetoprotein, etc., have properties as hepatocytes, and have tumorigenic potential when transplanted into animals. A cancer stem cell having such a property as a hepatocyte is a medium containing a culture component contained in a medium of immortalized cells in the method described in Iwamuro et al., Cell Transplant. 2010; 19 (6): 841-7. Can be used. Cancer stem cells having properties of organs and tissues other than the liver include culture components contained in the medium of immortalized cells in a known process for inducing pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells into each organ and tissue. By using a medium, it can be prepared in the same manner as cancer stem cells having the properties of hepatocytes. Alternatively, pluripotent stem cells can be co-cultured with cancer cells to produce cancer stem cells having specific organ or tissue properties. Various cancer cell lines can be used as the cancer cells.
　本発明の好ましい実施形態において、ある臓器もしくは組織の細胞の性質を有するがん幹細胞は、モデル動物に移植して、がん幹細胞が有する性質と同じがんを有するモデル動物を作製することができる。 In a preferred embodiment of the present invention, a cancer stem cell having the properties of a cell of an organ or tissue can be transplanted into a model animal to produce a model animal having the same cancer as that of the cancer stem cell. .
　モデル動物が有するがんとしては、大腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、前立腺がん、胃がん、肝臓がん、食道がん、膵臓がん、膀胱がん、胆管がん、喉頭がん、黒色腫、肺がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、甲状腺がん、多発性骨髄腫などが挙げられる。 Cancers of model animals include colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, prostate cancer, stomach cancer, liver cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, and bladder. Cancer, bile duct cancer, laryngeal cancer, melanoma, lung cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, thyroid cancer, multiple myeloma and the like.
　本発明の１つの実施形態において、例えば肝がんを保有するモデル動物は、がん幹細胞を腸管、門脈、肝臓などに注射器などで注入することで作製することができる。大腸がんは、腸管にがん幹細胞を注入することで作製できる。他の臓器／組織についても、がん幹細胞をがん作製の標的となる臓器/組織に直接注入するか、標的となる臓器/組織に至る血管に注入することにより、標的臓器／組織にがんを保有するモデル動物を作製することができる。 In one embodiment of the present invention, for example, a model animal having liver cancer can be produced by injecting cancer stem cells into the intestinal tract, portal vein, liver or the like with a syringe or the like. Colorectal cancer can be produced by injecting cancer stem cells into the intestinal tract. For other organs / tissues, cancer stem cells can be injected directly into the target organ / tissue for cancer production or injected into the blood vessels leading to the target organ / tissue, so that cancer can be introduced into the target organ / tissue. Can be produced.
　標的の臓器もしくは組織にがんが発生したことは、触診あるいは顕微鏡による観察などにより視覚的に確認することができる。例えばがん幹細胞がGFPなどの蛍光タンパク質或いはルシフェラーゼを発現するようにし、蛍光/発光を検出することで、どの臓器/組織に腫瘍が発生したのかを確認することができる。 The occurrence of cancer in the target organ or tissue can be visually confirmed by palpation or observation with a microscope. For example, by making a cancer stem cell express a fluorescent protein such as GFP or luciferase and detecting fluorescence / luminescence, it can be confirmed in which organ / tissue a tumor has occurred.
　多能性幹細胞は、がん細胞のような不死化細胞を培養した培地自体或いはその培養成分を用いて培養することで、がん幹細胞に誘導することができる。多能性幹細胞は、がん幹細胞に誘導できる細胞であれば特に限定されないが、例えばiPS細胞、ES細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞が挙げられ、iPS細胞、ES細胞が好ましい。 Pluripotent stem cells can be induced into cancer stem cells by culturing using a culture medium in which immortalized cells such as cancer cells are cultured or using the culture components. The pluripotent stem cell is not particularly limited as long as it can be induced into cancer stem cells, and examples thereof include iPS cells, ES cells, mesenchymal stem cells, neural stem cells, and hematopoietic stem cells, and iPS cells and ES cells are preferable.
　モデル哺乳動物と同じMHCを有するがん幹細胞を使用する場合、多能性幹細胞は、モデル動物と同じMHCを有する多能性幹細胞であれば特に限定されない。例えばマウスの多能性幹細胞を用いる場合、モデル動物はマウスであり、ラットの多能性幹細胞を用いる場合、モデル動物はラットである。 When cancer stem cells having the same MHC as the model mammal are used, the pluripotent stem cells are not particularly limited as long as they have the same MHC as the model animal. For example, when a mouse pluripotent stem cell is used, the model animal is a mouse, and when a rat pluripotent stem cell is used, the model animal is a rat.
　本明細書において、非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ウシ、ウマ、ブタなどが挙げられ、マウス、ラットが好ましく、マウスがより好ましい。 In the present specification, examples of the non-human mammal include mice, rats, hamsters, rabbits, goats, dogs, cats, monkeys, chimpanzees, cows, horses, pigs, etc., mice and rats are preferable, and mice are more preferable. .
　初期又は後期のがん幹細胞を使用する場合、モデル動物とがん幹細胞の由来は同一であっても異なっていてもよい。例えばマウスのがん幹細胞を用いる場合、モデル動物はマウスであってもよく、マウス以外の非ヒト哺乳動物であってもよい。がん幹細胞及びがん細胞はヒトを含む任意の哺乳動物由来のがん幹細胞及びがん細胞を使用することができる。多能性幹細胞は、LIFの非存在下で培養すると分化するが、不死化細胞を培養した培地自体或いはその培養成分を分化誘導培地と組み合わせて培養するか、或いは、がん細胞と共培養することで、ある臓器もしくは組織の性質を有しするがん幹細胞に誘導することができる。 When using early or late cancer stem cells, the origin of the model animal and cancer stem cells may be the same or different. For example, when using mouse cancer stem cells, the model animal may be a mouse or a non-human mammal other than a mouse. As cancer stem cells and cancer cells, cancer stem cells and cancer cells derived from any mammal including humans can be used. Pluripotent stem cells differentiate when cultured in the absence of LIF, but are cultured in combination with the culture medium in which the immortalized cells are cultured or their culture components in combination with a differentiation-inducing medium, or co-cultured with cancer cells. Thus, it can be induced in cancer stem cells having the properties of a certain organ or tissue.
　多能性幹細胞において、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、LIN28, L-MYC, NANOG, SV40LTなどのリプログラミング関連遺伝子のプロモーターの制御下にマーカー遺伝子を組み込むことで、多能性幹細胞から誘導されたがん幹細胞（リプログラミング関連遺伝子を発現する）の存在を容易に認識することができ、モデル動物に発生したがんの種類の同定に有用である。 In pluripotent stem cells, by incorporating a marker gene under the control of promoters of reprogramming related genes such as Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-Myc, LIN28, L-MYC, NANOG, SV40LT, pluripotent stem cells Can easily recognize the presence of cancer stem cells (expressing reprogramming-related genes) derived from, and is useful for identifying the type of cancer that has developed in a model animal.
　本発明で使用する多能性幹細胞は、リプログラミング関連遺伝子（Nanog等）のプロモーターの制御下にマーカー遺伝子を含むのが好ましい。 The pluripotent stem cell used in the present invention preferably contains a marker gene under the control of a promoter of a reprogramming-related gene (Nanog etc.).
　マーカー遺伝子としては、CAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、DsRed、GFP、YFP、RFP、CFPなどの蛍光タンパク質遺伝子、β-グルクロニダーゼ（GUS）、lacZ、カエデ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられ、蛍光タンパク質遺伝子が好ましく例示される。 Marker genes include fluorescent protein genes such as CAT (chloramphenicol acetyltransferase), DsRed, GFP, YFP, RFP, CFP, β-glucuronidase (GUS), lacZ, maple gene, luciferase gene, etc. A protein gene is preferably exemplified.
　マーカー遺伝子の発現量の検出は、マイクロプレートリーダー、CCDカメラなどを用いて行うことができる。胚様体あるいはスフェロイド状の細胞塊は、マーカー遺伝子の発現量が多いために識別可能である。 Detecting the expression level of the marker gene can be performed using a microplate reader, a CCD camera, or the like. Embryoid bodies or spheroid-like cell clusters can be identified because the expression level of the marker gene is large.
　モデル動物に発生したがんは、蛍光物質、放射活性物質、磁性金属などにより標識されたがんを特異的に認識する物質（例えば抗体、アルブミン）を用い、マイクロプレートリーダー、CCDカメラ、陽電子放出断層撮影(PET)、MRI、単光子放射計算断層撮影（SPECT）などにより検出できる。 Cancer that has developed in a model animal uses a substance that specifically recognizes cancer labeled with a fluorescent substance, radioactive substance, magnetic metal, etc. (eg, antibody, albumin), microplate reader, CCD camera, positron emission It can be detected by tomography (PET), MRI, single photon emission computed tomography (SPECT), etc.
　本発明の１つの好ましい実施形態において、がん幹細胞を、前記がん幹細胞と同一のMHC(主要組織適合遺伝子複合体)を有する非ヒト哺乳動物にがん細胞とともに移植してがん細胞とがん幹細胞を含むがんを保有するがんの非ヒトモデル動物を得ることができる。がん細胞としては、公知の細胞株が広く用いられ、例えば上記の不死化細胞を広く用いることができる。がん幹細胞とともに移植されるがん細胞は、がん幹細胞及び非ヒト哺乳動物と同じMHCを有することが好ましい。このようながん細胞は、がん幹細胞をin vitroでがん細胞に導いてもよく、がん幹細胞を同じMHCを有する非ヒト哺乳動物に移植し、発生したがん組織から分離されたがん細胞を用いてもよい。 In one preferred embodiment of the present invention, cancer cells are transplanted together with cancer cells into a non-human mammal having the same MHC (major histocompatibility complex) as the cancer stem cells. A non-human animal model of cancer that possesses cancer containing cancer cells can be obtained. As cancer cells, known cell lines are widely used. For example, the above-described immortalized cells can be widely used. The cancer cells transplanted together with the cancer stem cells preferably have the same MHC as the cancer stem cells and the non-human mammal. Such cancer cells may be derived from cancerous tissue generated by transplanting cancer stem cells into non-human mammals with the same MHC after cancer stem cells have been introduced into cancer cells in vitro. Cancer cells may be used.
　本発明の他の１つの好ましい実施形態において、ある臓器もしくは組織の性質を有するがん幹細胞を、前記性質の係るがん細胞とともに非ヒト哺乳動物に移植してがん細胞とがん幹細胞を含むがんを保有するがんの非ヒトモデル動物を得ることができる。がん細胞としては、がん幹細胞と同じ臓器もしくは組織の性質を有する公知の細胞株が広く用いられ、例えば上記の不死化細胞を広く用いることができる。 In another preferred embodiment of the present invention, cancer stem cells having the properties of an organ or tissue are transplanted into a non-human mammal together with the cancer cells having the properties described above, and include cancer cells and cancer stem cells. A non-human animal model of cancer that possesses cancer can be obtained. As cancer cells, known cell lines having the same organ or tissue properties as cancer stem cells are widely used. For example, the above-described immortalized cells can be widely used.
　がん細胞ががん幹細胞と同じMHCを有する場合、このようながん細胞は、がん幹細胞をin vitroでがん細胞に導いてもよく、がん幹細胞を同じMHCを有する非ヒト哺乳動物に移植し、発生したがん組織から分離されたがん細胞を用いてもよい。 When a cancer cell has the same MHC as a cancer stem cell, such a cancer cell may guide the cancer stem cell to the cancer cell in vitro, and the non-human mammal having the same MHC as the cancer stem cell Cancer cells that have been transplanted and separated from the generated cancer tissue may be used.
　本発明のモデル動物は、自然発症に近い性質を有し、がん幹細胞(さらにがん細胞を組み合わせてもよい)をモデル動物に移植してがんを発生させて、そのがんを摘出した場合、がんの再発を高い確率で生じるので、このような再発したがんを保有するモデル動物として使用することができる。このような再発したがんを保有するモデル動物は、がんの再発モデルもしくは転移モデルとして使用できる。また、がん摘出後に一定の確率で再発するため、がんを摘出し再発前のモデル動物は、がんの再発を抑制する薬物のスクリーニングに使用することもできる。 The model animal of the present invention has properties close to spontaneous development, and cancer stem cells (which may be further combined with cancer cells) are transplanted into the model animals to generate cancer, and the cancer is removed. In this case, since the recurrence of cancer occurs with high probability, it can be used as a model animal having such a recurring cancer. A model animal having such a recurrent cancer can be used as a cancer recurrence model or a metastasis model. In addition, since the cancer recurs with a certain probability after the cancer is removed, the model animal after the cancer has been removed can be used for screening for drugs that suppress the recurrence of the cancer.
　以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples.
実施例1
１）マウス胚性細胞（mES細胞）から誘導したがん幹細胞
　がん細胞株の培養上清とmES細胞培養用培地を混合して調整した培養液中でmES細胞（B6マウス由来胚性細胞）を4週間以上培養して（マウスB6系統）の腹腔あるいは皮下に移植した。本実施例では、理研バイオリソースセンターから譲渡されたES細胞（B6J-23^(UTR)）を用いた。がん細胞株には、マウスルイス肺癌由来細胞（LLC細胞）あるいはマウスメラノーマ由来細胞(B16細胞)を用い、２種のがん幹細胞株、mES-LLCcmとmES-B16cmを得た。mES-LLCcm培養36日後のES細胞の顕微鏡写真を図１に示す。mES-LLCcmとmES-B16cmは、初期のがん幹細胞であった。 Example 1
1) Cancer stem cells derived from mouse embryonic cells (mES cells) mES cells (B6 mouse-derived embryonic cells) in a culture solution prepared by mixing a culture supernatant of a cancer cell line and a medium for mES cell culture Was cultured for 4 weeks or more (mouse B6 strain) and transplanted into the abdominal cavity or subcutaneously. In this example, ES cells (B6J-23 ^ (UTR)) transferred from RIKEN BioResource Center were used. As the cancer cell lines, mouse Lewis lung cancer-derived cells (LLC cells) or mouse melanoma-derived cells (B16 cells) were used to obtain two cancer stem cell lines, mES-LLCcm and mES-B16cm. A photomicrograph of ES cells after 36 days of mES-LLCcm culture is shown in FIG. mES-LLCcm and mES-B16cm were early cancer stem cells.
　図１に示すように、LLCの培養上清を添加して培養した場合、36日間を通して、胚細胞様の形態を示す細胞が増殖した。この結果から、マウスＥＳ細胞の全てが分化することはなく、幹細胞の性質を保持している細胞が存在することが明らかになった。 As shown in FIG. 1, when the culture supernatant of LLC was added and cultured, cells showing embryonic cell-like morphology proliferated over 36 days. From this result, it became clear that all mouse ES cells do not differentiate and there are cells that retain the properties of stem cells.
　mES細胞のがん幹細胞誘導培養を4週間行った後、マトリゲル上に播種して、VEGFを含む血管への分化誘導培地（EGM-2）で24時間培養すると、図２に示すように、チューブ状の構造体（血管様細胞）を形成した。マウスＥＳ細胞をがん細胞の培養成分とともに培養した細胞は、血管様細胞への分化能を有することが明らかになった。 After 4 weeks of cancer stem cell induction culture of mES cells, seeded on Matrigel and cultured in differentiation induction medium (EGM-2) containing VEGF for 24 hours, as shown in FIG. Shaped structures (blood vessel-like cells) were formed. It was revealed that cells obtained by culturing mouse ES cells with cancer cell culture components have the ability to differentiate into blood vessel-like cells.
　また、がん幹細胞誘導培養後のmES-LLCcmを非接着で、無血清条件下で培養すると図３に示すようにスフェアを形成し、自己増殖能があることが判った。 In addition, when mES-LLCcm after the cancer stem cell induction culture was cultured without being attached and under serum-free conditions, it was found that spheres were formed as shown in FIG.
　図１～図３および図６の結果から、マウスＥＳ細胞をがん細胞の培養上清とともに培養することで、初期の（Early Phase）がん幹細胞が得られたことが明らかになった。 From the results shown in FIGS. 1 to 3 and FIG. 6, it was revealed that early (EarlyarPhase) cancer stem cells were obtained by culturing mouse ES cells together with the culture supernatant of cancer cells.
　がん幹細胞に用いる細胞はマウスES細胞をはじめとする非ヒト哺乳動物由来の胚性細胞であっても、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、間葉系幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞であっても良く、用いる細胞株培養上清はマウス由来、サル由来であっても、癌細胞株であっても、正常不死化細胞であっても良い。 Cells used for cancer stem cells are artificial pluripotent stem cells (iPS cells), mesenchymal stem cells, neural stem cells, and hematopoietic stem cells, even from embryonic cells derived from non-human mammals such as mouse ES cells. The cell line culture supernatant used may be mouse-derived, monkey-derived, cancer cell line, or normal immortalized cell.
　図４に示すように、1×105個のmES-LLCcm細胞をB6マウスの腹腔に移植したところ、約1ヶ月で腫瘍が形成された。腫瘍を摘出して、1) 腫瘍の一部を4%パラフォルムアルデヒドで固定した（切片観察用、図６）。２）同一腫瘍の一部から、プライマリーカルチャーを作製した（図５）。３）また、同一腫瘍の一部を5mm角にして健康なB6マウスの皮下あるいは腹腔に新たに移植した（がん細胞であることを確認）。 As shown in FIG. 4, when 1 × 10 5 mES-LLCcm cells were transplanted into the abdominal cavity of a B6 mouse, a tumor was formed in about one month. The tumor was removed and 1) a part of the tumor was fixed with 4% paraformaldehyde (for section observation, FIG. 6). 2) A primary culture was prepared from a part of the same tumor (FIG. 5). 3) In addition, a part of the same tumor was newly transplanted subcutaneously or abdominally in a healthy B6 mouse with a 5 mm square (confirmed to be cancer cells).
　プライマリーカルチャーをがん幹細胞誘導時と同様の培地で培養すると培養２６日間を通じてES様の細胞が増殖した(図５)。 When the primary culture was cultured in the same medium as when cancer stem cells were induced, ES-like cells proliferated over 26 days of culture (FIG. 5).
　図６に示すように異型分裂像（○）を多見し、悪性奇形腫と診断された。 As shown in FIG. 6, the atypical mitotic image (◯) was frequently seen, and malignant teratoma was diagnosed.
　図７に示すように、形成された腫瘍を5mm角に切断して、健康なB6マウスの皮下に移植した場合も腹腔に移植した場合も腫瘍が形成された。これらの結果はmES-LLCcmであってもB16細胞の培養上清を用いたmES-B16cmであっても同様に観察された。 As shown in FIG. 7, the formed tumor was cut into 5 mm squares, and tumors were formed both when transplanted subcutaneously and into the abdominal cavity of healthy B6 mice. These results were similarly observed for both mES-LLCcm and mES-B16cm using B16 cell culture supernatant.
　様々な臓器・器官の細胞に分化誘導しながらがん幹細胞を作成することで、あらゆるがんのモデルを作製できると考えられる。 It is thought that all cancer models can be created by creating cancer stem cells while inducing differentiation into cells of various organs / organs.
　２）miPS-CSCを用いた臓器別がんモデルの作成
　iPS細胞を既知の方法によって、肝細胞へと分化誘導した。本実施例ではIwamuroら（Cell Transplant. 2010;19(6):841-7）に準じた方法で以下の手順でEB(Embryonic Body)形成、DE(Definitive Endoderm)への誘導、Heps(Hepatocytes)の作成を行った。 2) Preparation of organ-specific cancer model using miPS-CSC iPS cells were induced to differentiate into hepatocytes by a known method. In this example, EB (Embryonic Body) formation, DE (Definitive Endoderm) induction, Heps (Hepatocytes) by the following procedure according to the method according to Iwamuro et al. (Cell Transplant. 2010; 19 (6): 841-7) Made.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　 i)肝細胞への誘導過程でがん細胞株培養上清を添加、あるいはii)がん幹細胞株で誘導後のCSCを用いた培養を行うことによって、後期の（Delay Phase）がん幹細胞を含む肝細胞を作成した。 i) Add cancer cell culture supernatant during induction into hepatocytes, or ii) Incubate with CSC after induction in cancer stem cell lines Hepatocytes containing were made.
　図８で判る通り、CM存在下で細胞はGFP蛍光が減衰しながら分化している様子が観察された。一方、プライマリーカルチャーを肝細胞に分化させた場合には、GFP蛍光は殆ど消失した（図９）。 As can be seen from FIG. 8, it was observed that cells were differentiated while GFP fluorescence was attenuated in the presence of CM. On the other hand, when the primary culture was differentiated into hepatocytes, the GFP fluorescence almost disappeared (FIG. 9).
　がん細胞株の培養上清(CM)を添加せず、通常のmiPSを通常の肝細胞に分化誘導した細胞の発現変化パターンを対照区とし、アルブミン遺伝子(ALB)の相対発現量を比較した。CMを添加した場合もHepsになるとアルブミン遺伝子発現量が対照区と同様に増加した。miPS-PLCcm-p1、miPS-LLCcm-p1を分化誘導した場合も同様にHepsで増加した(図１０)。 Relative expression level of albumin gene (ALB) was compared using the control pattern of the expression change pattern of cells in which normal miPS was differentiated into normal hepatocytes without adding the culture supernatant (CM) of the cancer cell line . Even when CM was added, the albumin gene expression level increased in the same way as in the control group when it became Heps. Similarly, when miPS-PLCcm-p1 and miPS-LLCcm-p1 were induced to differentiate, they increased with Heps (FIG. 10).
　CM非添加の培地と添加した培地でEB、DE、Hepsの順に分化誘導を行い、アルファフェトプロテイン(AFP)の相対的発現量変化のパターンを解析した。いずれもHepsでAFP遺伝子の発現量が上昇した(図11)。 Differentiation induction was performed in the order of EB, DE, and Heps in the medium without CM and the medium with added, and the pattern of relative expression level change of alphafetoprotein (AFP) was analyzed. In all cases, the expression level of the AFP gene increased with Heps (FIG. 11).
　CMを添加した培地でHepsに分化誘導した104個の細胞をSCID beigeマウスの肝臓付近の腸管に移植した。約1ヶ月で肝臓に腫瘍が形成された。腫瘍からプライマリーカルチャーを作製すると、幹細胞様の細胞の増殖が認められた(図12)。これらの結果、肝臓に形成された腫瘍は後期の(delay phase)がん幹細胞を含む肝癌であると考えられた。 10 4 cells were induced to differentiate into Heps in a medium supplemented with CM were transplanted into the intestinal tract in the vicinity of the liver of SCID beige mouse. A tumor formed in the liver in about one month. When primary culture was prepared from the tumor, proliferation of stem cell-like cells was observed (FIG. 12). As a result, it was considered that the tumor formed in the liver was a liver cancer containing delay phase cancer stem cells.
実施例2
　マウス細胞iPS由来のがん幹細胞(miPS-LLCcm)をマウス大腸がん細胞株colon26或いは乳がん細胞株4T1と共培養させた。miPS-LLCcm：colon26＝１：１であり、miPS-LLCcm：4T1＝４：１であった。がん幹細胞(miPS-LLCcm)には、Nanogプロモーターの制御下にGFP遺伝子が組み込まれていた。培養の４，１１，１４，２１，２７，３２及び３５日後にGFPの蛍光を確認した(図13)。図13に示されるように、がん幹細胞は、培養35日後にも存在することが明らかになった。 Example 2
Mouse cell iPS-derived cancer stem cells (miPS-LLCcm) were co-cultured with mouse colon cancer cell line colon26 or breast cancer cell line 4T1. miPS-LLCcm: colon26 = 1: 1 and miPS-LLCcm: 4T1 = 4: 1. In cancer stem cells (miPS-LLCcm), the GFP gene was incorporated under the control of the Nanog promoter. The fluorescence of GFP was confirmed after 4, 11, 14, 21, 27, 32 and 35 days of culture (FIG. 13). As shown in FIG. 13, it was revealed that cancer stem cells exist even after 35 days of culture.
　次に、colon26（150×104）とmiPS-LLCcm（150×104）とを共培養させてSKIDマウス／ヌードマウスに皮下投与して腫瘍を作製し、タイムコースを追って腫瘍を回収すると、20日目まで免疫染色でGFPとNanogが確認され、モデル動物が保有するがんが幹細胞性を有することが確認された（図14、図15）
　また、4T1（150×104）とmiPS-LLCcm（150×104）とを共培養させてSKIDマウス／ヌードマウスに皮下投与して腫瘍を作製し、タイムコースを追って腫瘍を回収すると、13日目まで免疫染色でGFPとNanogが確認され、モデル動物が保有するがんが幹細胞性を有することが確認された（図16、図17）。 Next, colon26 (150 × 10 4 ) and miPS-LLCcm (150 × 10 4 ) were co-cultured and subcutaneously administered to SKID mice / nude mice, and tumors were collected following the time course. GFP and Nanog were confirmed by immunostaining until the 20th day, and it was confirmed that the cancer possessed by the model animals had stem cell properties (FIGS. 14 and 15).
In addition, 4T1 (150 × 10 4 ) and miPS-LLCcm (150 × 10 4 ) were co-cultured and subcutaneously administered to SKID mice / nude mice to produce tumors. Until the day, GFP and Nanog were confirmed by immunostaining, and it was confirmed that the cancer possessed by the model animals had stem cell properties (FIGS. 16 and 17).
　さらに10日目、13日目の腫瘍について抗サイトケラチン抗体の免疫染色を行い、上皮成分もきちんと残存している事を確認した(図18)。 Furthermore, immunohistochemical staining of the anti-cytokeratin antibody was performed on the tumors on the 10th and 13th days, and it was confirmed that the epithelial components remained properly (FIG. 18).
　さらに、colon26細胞株（300×104）を直腸粘膜下にシリンジで注入することにより直腸への同所性移植を行い、大腸がんの同所性移植モデルマウスを作製した。colon26細胞株は本来幹細胞性を有しない腫瘍であるために、腫瘍部にNanog陽性部分は認められなかった(図19)。しかしながら、colon26細胞株（150×104）とmiPS-LLCcm（150×104）を共培養したものを直腸粘膜下にシリンジで注入して大腸がんの同所性移植モデルマウスを作製した場合、腫瘍部にNanog/GFP陽性部分が認められ、幹細胞性を有することが証明された(図20)。 Further, colon 26 cell line (300 × 10 4 ) was injected under the rectal mucosa with a syringe to perform orthotopic transplantation into the rectum to produce an orthotopic transplant mouse model for colorectal cancer. Since the colon26 cell line is originally a tumor that does not have stem cell properties, no Nanog positive part was observed in the tumor part (FIG. 19). However, when a colon26 cell line (150 × 10 4 ) and miPS-LLCcm (150 × 10 4 ) co-cultured are injected into the rectal mucosa with a syringe to produce an orthotopic transplant model mouse for colon cancer In addition, a Nanog / GFP positive part was observed in the tumor part, and it was proved to have stem cell properties (FIG. 20).
実施例３
　多能性幹細胞としてグリーンマウス(B6G)由来のmESとマウスルイス肺癌由来細胞（LLC細胞）を用い、実施例１と同様にしてmES-CSCを製造した。由来が異なる個体の（GFP遺伝子を恒常的に発現する）ES細胞を用いても、がん幹細胞に誘導できることが判った。また、mES-CSCsは遺伝子発現レベルで、未分化性を維持しており、初期のがん幹細胞であることが確認できた(図２１)。 Example 3
MES-CSC was produced in the same manner as in Example 1 using mES derived from green mice (B6G) and mouse Lewis lung cancer-derived cells (LLC cells) as pluripotent stem cells. It was found that cancer stem cells can also be induced using ES cells of different origins (constantly expressing the GFP gene). In addition, mES-CSCs remained undifferentiated at the gene expression level, confirming that they were early cancer stem cells (FIG. 21).
　マウスルイス肺癌由来細胞（LLC細胞）の培養上清とmES細胞培養用培地を混合して調整した培養液中でグリーンマウス(B6G)由来のmES細胞（B6G-LLCcm）を4週間以上培養した。1×105個の細胞をマウス（B6系統）の腹腔あるいは背部皮下に移植した。約1ヶ月で形成された腫瘍を摘出して背部皮下腫瘍の一部から、プライマリーカルチャーを作製した（図２２）。プライマリーカルチャーはES細胞様のコロニーを形成した。このプライマリーカルチャーでGFP蛍光が観察されたことより、形成された腫瘍は移植した細胞（B6G-LLCcm）由来であることが判った。 Green mouse (B6G) -derived mES cells (B6G-LLCcm) were cultured for 4 weeks or more in a culture solution prepared by mixing the culture supernatant of mouse Lewis lung cancer-derived cells (LLC cells) and mES cell culture medium. 1 × 10 5 cells were transplanted into the abdominal cavity or back of the mouse (B6 strain). A tumor formed in about one month was removed, and a primary culture was prepared from a part of the dorsal subcutaneous tumor (FIG. 22). The primary culture formed ES cell-like colonies. From the observation of GFP fluorescence in this primary culture, it was found that the formed tumor was derived from the transplanted cells (B6G-LLCcm).
　B6G-LLCcmをマトリゲル上に播種して、VEGFを含む血管への分化誘導培地（EGM-2）で24時間培養すると、図２３aに示すように、チューブ状の構造体（血管様細胞）を形成した。このマウスＥＳ細胞をがん細胞の培養成分とともに培養した細胞は、血管様細胞への分化能を有することが明らかになった。 When B6G-LLCcm is seeded on Matrigel and cultured in a differentiation-inducing medium (EGM-2) for VEGF-containing blood vessels for 24 hours, as shown in FIG. 23a, a tubular structure (blood vessel-like cells) is formed. did. It was revealed that cells obtained by culturing mouse ES cells together with cancer cell culture components have the ability to differentiate into blood vessel-like cells.
　がん幹細胞誘導培養後のB6G-LLCcmを非接着で、無血清条件下で培養すると図２３に示すようにスフェアを形成し、自己増殖能があることが判った。 When B6G-LLCcm after cancer stem cell induction culture was cultured in a non-adherent and serum-free condition, spheres were formed as shown in FIG.
　mES細胞をLLC細胞の培養上清とmES細胞培養用培地を混合して調整した培養液中で培養を継続して、38日後および130日後の細胞、また、図５に示したプライマリーカルチャーの細胞におけるNanog遺伝子, Oct3/4遺伝子およびSox2遺伝子を未分化マーカーとして、その発現量を幹細胞維持培養したmES細胞に対して比較したところ、いずれも発現が認められた。また、B16細胞の培養上清とmES細胞培養用培地を混合して調整した培養液中で培養を継続して、７２日後および１２０日後の細胞とmES-LLCcmと同様に作製したプライマリーカルチャーでも同様に遺伝子発現量を比較したところ発現が認められた（図２４）。さらにB6G細胞をLLC細胞の培養上清とmES細胞培養用培地を混合して調整した培養液中で10日後、20日後および30日後の未分化マーカー遺伝子の発現量を同様に調べると、培養期間を通して発現が認められた。 Culture of mES cells was continued in a culture medium prepared by mixing LLC cell culture supernatant and mES cell culture medium, cells after 38 and 130 days, and cells of the primary culture shown in FIG. Using the Nanog gene, the Oct3 / 4 gene and the Sox2 gene in the mouse as undifferentiated markers, their expression levels were compared to mES cells cultured with stem cells, and all of them were expressed. In addition, the culture was continued in a culture solution prepared by mixing the culture supernatant of B16 cells and mES cell culture medium, and the same was true for primary cultures prepared in the same manner as cells and mES-LLCcm after 72 and 120 days. When gene expression levels were compared, expression was observed (FIG. 24). Further, when the expression level of the undifferentiated marker gene after 10 days, 20 days, and 30 days in the culture medium prepared by mixing B6G cells with the culture supernatant of LLC cells and mES cell culture medium, Expression was observed throughout.
　PLC/PRF/5の培養上清とmiPS細胞用の培地を混合した培地でmiPS細胞を4週間培養した104個の細胞を免疫不全マウスの肝臓に移植した。約1ヶ月で形成された肝臓の腫瘍を摘出して切片を作製し、HE染色を行って観察すると悪性の奇形種であることが判った(図２５)。 10 4 cells cultured 4 weeks miPS cells in a medium by mixing the medium for the culture supernatant of the PLC / PRF / 5 and miPS cells were transplanted into the liver of immunodeficient mice. When the liver tumor formed in about one month was removed, a section was prepared and observed by HE staining, and it was found to be a malignant malformation (FIG. 25).

Claims (22)

  1. ある臓器もしくは組織の特性を有するがん幹細胞を非ヒト哺乳動物に移植して、前記臓器もしくは組織のがんを作製してなる、がんの非ヒトモデル動物。 A non-human animal model for cancer, wherein cancer stem cells having characteristics of a certain organ or tissue are transplanted into a non-human mammal to produce cancer of the organ or tissue.
  2. 前記非ヒト哺乳動物が免疫不全の非ヒト哺乳動物であり、前記がん幹細胞を前記臓器もしくは組織のがん細胞とともに非ヒト哺乳動物に移植して、がん幹細胞を保有する前記臓器もしくは組織のがんを作製してなる、請求項１に記載のがんの非ヒトモデル動物。 The non-human mammal is an immunodeficient non-human mammal, and the cancer stem cell is transplanted into the non-human mammal together with the cancer cell of the organ or tissue, and the organ or tissue having the cancer stem cell is transplanted. The non-human animal model for cancer according to claim 1, wherein the animal is produced from cancer.
  3. 前記がん細胞がヒト由来のがん細胞である、請求項２に記載のがんの非ヒトモデル動物。 The non-human animal model of cancer according to claim 2, wherein the cancer cell is a human-derived cancer cell.
  4. 前記がん幹細胞移植して作製したがんを摘出し、がんを再発させてなる、請求項１に記載のがんの非ヒトモデル動物。 The non-human animal model for cancer according to claim 1, wherein the cancer produced by transplanting the cancer stem cells is removed and the cancer is relapsed.
  5. 前記がん幹細胞とがん細胞を移植して作製したがんを摘出し、がんを再発させてなる、請求項２に記載のがんの非ヒトモデル動物。 The non-human animal model for cancer according to claim 2, wherein the cancer prepared by transplanting the cancer stem cells and cancer cells is removed and the cancer is relapsed.
  6. 前記非ヒト哺乳動物とがん幹細胞のMHC(主要組織適合遺伝子複合体)が同一である、請求項１に記載のがんの非ヒトモデル動物。 The non-human model animal for cancer according to claim 1, wherein the non-human mammal and the cancer stem cell have the same MHC (major histocompatibility complex).
  7. 前記がん幹細胞がES細胞から誘導されたものであり、ES細胞とモデル動物のMHCが同一である、請求項６に記載のがんの非ヒトモデル動物。 The non-human animal model for cancer according to claim 6, wherein the cancer stem cell is derived from an ES cell, and the MHC of the ES cell and the model animal is the same.
  8. 前記臓器もしくは組織が、肝臓、腎臓、肺、胃、大腸、膵臓、胆嚢、卵巣、子宮、前立腺、乳房、甲状腺、血液、リンパ液、骨髄、膀胱、副腎、脳/脊髄からなる群から選ばれる、請求項１～７のいずれか１項に記載のがんの非ヒトモデル動物。 The organ or tissue is selected from the group consisting of liver, kidney, lung, stomach, large intestine, pancreas, gallbladder, ovary, uterus, prostate, breast, thyroid, blood, lymph, bone marrow, bladder, adrenal gland, brain / spinal cord, The non-human model animal for cancer according to any one of claims 1 to 7.
  9. 多能性幹細胞をある臓器もしくは組織の細胞に分化誘導するプロセスにおいて不死化細胞の培地に含まれる培養成分を含む培地を使用して特定の臓器もしくは組織の性質を有するがん幹細胞を作製する工程、前記がん幹細胞を非ヒト哺乳動物に移植して、前記がん幹細胞と同じ特定の臓器もしくは組織にがんを作製する工程を含む、がんの非ヒトモデル動物の作製方法。 A process of producing cancer stem cells having specific organ or tissue properties using a medium containing culture components contained in an immortalized cell medium in the process of inducing differentiation of pluripotent stem cells into cells of an organ or tissue A method for producing a non-human animal model of cancer, comprising a step of transplanting the cancer stem cell to a non-human mammal and producing cancer in the same specific organ or tissue as the cancer stem cell.
  10. 多能性幹細胞をがん細胞と共培養して特定の臓器もしくは組織の性質を有するがん幹細胞を作製する工程、前記がん幹細胞と前記がん細胞を非ヒト哺乳動物に移植して、前記がん幹細胞の特性と同じ臓器もしくは組織にがんを作製する工程を含む、がんの非ヒトモデル動物の作製方法。 A step of co-culturing pluripotent stem cells with cancer cells to produce cancer stem cells having specific organ or tissue properties, transplanting the cancer stem cells and the cancer cells to a non-human mammal, A method for producing a non-human animal model of cancer, comprising a step of producing cancer in the same organ or tissue as the characteristics of cancer stem cells.
  11. 初期のがん幹細胞を、前記がん幹細胞と同一のMHC(主要組織適合遺伝子複合体)を有する非ヒト哺乳動物に移植してがんを作製してなり、初期のがん幹細胞が臓器もしくは組織の特性を有しないがん幹細胞である、がんの非ヒトモデル動物。 An early cancer stem cell is transplanted to a non-human mammal having the same MHC (major histocompatibility complex) as the cancer stem cell to produce cancer, and the initial cancer stem cell is an organ or tissue A non-human animal model of cancer, which is a cancer stem cell that does not have the above characteristics.
  12. がん幹細胞が、ES細胞或いはiPS細胞に由来する、請求項１１に記載のがんの非ヒトモデル動物。 The non-human animal model of cancer according to claim 11, wherein the cancer stem cells are derived from ES cells or iPS cells.
  13. 前記がん幹細胞を同一のMHCを有するがん細胞とともに同一のMHCを有する非ヒト哺乳動物に移植してがん幹細胞を保有するがんを作製してなる、請求項１１又は１２に記載のがんの非ヒトモデル動物。 The cancer stem cell is transplanted to a non-human mammal having the same MHC together with a cancer cell having the same MHC to produce a cancer having cancer stem cells. Non-human animal model.
  14. 非ヒトモデル動物の体内のがんに含まれる前記がん幹細胞が特定の臓器もしくは組織の性質を有し、その臓器もしくは組織のがんを保有する、請求項１１～１３のいずれか１項に記載のがんの非ヒトモデル動物。 The cancer stem cell contained in cancer in the body of a non-human model animal has a property of a specific organ or tissue and possesses cancer of the organ or tissue according to any one of claims 11 to 13. The described non-human animal model of cancer.
  15. 前記臓器もしくは組織が、肝臓、腎臓、肺、胃、大腸、膵臓、胆嚢、卵巣、子宮、前立腺、乳房、甲状腺、血液、リンパ液、骨髄、膀胱、副腎、脳/脊髄からなる群から選ばれる、請求項１１～１４のいずれか１項に記載のがんの非ヒトモデル動物。 The organ or tissue is selected from the group consisting of liver, kidney, lung, stomach, large intestine, pancreas, gallbladder, ovary, uterus, prostate, breast, thyroid, blood, lymph, bone marrow, bladder, adrenal gland, brain / spinal cord, The non-human animal model for cancer according to any one of claims 11 to 14.
  16. がん幹細胞を、前記がん幹細胞と同一のMHC(主要組織適合遺伝子複合体)を有する非ヒト哺乳動物に移植してがんを作製した後にがんを摘出し、がんを再発させてなる、請求項１１～１５のいずれか１項に記載のがんの非ヒトモデル動物。 A cancer stem cell is transplanted to a non-human mammal having the same MHC (major histocompatibility complex) as that of the cancer stem cell to produce the cancer, and then the cancer is removed and the cancer is relapsed. The non-human animal model for cancer according to any one of claims 11 to 15.
  17. がん幹細胞と同じMHCを有する非ヒト哺乳動物に前記がん幹細胞を移植してがんを作製する工程を含む、がんの非ヒトモデル動物の作製方法。 A method for producing a non-human model animal of cancer, comprising a step of producing a cancer by transplanting the cancer stem cell to a non-human mammal having the same MHC as the cancer stem cell.
  18. がん幹細胞と同じMHCを有する非ヒト哺乳動物に前記がん幹細胞とがん細胞を移植してがんを作製する工程を含む、請求項１７に記載のがんの非ヒトモデル動物の作製方法。 The method for producing a non-human animal model for cancer according to claim 17, comprising a step of producing a cancer by transplanting the cancer stem cell and the cancer cell to a non-human mammal having the same MHC as the cancer stem cell. .
  19. さらにがんを摘出してがんを再発させる工程を含む、請求項１７又は１８に記載のがんの非ヒトモデル動物の作製方法。 The method for producing a non-human animal model of cancer according to claim 17 or 18, further comprising a step of removing the cancer and causing the cancer to recur.
  20. ある臓器もしくは組織の特性を有し、多能性幹細胞に由来するがん幹細胞。 Cancer stem cells derived from pluripotent stem cells that have the characteristics of a certain organ or tissue.
  21. 多能性幹細胞を不死化細胞の培地に含まれる培養成分を含む分化誘導培地で培養して、前記培地で誘導される臓器もしくは組織の特性を有するがん幹細胞を得る工程を含む、臓器もしくは組織の特性を有するがん幹細胞の製造方法。 An organ or tissue comprising a step of culturing a pluripotent stem cell in a differentiation-inducing medium containing a culture component contained in an immortalized cell medium to obtain cancer stem cells having organ or tissue characteristics induced in the medium. Of producing cancer stem cells having the following characteristics:
  22. 多能性幹細胞をがん細胞と共培養して前記がん細胞と同じ臓器もしくは組織の特性を有するがん幹細胞を得る工程を含む、臓器もしくは組織の特性を有するがん幹細胞の製造方法。 A method for producing cancer stem cells having organ or tissue characteristics, comprising a step of co-culturing pluripotent stem cells with cancer cells to obtain cancer stem cells having the same organ or tissue characteristics as the cancer cells.
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